Characterization of a Bacillus thuringiensis strain collection isolated from diverse Costa Rican natural ecosystems

Abstract

Como los ecosistemas naturales de Costa Rica figuran entre los más diversos del mundo, se propuso aislar la bacteria entomopatógena Bacillus thuringiensis (Bt) con el fin de conformar una colección de cepas y caracterizarlas molecularmente. Se obtuvieron 146 cepas a partir de muestras ambientales de diversas áreas protegidas, que incluían 9 de las 12 zonas de vida de Costa Rica. Se recobraron cepas del 71%, 63%, 61% y 54% de las muestras de suelo, hojas frescas, otros sustratos y hojarasca respectivamente. Se aisló Bt del 65% de las muestras del bosque tropical húmedo, un 59% de las muestras del bosque tropical seco. Del bosque tropical muy húmedo se aisló Bt del 75% de las muestras y finalmente del bosque tropical muy húmedo transición perhúmedo se encontró en el 69% de las muestras. Las cepas se caracterizaron según la morfología de los cuerpos paraesporales de inclusión, el peso molecular de las δ-endotoxinas y de genes cry, cyt y vip que contenían. Las cepas exhibieron cristales de diferente morfología, tamaño y número: irregulares, ovales, bipiramidales, cúbicos o mezclas de uno u otro. No se encontró correlación al comparar la forma de los cristales con el sitio de origen de la cepa. El análisis proteico de las mezclas de esporas y cristales mostró que las cepas contenían δ-endotoxinas de 20 a 160 kDa. El 66 por ciento de las cepas amplificaron con los imprimadores específicos para el gen cry2, 54% con vip3, 20% con el cry1, 9% con el cry3-cry7 y 8% con el gen cry8. Los genes cry11 y cyt se encontraron en el 8% y 7% de las cepas respectivamente. Veinticuato cepas no amplificaron con los imprimadores utilizados por lo que podrían contener genes novedosos. Las cepas que contenían el gen cry1 se amplificaron posteriormente con imprimadores específicos para la subfamilia de dicho gen, obteniéndose 13 perfiles diferentes. En síntesis, la diversidad genética de las cepas sugiere que la colección tiene un gran potencial para el control de diferentes especies de insectos de importancia económica en la agricultura y en salud pública. El análisis toxicológico de las cepas mediante bioensayos con insectos plaga proveerá información muy útil acerca del uso potencial de estas cepas para la formulación de bioinsecticida. Asimismo, lo genes cry y vip podrían utilizarse para, mediante ingeniería genética, conferir resistencia a los cultivos.

Costa Rican natural ecosystems are among the most diverse in the world. For this reason, we isolated strains of the entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) to determine their diversity, distribution and abundance. A total of 146 Bt strains were obtained from environmental samples collected from diverse natural ecosystems and life zones of Costa Rica. We recovered Bt strains from 71%, 63%, 61% and 54% of soil samples, fresh leaves, other substrates and leaf litter respectively. Bt was isolated in 65% of the samples collected in the humid tropical forest in national parks (Braulio Carrillo, Gandoca Manzanillo, Sierpe, Hitoy Cerere, and Cahuita), and in 59% of the samples collected in the dry tropical forest (Parque Nacional Marino las Baulas, Palo Verde and Santa Rosa). In the very humid tropical forest (Tortuguero) Bt was isolated in 75% of the samples and in the very humid tropical forest transition perhumid (Carara) it was found in 69% of the samples. The strains exhibit a diverse number, size and morphology of parasporal inclusion bodies: irregular (47%), oval (20%), bipyramidal (3%), bipyramidal and cubic (1%), bipyramidal, oval and irregular (5%) and bipyramidal, oval and cubic crystals (2%). Strains isolated from Braulio Carrillo, Tortuguero and Cahuita, presented predominantly irregular crystals. On the other hand, more than 60% of the isolates from Térraba-Sierpe and Hitoy-Cerere had medium oval crystals. Strains from Gandoca-Manzanillo, Palo Verde and Carara presented mainly combinations of oval and irregular crystals. Nevertheless, the greatest diversity in crystal morphology was observed in those from Santa Rosa, Llanos del Río Medio Queso and Parque Marino las Baulas. Protein analyses of the crystalspore preparations showed δ-endotoxin with diverse electrophoretic patterns, with molecular weights in the range of 20 to 160 kDa. Fifty six percent of the strains amplified with the cry2 primer, 54% with vip3, 20% with cry1, 9% with cry3-cry7 and 8% with cry8. The cry11 and cyt genes were found in 8% and 7% of the strains, respectively. When analyzed with specific primers for the cry1 subfamily, 13 different genetic profiles were obtained. In addition, twenty-four strains did not amplify with any of the primers used, suggesting they contain novel cry genes. The diversity of Bt genes found in this collection indicates it could have great potential for the control of different species of insect pests. The toxicological characterization of the strains by bioassays against important insect pests will provide useful information about their potential use for the formulation of biological insecticides and their respective cry and vip genes for the transformation of crops to confer resistance to insects. Rev. Biol. Trop. 54(1): 13-27. Epub 2006 Mar 31.