Caracterización de la interacción con el ADN y de las propiedades proinflamatorias de nanopartículas de hidroxiapatitas modificadas

Abstract

La hidroxiapatita (Hap) es un ortofosfato de calcio que constituye el principal componente mineral de los mamíferos y se encuentra presente en huesos, dientes, piel y tendones. Este compuesto ha sido utilizado ampliamente en la elaboración de prótesis e implantes ortopédicos, debido a que presenta propiedades como biocompatibilidad, bioresortividad, osteoconductividad, afinidad por biomoléculas y baja toxicidad, entre otras. Estas características le han conferido gran interés en su aplicación como vector génico, pues ha mostrado afinidad por proteínas de interés farmacológico y por el ADN de doble hebra y de hebra simple. En la actualidad se comercian reactivos de transfección celular de fosfato de calcio basados en la precipitación “ in situ” de los mismos, lo cual lleva a partículas de tamaño y morfología variable, que dificultan la repetibilidad de los resultados. El presente trabajo propone la evaluación de seis tipos de hidroxiapatita como posibles vectores de transfección, los cuales han sido sintetizados bajo un método de electrólisis que permite controlar la homogeneidad de la composición, morfología y tamaño de las nanopartículas. Dentro de los materiales se encuentran hidroxiapatitas no funcionalizadas con diferencias en su composición y funcionalizadas superficialmente con anhídrido succínico, succinimida o dihidrógenofosfato de 2-aminoetilo. La biocompatibilidad de cada material fue determinada de manera cualitativa, mediante bioensayos de MTT con el linaje celular Raw 264.7, añadiendo diferentes cantidades conocidas de los material y utlizando espectrofotometría UV. De manera similar, se utilizaron bioensayos basados en la prueba de Griess para determinar la producción de óxido nítrico a diferentes cantidades del material, para identificar la presencia de actividades proinflamatorias. También, se determinaron sus propiedades fisicoquímicas tales como la afinidad y capacidad de adsorción del ADN mediante isotermas de adsorción de Langmuir, el tamaño de partícula en suspensión y su potencial . Por útlimo, se determinó la eficiencia de los materiales al ser utilizados como vectores de transfección celular, desarrollando ensayos que incluyeron técnicas como microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. De esta manera se determinó que los materiales no presentan una citotoxicidad significativa a las concentraciones utilizadas y que la viabilidad celular tiende a ser menor en presencia de las hidroxiapatitas funcionalizadas con succinato y anhídrido succínico, además, la prueba de Griess demostró que ninguno de los materiales presenta actividades proinflamatorias en las concentraciones estudiadas. Todos los materiales muestran valores de potencial  negativos en la suspensión de cloruro de sodio y se muestra que las funcionalizaciones superficiales tienden a disminuir este potencial. Además, no todos los materiales muestran un buen ajuste al modelo de Langmuir, lo cual puede estar relacionado con la baja reproducibilidad del método debido a la variabilidad del tamaño de partícula o o la existencia de eventos como la formación de capas múltiples de ADN o que se den diferentes tipos de interacciones entre el ADN y el material, debido a la heterogeneidad de la superficie del material. Cabe destacar que Hap-amino es el material que menos se ajusta al model de Langmuir, en todo el rango de temperatura estudiado, mientras que la funcionalización con anhídrido succínico, muestra una tendencia de aumentar la capacidad de adsorción del material no funcionalizado, en todo el rango de temperatura de estudio y además, es la hidroxiapatita que presenta las mayores capacidades de adsorción máxima, entre la colección de materiales, siendo así el material con mejores resultados. Los valores negativos de energía libre de Gibbs muestran que el proceso de adsorción para todos los materiales y temperaturas, es estable y viable, siendo Hap-amino el material con menor viabilidad del proceso de adsorción.