Parasitol Latinoam 57: 40 - 45, 2002
FLAP
ARTÍCULO ORIGINAL
Heterogeneidad clonal en epimastigotos de una cepa
centroamericana de Trypanosoma cruzi
(Kinetoplastida: Trypanosomatidae)
OLGER CALDERÓN-ARGUEDAS1, ADRIANA TROYO1, IDALIA VALERIO2 y MISAEL CHINCHILLA1,2
CLONAL HETEROGENEITY OF A CENTRAL AMERICAN STRAIN OF Trypanosoma
cruzi (KINETOPLASTIDA: TRYPANOSOMATIDAE)
The clonal heterogeneity properties of a Central American (San Salvador) strain of T. cruzi
was evaluated using a macrophage culture system. Four clones named Clon 9, Clon 10, Clon 11
and Clon 12 were obtained by culture in a semisolid agar medium from the wild T. cruzi strain.
Each clone and the parental strain were sub-cultured in Schneider medium with 10% fetal bovine
serum before the infection process. The macrophages were cultured on cover slides and infected
with epimastigotes of each clone and the parental strain. The infection rate of the cells showed
significant statistical differences (p < 0.05), but the parasite burden of the infected cells in each
system was similar. The kinetics of the parasite multiplication had a growing pattern that was
much higher at 96 hrs after infection in one of the clones (p < 0.05). The results prove that the
interactions between parasite forms and target cells can differ in clones and the parental strain,
and that the intracellular growing properties of T. cruzi in the individual clones can be different.
Key words: Trypanosoma cruzi, Trypanosomatidae, Chagas disease, Macrophages,
Epimastigotes.
INTRODUCCIÓN rentes regiones donde ésta es prevalente1,2. De
igual forma, el análisis de ADN ha podido
Trypanosoma cruzi, el agente causal de la revelar la existencia de schizodemes, que al
enfermedad de Chagas es un parásito altamen- igual que los zymodemes se pueden asociar
te variable. Mediante técnicas de electroforesis con comportamientos biológicos particulares
de isoenzimas, se han podido identificar varios de los parásitos3. En un estudio, mediante el
zymodemes con características biológicas y estudio de las características biológicas como
patológicas particulares que le dan un carácter la virulencia, la evolución de la parasitemia, el
propio a la enfermedad de Chagas en las dife- histotropismo y las formas celulares predomi-
1 Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales (CIET). Facultad de Microbiología. Universidad de Costa Rica.
2 Laboratorio de Investigación. Universidad de Ciencias Médicas «Dr. Andrés Vesalio Guzmán». San José, Costa Rica.
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Heterogeneidad clonal de cepa centroamericana de Trypanosoma cruzi - O. Calderón et al.
nantes, se pudo diferenciar hasta tres grandes básico de cultivo de macrófagos que ha sido
grupos de cepas de T. cruzi denominados publicado con anterioridad9,10, con algunas va-
biodemes4. riaciones. Brevemente, el exudado peritoneal
La heterogeneidad ha sido observada a ni- de todos los animales fue obtenido lavando la
vel de cepas o aislamientos y algunos trabajos cavidad con MEM suplementado con SFB al
han abierto la posibilidad de considerar un 10%, 100 UI/ml de penicilina y 100 µg/ml de
comportamiento diferenciado entre los clones estreptomicina (MEM-SFB). Los macrófagos
constitutivos con respecto a su cepa parental5, 6. se mezclaron para preparar un concentrado y
Dado que el comportamiento de un parásito posteriormente fueron contados en cámara de
depende en gran medida de la respuesta fisio- Neubauer para ajustar su concentración a 3 x
lógica e inmunológica del hospedador, se deci- 105 células/ml; 1 x 105 células contenidas en
dió analizar el fenómeno de heterogeneidad en 0,3 ml de esta suspensión fueron sembradas
un modelo celular, donde el único reto para el directamente sobre cubreobjetos de 22 x 22
parásito lo constituyen las defensas propias de mm, los cuales fueron incubados por 24 horas
la célula hospedadora, independientemente de a 37ºC en una atmósfera con CO2 al 5%.
otros mecanismos de protección del hospe- b.-Infección de las células. Luego de la
dador. incubación, los macrófagos fueron lavados con
MEM-SFB e infectados con epimastigotos de
MATERIAL Y MÉTODOS T. cruzi de cada uno de los clones en estudio,
en una relación de 3 células por parásito (3 x
Se utilizó una cepa de T. cruzi aislada en 105 epimastigotos/ml) en un volumen final de
San Salvador (El Salvador) a partir de un vector 0,1 ml por cubreobjeto. Luego de 24 h de
infectado de la especie Triatoma dimidiata infección, los cubreobjetos se lavaron con
(Hemiptera: Reduviidae). Este aislamiento se MEM-SFB y se les agregó 300 µl de MEM-
denominó arbitrariamente Cepa Salvador, la SFB. Luego de incubarlos bajo las mismas
cual es mantenida por medio de pasajes men- condiciones mencionadas con anterioridad, se
suales en el medio difásico de Rugai. estudiaron muestras a las 24, 48, 72 y 96 h
Para la obtención de los clones se utilizó un posteriores a la infección. Luego de cada uno
sistema de cultivo en medio semisólido de agar de estos períodos, los cubreobjetos fueron fija-
de acuerdo con una metodología descrita pre- dos en alcohol metílico y teñidos con colorante
viamente7. Luego de 5 semanas de incubación, de Giemsa para su posterior observación al
se obtuvieron colonias de T. cruzi, a partir de microscopio de luz. Los recuentos y su análisis
las cuales se realizaron cultivos en medio fueron hechos según métodos descritos con
Schneider8 suplementado con suero fetal bovi- anterioridad9,10,11. Para cada uno de los clones
no (SFB) al 10% y antibióticos (penicilina 100 así como para la cepa parental se determinó el
UI/mL, estreptomicina, 100 µg/mL). Se pudie- porcentaje de macrófagos infectados así como
ron obtener cuatro clones que se denominaron el número de parásitos por cada 100 células
arbitrariamente Clon 9, Clon 10, Clon 11 y infectadas. Además se calculó la tasa de multi-
Clon 12. plicación la cual se obtuvo dividiendo el núme-
La cepa en su forma parental también fue ro de parásitos intracelulares después de 96
cultivada en medio Schneider en las mismas horas de incubación entre el número de parási-
condiciones, previo a su utilización en el expe- tos después de 24 horas de incubación. Cada
rimento. ensayo se realizó por cuadruplicado.
a.- Obtención y preparación de los macró- c.- Análisis estadístico. La evaluación del por-
fagos. Se obtuvieron macrófagos a partir de centaje de las células infectadas con cada uno
ratones NGP (25–30 g) proporcionados por el de los clones así como con la cepa parental fue
Laboratorio de Ensayos Biológicos de la Uni- realizada mediante un análisis de variancia
versidad de Costa Rica, criados con alimento (ANDEVA)12, utilizando un coeficiente de
concentrado local y agua “ad libitum”. Para la confiabilidad del 95% (α:0.05). Posteriormen-
preparación de las células, se siguió el método te se realizó una prueba de diferencias verda-
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Heterogeneidad clonal de cepa centroamericana de Trypanosoma cruzi - O. Calderón et al.
deramente significativas (DVS)12 con un ni- ferente a los otros sistemas (p < 0,05).
vel de significancia del 95% (α: 0,05). Las La cinética de multiplicación parasitaria tuvo
comparaciones de los niveles de formas parasi- un comportamiento moderadamente creciente
tarias intracelulares a las 24 y a las 96 horas a lo largo del experimento, tanto en los clones
fueron realizadas por el mismo procedimiento como en la cepa parental. Cabe destacar que
citado anteriormente, utilizando una confiabi- para las 96 horas post infección, el Clon 12
lidad del 95% (α: 0,05). mostró niveles de multiplicación significa-
tivamente mayores a los otros sistemas en estu-
RESULTADOS dio (Figura3). Estas diferencias fueron estadís-
ticamente significativas tanto en el ANDEVA
Luego de la confrontación de los parásitos como en las pruebas de DVS con respecto a los
con las células blanco, se pudo observar que la otros sistemas evaluados. La tasa de multipli-
eficiencia del proceso fagocítico, reflejado en cación (Tabla 1) fue significativamente mayor
el porcentaje de macrófagos infectados con en este clon en comparación con los otros sis-
cada uno de los clones y la cepa parental, temas en estudio (p < 0,05).
mostró diferencias estadísticamente significa-
tivas (Figura 1). DISCUSIÓN
A pesar de esto, la captación de parásitos
por parte de las células que experimentaron el La heterogeneidad de T. cruzi ha sido un
fenómeno de fagocitosis, mostró niveles de tópico de investigación desde hace varias dé-
infección relativamente homogéneas (Figura cadas. A pesar de que los primeros estudios en
2). Si bien es cierto el análisis de variancia este campo se dedicaron al análisis y compara-
(ANDEVA) mostró diferencias significativas ción de cepas, diversas investigaciones han pos-
en este aspecto, las pruebas de DVS no identi- tulado la ocurrencia del fenómeno a nivel
ficaron a algún clon o cepa parental que pre- clonal5,6. Dado que los datos obtenidos en di-
sentara un comportamiento particularmente di- versas investigaciones muestran conclusiones
12
10
8
6
4
2
0
Cepa Salvador Clon 9 Clon 10 Clon 11 Clon 12
Clones
Figura 1. Porcentajes promedio de macrófagos infectados luego de 24 horas de exposición a los epimastigotos.
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Porcentaje de células infectadas
Heterogeneidad clonal de cepa centroamericana de Trypanosoma cruzi - O. Calderón et al.
250
200
150
100
50
0
Cepa Salvador Clon 9 Clon 10 Clon 11 Clon 12
Clones
Figura 2. Promedios de formas parasitarias intracelulares por cada 100 macrófagos infectados.
9 0 0
8 0 0
C e p a
S a lv a d o r
7 0 0
C lo n  9
6 0 0
C lo n  1 0
5 0 0
4 0 0 C lo n  1 1
3 0 0 C lo n  1 2
2 0 0
1 0 0
0
2 4  h o r a s 4 8  h o r a s 7 2  h o r a s 9 6  h o r a s
H o r a s  p o s t  in f e c c ió n
Figura 3. Promedio de formas intracelulares de T. cruzi por cada 100 macrófagos infectados.
* El comportamiento del clon 12 fue significativamente diferente en el análisis de variancia (ANDEVA)12 y las pruebas
de DVS12.
diferentes6,13, se decidió estudiar las caracterís- Las diferencias observadas en los porcenta-
ticas de varios clones así como de su cepa jes de macrófagos infectados, ya sea con cada
parental en un sistema de cultivo en macrófagos clon así como con la cepa evaluada (Figura 1)
peritoneales de ratón, en el cual se utilizaron reflejaron un comportamiento no homogéneo
epimastigotos como formas infectantes. en cada sistema. Esto podría estar condiciona-
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T. cruzi /100 macrófagos
Número de parásitos/100 células
Heterogeneidad clonal de cepa centroamericana de Trypanosoma cruzi - O. Calderón et al.
Tabla 1. Tasas de multiplicación promedio observadas al final del período de observación
 (96 horas post infección)
Cepa/Clones Tasa de multiplicación Desviación Estándar
Cepa Salvador 1,39    0,046
Clon 9 2,29 0,33
Clon 10 1,56 0,15
Clon 11 2,21 1,10
Clon 12* 4,59 0,87
* La tasa de multiplicación observada en el Clon 12 mostró diferencias estadísticamente significativas con respecto a los
otros sistemas(α:0.05)
do por los diferentes procesos de interacción predominio de clones con altas eficiencias
parásito-célula o la capacidad endocítica de las multiplicativas podría tener implicaciones en
células blanco. Considerando que los macró- las características de virulencia de las cepas.
fagos utilizados procedían de una mezcla de En un estudio de 2 clones de la cepa hSLU239
células homogéneas, se hubiera esperado que y 4 clones de la cepa mSLU142 se encontrò
este último aspecto no fuera una fuente de diferencias en la cinética multiplicativa de és-
variación en el experimento. tos en un sistema de cultivo en medio LIT18. En
La interacción parásito-macrófago ha sido otro estudio se observó que el comportamiento
relacionada con los niveles de glicosilación biológico de estos clones tenía diferencias con
que muestran las membranas parasitarias, don- respecto a su cepa parental19, donde salvo uno
de los residuos de manosa parecen ser funda- de los clones evaluados denominado h1, proce-
mentales en los procesos de reconocimiento e dente de la cepa hSLU239, todos los demás
internalización14, por lo que los resultados ob- mostraron parasitemias más altas que las cepas
tenidos podrían sugerir que la eficiencia en los de origen.
procesos de glicosilación no es la misma en En un trabajo se analizaron varios clones
cada clon, lo que de alguna manera podría obtenidos de una cepa colombiana pertene-
condicionar las diferencias en los porcentajes ciente al biodeme 320. En este estudio se encon-
de infección observados. tró que los clones denominados C1, C3, C4 y
Otras interacciones como las mediadas  por el C6 mostraron altos niveles de parasitemia,
epitopo Ssp-315 o la proteína 60 kDa (penetrina)16 mientras que los clones C2, C5 y C7 mostraban
las cuales interactúan con la fibronectina de los bajas parasitemias a pesar de tener el mismo
macrófagos17, han sido descritas, pero no debe- origen. También se pudo apreciar que los clones
rían ser consideradas por ser proteínas única- evaluados tenían heterogeneidad en sus carac-
mente expresadas por los tripomastigotos. Llama terísticas de virulencia, aunque los patrones
la atención que aunque los porcentajes de infec- biológicos generales como por ejemplo el histo-
ción fueron diferentes, las cargas parasitarias den- tropismo, mostraban características similares.
tro de las células infectadas fueron comparables Los resultados obtenidos en el presente es-
(Figura 2), lo que reafirma la idea de la paridad tudio permiten apoyar las hipótesis relativas a
en cuanto al potencial fagocítico de las células la multiclonalidad5,6, donde la presencia de clo-
blanco utilizadas. nes dominantes podrían condicionar el com-
La observación de la cinética multiplicativa portamiento de las cepas circulantes.
intracelular permitió determinar, al final del Queda pendiente determinar si existen fac-
período de observación, la replicación exacer- tores selectivos a nivel de hospedador verte-
bada del clon 12 (Figura 3), lo que demuestra brado y hospedador invertebrado que condi-
un comportamiento diferente entre la cepa sil- cionen la dominancia de ciertos grupos de
vestre con respecto a los clones evaluados. El clones.
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Heterogeneidad clonal de cepa centroamericana de Trypanosoma cruzi - O. Calderón et al.
RESUMEN  9.- CHINCHILLA M, FRENKEL J K. Mediation of
immunity to intracellular infection (Toxoplasma and
El fenómeno de heterogeneidad clonal fue Besnoitia) with somatic cells. Infec Immmun 1978;19: 999-1012.
evaluado en una cepa centroamericana de 10.- REYES L, FRENKEL J K. Specific and nonspecific
Trypanosoma cruzi (San Salvador) en un siste- mediation of protective immunity to Toxoplasma
ma de cultivo en macrófagos. Cuatro clones gondii. Infec Immun 1987; 55: 856-63.
denominados Clon 9, Clon 10, Clon 11 y Clon 11.- REYES L, CHINCHILLA M. Growth inhibition of
12 fueron obtenidos mediante cultivo en un T. cruzi in cultured murine myocardial cells mediatedby a specifically induced lymphokine. Infec Immun
medio semisólido de agar. Cada clon y la cepa 1987; 55: 1513-516.
parental, fueron subcultivados en medio Sch- 12.- DANIEL W. Análisis de variancia. En: Bioestadística.
neider suplementado con suero fetal bovino Base para el análisis de las ciencias de la salud.
(SFB) al 10% antes del proceso de infección. Editorial Limusa, México. 1988. 667 pp.
Los macrófagos se cultivaron en cubreobjetos 13.- PENIN P, GAMALLO C, DE DIEGO J A. Biologicalcomparison between three clones of T. cruzi and the
y fueron infectados con formas de epimas- strain of origin (Bolivia) with reference to clonal
tigotos. evolution studies. Mem Inst Oswaldo Cruz 1996;
La tasa de infección de las células mostró 91: 285-91.
diferencias estadísticamente significativas (p < 14.- VILLALTA F, KIERSZENBAUM F. Role of cell
0,05), pero la carga parasitaria de las células surface mannose residues in host cell invasion by T.cruzi. Bioch Biophy Acta 1983; 736: 39-44.
infectadas fue similar para cada uno de los 15.- SCHENKMAN S, JIANG MS, HART G W,
sistemas. La cinética de multiplicación mostró NUSSENZWEIG V. A novel cell surface trans-
un patrón creciente que fue bastante elevado a sialidase of T. cruzi generates a stage-specific epitope
las 96 horas en uno de los clones (p < 0,05). required for invasion of mammalian cells. Cell 1991;
Los resultados prueban que las interacciones 65: 1117-25.16.- ORTEGA-BARRIA E, PEREIRA M E. A novel T.
entre las formas parasitarias y las células blan- cruzi heparin-binding protein promotes fibroblast
co pueden diferir entre los clones y la cepa adhesion and penetration of engineered bacteria and
parental y que las propiedades de multiplica- trypanosomes into mammalian cells. Cell 1991; 67:
ción intracelular pueden ser diferentes entre 411-21.
los clones individuales 17.- OUAISSI A. Molecular aspects of  T. cruzi interactionwith host cell and parasite differentiation mechanisms.
Ann Soc Bel Med Trop 1992; 72: 23-5.
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cruzi. Trans R Soc Trop Med Hyg 1983; 77: 79-83. pathogenicity associated with diversity of T. cruzi
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zymodemes of T. cruzi strains: correlations with biological, isoenzymic and histopathological analysis
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Bras Med Trop 1997; 30: 27-35. 2001; 34: 151-7.
 5.- TIBAYRENC M, AYALA F J. T. cruzi populations:
more clonal than sexual. Paras Today 1987; 3: 189- Agradecimientos:  Los autores desean expresar su agra-
90. decimiento al Dr. Rafael Oswaldo Angel Belloso del
 6.- DVORAK J. Single cell insolates of T. cruzi. How Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina ,
and why. Rev Soc Bras Med Trop 1985; 18: 29-38. Universidad de El Salvador por el suministro de la cepa
 7.- TANURI P, F de ALMEIDA D. T. cruzi: Isolation of de T. cruzi, al UNDP/World Bank/WHO Special Progra-
cloned strains and characterization of their infectivity. mme for Research & Training in Tropical Disease (TDR)
J Parasitol 1985; 71: 397-40. por el soporte al proyecto 980413 y a la Vicerrectoría de
 8.- SIGMA©. Cell culture reagents. Schneider‘s insect Investigación de la Universidad de Costa Rica por el
medium. Catalog No S 9895. 1992. apoyo económico a través del proyecto 803-97-251.
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