UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO PREVALENCIA, DISTRIBUCIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LOS VIRUS DE LAS ENCEFALITIS EQUINAS DEL ESTE, OESTE Y VENEZOLANA EN COSTA RICA Tesis sometida a la consideración de la comisión del Programa de Doctorado en Ciencias para optar al grado y título de Doctorado Académico en Ciencias BERNAL LEÓN RODRÍGUEZ Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2023 ii DEDICATORIA Dedico esta tesis a Rogelio León León, mi papá quien solo me mostró amor, protección y cariño, a Guiselle, Esteban y Nati, que son todo para mí, a mi madrina Erlinda Salas Montero quien me trajo al mundo y se convirtió en mi ángel de la guarda. A Lizeth Taylor por ser un espejo de virtudes y a Kirsten Visoná por su apoyo y cariño, a todos los maestros y profesores que me guiaron y mostraron el camino, y a aquellos amigos incondicionales con los que me premió la vida. iii AGRADECIMIENTOS A mi tutor el Dr. Carlos Jiménez por confiar en mí y darme la oportunidad de formar parte de este proyecto. A mis lectoras y asesoras las doctoras Mónica Retamosa y Lisbeth Ramírez por su guía durante este proceso. A la Dra. Marietta Ureña quien sin conocerme me abrió las puertas para laborar en el Servicio Nacional de Salud Animal, y al Dr. Yayo Vicente por darme la oportunidad de trabajar en el SENASA, a ambos quienes me confiaron la tarea de crear lo que es hoy el laboratorio de Bioseguridad del LANASEVE. Finalmente, a mis compañeros del laboratorio, quienes a lo largo de los años me dieron su cariño, colaboración y apoyo tanto en el plano personal como profesional. v REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS PUBLICACIONES León B, Käsbohrer A, Hutter SE, Baldi M, Firth CL, Romero JJ, Jiménez C. National seroprevalence and risk factors for Eastern equine encephalitis and Venezuelan equine encephalitis in Costa Rica., Journal of Equine Veterinary Science 2020. https://doi.org/10.1016/j.jevs.2020.103140. Factor de impacto: 1.386 León B, Jiménez-Sánchez C, Retamosa-Izaguirre M. An Environmental Niche Model to Estimate the Potential Presence of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in Costa Rica., Int J Environ Res Public Health. 2020;18 (1):227. Dec 30. 2020. https://doi:10.3390/ijerph18010227. Factor de impacto: 4.614 Bernal León, Gabriel González, Alessandro Nicoli, Alicia Rojas, Antonella Di Pizio,Lisbeth Ramirez-Carvajal, and Carlos Jimenez. Phylogenetic and Mutation Analysis of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Sequence Isolated in Costa Rica from a Mare with Encephalitis. Vet. Sci. 2022, 9, 258. https://doi.org/10.3390/vetsci9060258. Factor de impacto: 2.518 Bernal León, Carlos Jiménez, Rocío González, Lisbeth Ramirez-Carvajal. First Complete Coding Sequence of a Venezuelan Equine Encephalitis Virus Strain Isolated from an Equine Encephalitis Case in Costa Rica. Microbiol Resour Announc September 2019. 8:e00672-19. https://doi.org/10.1128/MRA.00672-19. B León, J Estrella-Morales and C Jiménez. Detection of Venezuelan Equine Encephalitis Virus from Brain Samples of Equines with Encephalitis. Zoonotic Dis. 2023, 3, 215–225. https://doi.org/10.3390/zoonoticdis3030018 Bernal León, Mafalda Viana, Sabine E. Hutter, Ana I. Ruiz4, Mario Baldi, Annemarie Käsbohrer, Clair L. Firth, and Carlos Jiménez. Zoonotic alphaviruses in Costa Rica: long- term IgM serosurveillance in horses from 2009 to 2019. Zoonoses and Public Health. 2023. https://doi.org/10.1016/j.jevs.2020.103140 https://doi:10.3390/ijerph18010227 https://doi.org/10.3390/vetsci9060258 https://doi.org/10.1128/MRA.00672-19 https://doi.org/10.3390/zoonoticdis3030018 vi TABLA DE CONTENIDO REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS PUBLICACIONES ................................................... v TABLA DE CONTENIDO ................................................................................................... vi RESUMEN ......................................................................................................................... viii ABSTRACT ........................................................................................................................... ix LISTA DE TABLAS ........................................................................................................... x LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ xi LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................ xii LISTA DE ANEXOS ........................................................................................................ xiii CAPÍTULO I. ....................................................................................................................... 14 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 14 Generalidades .................................................................................................................... 14 Presentación clínica de las infecciones causadas por las encefalitis equinas .................... 15 Las encefalitis equinas y su impacto en Costa Rica .......................................................... 16 JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................. 20 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................... 22 CAPÍTULO II ....................................................................................................................... 24 Aporte de las pruebas serológicas al estudio de las encefalitis equinas causadas por Alfavirus. ........................................................................................................................... 24 Seroprevalencia nacional y factores de riesgo de los virus de la Encefalitis Equina del Este y del virus de la Encefalitis Equina Venezolana en Costa Rica, (ANEXO II). ........ 24 Resumen ............................................................................................................................ 24 Zoonotic alphaviruses in Costa Rica: long-term IgM serosurveillance in horses from 2009 to 2019, (ANEXO III). ...................................................................................................... 25 CAPÍTULO III ...................................................................................................................... 26 vii Aporte de las pruebas moleculares al estudio de las encefalitis equinas causadas por Alfavirus. ........................................................................................................................... 26 Resumen ............................................................................................................................ 26 First Complete Coding Sequence of a Venezuelan Equine Encephalitis Virus Strain Isolated from an Equine Encephalitis Case in Costa Rica, (ANEXO V). ......................... 27 Resumen ............................................................................................................................ 27 Phylogenetic and Mutation Analysis of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Sequence Isolated in Costa Rica from a Mare with Encephalitis, (ANEXO VI). ............. 28 Resumen ............................................................................................................................ 28 Un modelo de nicho ambiental para estimar la presencia potencial del virus de la encefalitis equina venezolana en Costa Rica, (ANEXO VII). ............................................................... 29 Resumen ................................................................................................................................ 29 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................................... 30 CONCLUSIONES ................................................................................................................ 48 REFERENCIAS .................................................................................................................... 50 ANEXOS .............................................................................................................................. 61 viii RESUMEN Los virus de las encefalitis equinas del Este (EEEV), Oeste (WEEV) y Venezolana (VEEV) pertenecen al género Alfavirus, familia Togaviridae, son agentes zoonóticos, que ocasionan infecciones importantes desde Norte América, Centro América, las islas del Caribe y Sudamérica (Aguilar et al., 2011; Figueiredo, 2007; Strauss & Strauss, 1994). En Costa Rica producen brotes periódicos en diferentes regiones del país. Estos brotes afectan principalmente a equinos y esporádicamente a seres humanos Este estudio se centró en los dos Alfavirus que mostraron estar presentes en el país, el EEEV y el VEEV. En la primera parte del proyecto se confirmó la presencia, prevalencia y distribución geográfica de estos virus, así como la frecuencia con que se presentan los casos o brotes y posibles patrones de estacionalidad y factores de riesgo asociados a estas infecciones, basados en dos estudios serológicos uno de tipo transversal y otro longitudinal. Ambos estudios se llevaron a cabo a partir de ELISAs para la detección de IgG, IgM y pruebas de neutralización viral. En la segunda parte del proyecto realizó un análisis filogenético, para conocer las relaciones evolutivas entre los diferentes subtipos del complejo I del VEEV, se estableció el origen y el tiempo de los ancestros comunes más recientes (TMRCA), además de identificar posibles mutaciones asociadas con la patogénesis del VEEV. Para ello se compararon pruebas de RT-PCR universales descritas previamente para seleccionar el mejor RT-PCR en términos de sensibilidad y especificidad, se implementaron métodos de secuenciación de Sanger y de nueva generación, y se utilizaron programas bioinformáticos y bases de datos. Finalmente, en la tercera etapa del estudio se generó un modelo de nicho usando el programa MaxEnt que permitió identificar áreas geográficas dónde pueden ocurrir nuevos brotes del VEEV a partir de datos de presencia de VEEV establecidos en este estudio. ix ABSTRACT The Eastern (EEEV), Western (WEEV), and Venezuelan (VEEV) equine encephalitis viruses belong to the genus Alphavirus, family Togaviridae, these are zoonotic agents that cause significant infections in North America, Central America, the Caribbean islands, and South America (Aguilar et al., 2011; Figueiredo, 2007; Strauss & Strauss, 1994). In Costa Rica, they produce periodic outbreaks in different regions of the country. These outbreaks mainly affect horses and sporadically humans. This study focused on the two Alphaviruses that were shown to be present in the country, EEEV, and VEEV. The first part of the project confirmed the presence, prevalence, and geographical distribution of these viruses, as well as the frequency of cases or outbreaks and possible seasonality patterns and risk factors associated with these infections, based on two serological studies, one cross- sectional and the other longitudinal. Both studies were carried out using ELISAs for the detection of IgG, IgM, and viral neutralization tests. In the second part of the project, a phylogenetic analysis was performed to determine the evolutionary relationships between the different subtypes of VEEV complex I, to establish the origin and the time of the most recent common ancestors (TMRCA), and to identify possible mutations associated with the pathogenesis of VEEV. For this purpose, previously described universal RT-PCR tests were compared to select the best RT-PCR in terms of sensitivity and specificity, Sanger and next-generation sequencing methods were implemented, and bioinformatics programs and databases were used. Finally, in the third stage of the study, a niche model was generated using the MaxEnt program that allowed the identification of geographic areas where new VEEV outbreaks may occur from VEEV presence data established in this study. x LISTA DE TABLAS Tabla 1. Protocolo de Retrotranscripción para PCR de dos pasos ........................................ 61 Tabla 10. Sánchez RT-PCR un paso ................................................................................... 66 Tabla 11. Sánchez PCR anidado .......................................................................................... 66 Tabla 12. Protocolo Torii RT-PCR un paso ......................................................................... 67 Tabla 2. PCR de Grywna ..................................................................................................... 62 Tabla 3. PCR anidado de Grywna. ....................................................................................... 62 Tabla 4. PCR Pfeffer. ............................................................................................................ 63 Tabla 5. PCR anidado de Pfeffer. ......................................................................................... 63 Tabla 6. PCR Sánchez. ........................................................................................................ 64 Tabla 7. PCR anidado de Sánchez. ....................................................................................... 64 Tabla 8. Pfeffer RT-PCR un paso. ....................................................................................... 65 Tabla 9. Pfeffer PCR anidado .............................................................................................. 65 Tabla 10. Sánchez RT-PCR un paso ................................................................................... 66 Tabla 11. Sánchez PCR anidado .......................................................................................... 66 Tabla 12. Protocolo Torii RT-PCR un paso ......................................................................... 67 xi LISTA DE FIGURAS Figura 1. Flujo de ensayos para seleccionar el mejor RT-PCR para realizar el diagnóstico de Alfavirus. .......................................................................................................................... 41 Figura 2. Tinción histológica de hematoxilina y eosina (H&E) de los ganglios basales de la yegua infectada con VEEV con encefalitis. .......................................................................... 43 Figura 3. El mapa de salida de MaxEnt. ............................................................................... 48 xii LISTA DE ABREVIATURAS AIC Criterio de información de Akaike CI intervalo de confianza CNS sistema nervioso central DMEM medio esencial mínimo de Dulbecco EEEV virus de la encefalitis equina del este ELISA ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas ENOS/ENSO El Niño Oscilación del Sur HPD densidad posterior más alta ICTV Comité Internacional de Taxonomía de Virus IgG inmunoglubulina G IgM inmunoglubulina M IMN Instituto Meteorológico Nacional de Costa Rica LSE Laboratorio de Bioseguridad LANASEVE Laboratorio nacional de servicios veterinarios MADV virus de Madariaga m.a.s.l/ msnm metros sobre el nivel del mar NOAA Administración Nacional Oceánica y Atmosférica OD densidad de absorbancia PBST solución de fosfato salinos buferados con tween PRNT prueba de neutralización y reducción de placa ROC/AUC característica operativa de recepción/área bajo la curva PFU/mL unidades formadoras de placas por mililitro VEEV virus encefalitis equina venezolana WEEV virus de la encefalitis equina del oeste xiii LISTA DE ANEXOS ANEXO I .............................................................................................................................. 61 ANEXO II ............................................................................................................................. 68 ANEXO III ........................................................................................................................... 76 ANEXO IV ........................................................................................................................... 99 ANEXO V ........................................................................................................................... 111 ANEXO VI ......................................................................................................................... 115 ANEXO VII ........................................................................................................................ 129 14 CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN Generalidades Los virus que se transmiten por artrópodos son conocidos como Arbovirus (Go et al., 2014; Pfeffer & Dobler, 2010). Dentro de los arbovirus zoonóticos destaca la familia Togaviridae (Figueiredo, 2007) por su capacidad para producir epizootias (Go et al., 2014; Hunt et al., 2010; Tsetsarkin et al., 2007). La familia Togaviridae está conformada por dos géneros, Rubivirus (que incluye el virus de la Rubéola, el cual afecta exclusivamente a humanos) y Alfavirus con 31 especies aprobadas de las cuales 30 causan enfermedades en diversas especies de vertebrados, recientemente un nuevo alfavirus fue descrito Tai Forest alfavirus (Hermanns et al., 2017). Los virus del género Alfavirus están distribuidos mundialmente dentro de los cuales destacan especies zoonóticas importantes en América, tales como los virus de las Encefalitis Equinas del Este (EEEV), Oeste (WEEV) y Venezolana (VEEV). EEEV se registró por primera vez en Masachussetts, Estados Unidos en 1831 y se distribuye a lo largo de la costa este de América (MacLachlan & Dubovi, 2011), desde entonces se han definido cuatro linajes (I, IIA, IIB, III y IV). El linaje I es el más virulento y se distribuye en Norteamérica, Jamaica y Cuba. Los restantes linajes se encuentran localizados en Centroamérica, algunas islas del Caribe y Sudamérica, mientras que el IV se ha descrito solo en Brasil (Arrigo et al., 2010). A partir del 2012, el Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV), denominó a los linajes sudamericanos II, III y IV con el nombre de Madariaga (MADV), debido a su diversidad en comparación con el linaje I, estableciéndolos como una especie diferente (Arrigo et al., 2010; Vittor et al., 2016). El complejo WEE, fue aislado por primera vez en 1931 del cerebro de un equino en el Valle de San Joaquín en California, se distribuye desde Canadá hasta Argentina (MacLachlan & Dubovi, 2011). WEEV está conformado por el virus Highlands J (HJV), Fort Morgan virus (FMV), Buggy Creek, todos descritos en Norte América y el virus Aura descubierto en Sudamérica, mientras que el virus Sindbis permanece en el viejo continente (Weaver et al., 1997). 15 Por su parte, en 1936 se documentó el primer brote causado por el virus VEEV en Venezuela (MacLachlan & Dubovi, 2011). EL cual se distribuye en todo el continente americano. El complejo VEEV ha sido clasificado en 6 subtipos antigénicos, nombrados del I al VI. De estos, los subtipos I, se ha clasificado en 5 variables antigénicas, (IAB a IF) y el subtipo III, en las variables antigénicas (IIIA, IIIB y IIIC) respectivamente. Debido a los resultados generados mediante el uso masivo de la secuenciación, el subtipo IF ha sido reclasificado como una nueva especie denominado Mosso das Pedras virus (Forrester et al., 2017). Los subtipos de VEEV se distribuyen desde los Everglades (Chamberlain et al., 1964), Colorado, (USA) (Monath et al., 1980), pasando por México hasta Centro y Sudamérica (Sneider et al., 2019a). Presentación clínica de las infecciones causadas por las encefalitis equinas La sintomatología que se observa en equinos infectados con EEEV varía desde desorientación, ceguera unilateral o bilateral, anorexia, movimientos involuntarios de la cabeza y o labios, fotofobia, somnolencia, hasta postración, presentando una tasa de letalidad variable que puede ir de un 50 % a un 70 % e incluso alcanzar un 90%, en el caso del linaje I ( A C. Brault et al., 1999; MacLachlan & Dubovi, 2011; Zacks & Paessler, 2010). Las tasas de letalidad en los equinos infectados por WEEV varían entre un 20% y un 40% y los síntomas son indistinguibles a los descritos para EEEV aunque estos pueden ser menos severos (Morgante et al., 1968). Se creía que este virus se había extinguido ya que no se había detectado en criaderos de mosquitos desde el año 2008, ni tampoco se han detectado brotes en equinos causados por este virus recientemente, de hecho el último caso de WEEV reportado en humanos fue en el 2009 en Uruguay, en un joven de 14 años (Delfraro et al., 2011), se cree que esta disminución no se debe a una pérdida en la virulencia del virus (Bergren et al., 2014; Forrester et al., 2008), sino, a otras posibles causas como cambios en las prácticas de irrigación, vacunación contra otros Alfavirus del mismo género y al éxito de las campañas de control de los mosquitos en los Estados Unidos (Zacks & Paessler, 2010). No obstante y a pesar de esto, 41 brotes fueron reportados en marzo del 2019 en la costa pacífica de México afectando a un 27% de los equinos expuestos (106/390) con una tasa de letalidad del 13% (Delgadillo-Alvarez, 2019). 16 En equinos, el virus VEEV puede provocar cuadros epizoóticos que afectan de un 50 a un 80% de los animales expuestos, los cuales presentan manifestaciones neurológicas leves en comparación con EEEV o WEE. En términos generales los síntomas son subclínicos o podrían presentarse síntomas tales como fiebre, anorexia, depresión y, dependiendo del subtipo, puede desencadenar una enfermedad sistémica progresiva que conlleva a la muerte del animal, por ejemplo los subtipos IAB e IC son altamente patogénicos y tienden a producir epizootias en equinos y cuadros epidémicos en humanos (Aguilar et al., 2011; Rivas et al., 1997). Las tasas de letalidad en equinos con estos subtipos van de un 20% a un 80% (Ni et al., 2007; Zacks & Paessler, 2010), mientras que los subtipos ID e IE, han sido considerados enzoóticos y de baja virulencia (Aguilar et al., 2011). Las encefalitis equinas y su impacto en Costa Rica En Costa Rica, uno de los primeros registros de brotes en equinos con síntomas compatibles con encefalitis fueron causados por VEEV (subtipo IAB) en 1970, en la provincia de Guanacaste (Martin et al., 1972). En ese brote se registraron 300 caballos muertos lo que correspondía a un 12% de los animales afectados. El brote también afectó a seres humanos, un total de 13 de 109 personas pasaron de ser negativas a tener anticuerpos contra VEEV y 6 de estas 13 personas presentaron fiebre y astenia (Martin et al., 1972). Durante este brote, el primer caso en humanos se registró 2 semanas después de la muerte del primer equino (Martin et al., 1972). Previamente, el subtipo observado en Costa Rica había sido el IE, el cual mostró ser inofensivo en equinos, razón por la cual antes del brote de 1970 no se observaban casos clínicos de animales con encefalitis (Martin et al., 1972). Antes del brote de VEEV subtipo IAB en 1970, el subtipo IE se mantenía de manera enzoótica en esta región del país. En marzo de 1971, 250 caballos fueron sangrados en diferentes localidades del cantón de San Carlos, provincia de Alajuela, estos sueros fueron analizados por las pruebas de inhibición de la hemaglutinación (IHA) y microneutralización (NT) contra seis especies de alfavirus: Una virus y Mayaro que forman parte del complejo Semliki Forest, Aura virus y WEEV que forman parte del complejo WEEV, los virus EEEV Cepa Panamá 58 linaje III que pertenece al complejo MADV y VEEV Mena II que forma parte del subtipo IE. De las 250 muestras, 142 dieron positivo a la prueba de IHA lo que representa un 58.6%, 53 17 sueros, 21%, dieron positivo únicamente a VEEV y 18 muestras, 7%, dieron positivo solo a EEEV, hubo reacciones contra los otros virus que fueron consideradas heterólogas a VEEV y EEEV; de los animales sangrados 20 habían sido vacunados: dos contra VEEV y 18 a EEEV de los cuales 6 presentaron anticuerpos contra EEEV (Fuentes, 1973). Un resultado interesante de este estudio es que los dos animales vacunados con la cepa TC83 del subtipo IAB, dieron negativo al virus Mena II subtipo IE, al ser sangrados seis meses después de ser vacunados (Fuentes, 1973), lo anterior indica que estos animales no sero-convirtieron o que estos subtipos podrían no estar presentando reacciones cruzadas entre ellos. Estudios serológicos realizados en equinos en la península de Nicoya durante los años 2010-2011, para la detección de IgG por medio de ELISAS revelaron una seroprevalencia para EEEV, WEEV, VEEV de 13% (46 animales), 8% (29 animales) y 32,5% (117 animales) respectivamente (Mora Castillo et al., 2011). Sin embargo, las muestras positivas podrían ser el producto de reacciones cruzadas contra otros Alfavirus (Aguilar et al., 2007) ya que estos resultados no fueron confirmados por una PRNT. Entre 2009 y 2014 se produjeron 141 brotes neurológicos en caballos y se analizaron un total de 201 muestras de suero mediante ELISA de captura de IgM, lo que dio como resultado el diagnóstico de 4 casos de EEEV, 79 casos de VEEV. La mayoría de los casos positivos se ubicaron en la región noroeste de Costa Rica, en las tierras bajas, en las provincias de Guanacaste, Alajuela y Puntarenas. Además, todos los casos positivos ocurrieron durante la temporada de lluvias (de mayo a enero). La mayoría de los casos positivos fueron caballos no vacunados (Jiménez et al., 2016). Datos proporcionados por el Área de Patología del Laboratorio de Bioseguridad (LSE), que pertenece al Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios (LANASEVE), SENASA, Costa Rica, indican que en el período comprendido entre 2011 y 2013, se recibieron un total de 854 muestras de encéfalos bovinos que se consideraron adecuadas para el diagnóstico histopatológico (González-Barrientos et al., 2014). De estos, 20% (168 cerebros) mostraron algún grado de compromiso del sistema nervioso central a nivel histológico y se reporta, la encefalitis viral como hallazgo patológico más frecuente en 91 muestras. De estos 19 casos fueron causados por el virus de la rabia y en 72 de las 91 muestras, todavía no sido posible establecer un diagnóstico etiológico (González- 18 Barrientos et al., 2014) estos datos ratifican la necesidad de mejorar y ampliar las pruebas diagnósticas con el propósito de llegar a diagnósticos conclusivos en estos casos de animales con síntomas nerviosos. Por otra parte, en América Latina se estima que el 10% de los casos presuntivos de Dengue en humanos pueden ser causados por VEEV (Aguilar et al., 2011). De acuerdo con datos preliminares del Ministerio de Salud, en el 2014 se presentaron 9430 casos de dengue en nuestro país, en el año 2015 hubo un incremento a 14886 casos, para el 2016 la cantidad de casos fue de 13366 y en el 2017 el número de casos disminuyó a 1723, es importante señalar que el diagnóstico de dengue se basa en la mayoría de los casos en datos clínicos de enfermedad febril aguda y nexo epidemiológico (Dirección Vigilancia de la Salud, 2017), lo cual permite suponer que algunos de estos cuadros de enfermedad febril aguda podrían atribuirse a los virus de las encefalitis equinas. Los datos presentados justifican la necesidad de profundizar en el estudio epidemiológico de las encefalitis equinas en el país y resaltan la relevancia que estos resultados podrían tener en el área de salud animal y la salud pública, bajo el lema de una salud. Basados en la información de los brotes de encefalitis equinas ocurridos en equinos en los últimos años es posible que tengamos una sub-notificación de estos casos (Burgueño et al., 2013; Purdy et al., 2004), debido a que una vez que los médicos veterinarios reciben un resultado positivo por parte del laboratorio, dejan de informar sobre nuevos casos ocurridos en el área, basados en la clínica y epidemiología de nuevos casos adyacentes al caso índice, y dejan de enviar muestras al laboratorio, por lo que se cree que la cantidad de animales afectados en Costa Rica sea mayor a la reportada a los laboratorio de referencia (Laboratorio de Virología de la EMV o del SENASA). A pesar de que existen varios estudios serológicos realizados en el país, ninguno se ha realizado a nivel nacional y pocos contaron con pruebas de confirmación basadas en neutralización viral. Además, son escasos los estudios orientados a conocer la diversidad genética de estos virus. Antes de que se realizara esta tesis, no existía información de cuáles subtipos están circulando o cuáles están causando los brotes en el país y si hay mutaciones en las secuencias de estos virus que puedan estar provocando casos de encefalitis letales en el país. 19 Para poder obtener los resultados obtenidos en esta tesis se implementaron herramientas diagnósticas para estimar la prevalencia y distribución real de los virus EEEV, WEEV y VEEV en el país. También, se usaron técnicas moleculares para establecer si las encefalitis observadas en muestras de tejido de bovinos y equinos son causadas por estos virus. Adicionalmente, se utilizó el método de secuenciación tipo Sanger y de nueva generación (NGS) para establecer cuáles son los subtipos implicados en estas lesiones, las relaciones filogenéticas entre los grupos estudiados y proponer mutaciones que pudieran estar ligadas a un aumento en la severidad de los casos detectados. La parte experimental de esta tesis se dividió en tres fases, en la primera, descrita en el capítulo II se describe la seroprevalencia de los virus VEEV y EEEV por determinación de anticuerpos IgG, así como su distribución geográfica, para ello ser realizó un muestreo de sueros de equinos durante el 2013, en el cual se dividió el país en dos regiones, tierras altas más de 900 msnm y tierras bajas 900 o menos msnm. Además, a partir de un estudio de vigilancia pasiva en el que se determinó la presencia de anticuerpos IgM en equinos con sintomatología nerviosa, que se llevó a cabo por 11 años entre el 2009 y el 2019, se demostró que el VEEV produjo casos clínicos todos los años, que iban desde leves hasta severos, por otra parte la presencia de casos de EEEV fue intermitente, mientras que no se mostró evidencia de que WEEV estuviera circulando en el país. Estos resultados se presentan en dos artículos, National Seroprevalence and Risk Factors for Eastern Equine Encephalitis and Venezuelan Equine Encephalitis in Costa Rica. Y en Zoonotic alphaviruses in Costa Rica: long-term IgM serosurveillance in horses from 2009 to 2019, en este último artículo se reportan los casos de encefalitis equina Venezolana y se describen casos en seres humanos. En el Capítulo III, se refiere a la parte II, en la que hace la comparación de cuatro RT-PCR universales publicados para detectar alfavirus, finalmente el RT-PCR que demostró una mayor sensibilidad y especificidad se utilizó para procesar muestras de cerebros de animales con sintomatología nerviosa que fueron negativos para rabia y enfermedad espongiforme bovina, además se publica la primera secuencia de VEEV del genoma aislada en el país, la cual fue obtenida a partir de una muestra de tejido nervioso de una yegua con sintomatología nerviosa usando secuenciación masiva. Finalmente, se detalla un estudio filogenético usando métodos bayesianos y reloj molecular para establecer el tiempo del 20 ancestro común más reciente de esta secuencia, así como al subtipo de VEEV al que pertenece, su proceso evolutivo basado en su relación genética con otras secuencias reportadas en bases de datos, y cuál podría ser su posible origen. Se discute, la presencia de mutaciones y su posible efecto en la patogénesis de este subtipo viral el cual es considerado enzoótico en el país. Esta información está incluída en tres artículos, Detection of Venezuelan Equine Encephalitis Virus from Brain Samples of Equines with Encephalitis, First complete coding sequence of Venezuelan Equine Encephalitis Virus isolated from an equine encephalitis case in Costa Rica y en Evolutionary History of Venezuelan Equine Encephalitis virus Subtype I. En el Capítulo IV, se presentan los resultados del estudio en el que se realizó un modelo de nicho para estimar que áreas geográficas de nuestro país cuentan con condiciones ideales para que se presenten nuevos casos de encefalitis equinas, a raíz de la ausencia de casos de WEEV y de la baja prevalencia de EEEV, el estudio se basó en la presencia de casos de VEEV. Con esta información y considerando solo los datos de presencia, se utilizó el programa MaxEnt para establecer los posibles sitios donde se podrían generar futuros casos o brotes de VEEV a partir de las condiciones climatológicas y de elevación en donde se detectaron casos positivos a este virus. Los resultados de este capítulo se describen en el artículo, Un modelo de nicho ambiental para estimar la presencia potencial del virus de la encefalitis equina venezolana en Costa Rica. JUSTIFICACIÓN Los estudios serológicos son herramientas muy importantes para determinar la distribución y prevalencia de las enfermedades y así poder establecer, basado en datos de circulación viral previa o activa, donde podrían darse posibles brotes en animales, lo que ayudaría para diseñar nuevos estudios dirigidos a establecer medidas de manejo para el control y prevención de esas enfermedades. Sin embargo, debido a la cercanía antigénica y genética de los Alfavirus, el uso de la prueba de la seroneutralización en placa PRNT para la confirmación de las pruebas de ELISA para la detección de anticuerpos IgG es fundamental y su validación en este proyecto tendrá un impacto sumamente importante como herramienta de diagnóstico a nivel de salud pública. Por otra parte, la estandarización y 21 validación de una prueba de diagnóstico basada en PCR para identificar varios de estos agentes en un mismo protocolo ahorraría tiempo y recursos, al identificar los agentes virales involucrados en un brote causado por estos virus. Este proyecto establecería nuevas herramientas de diagnóstico que se usarán en el SENASA como diagnóstico diferencial de encefalitis, lo que será de una enorme utilidad para el productor, así como para las autoridades encargadas de la salud pública de este país. Hasta la fecha en Costa Rica se han realizado muy pocos esfuerzos para determinar cuáles son los subtipos y Alfavirus causantes de las encefalitis equinas, por lo que es importante realizar muestreos en la Región Chorotega, y en otros sitios en los que se han presentado estos brotes para conocer que variantes son las que están circulando en el país, tanto durante la época seca, como durante la estación lluviosa, generando información valiosa del ciclo epidemiológico de estos virus. Este estudio podría ser el punto de partida para establecer un programa de vigilancia de estas enfermedades como parte de la política institucional, y que eventualmente en un futuro estudio se podría promover un programa de captura y clasificación de artrópodos, en el que se determine no solo, de qué animales se están alimentando estos vectores sino también qué animales podrían estar infectando y que podrían ser vectores o reservorios de estos virus. Así como, un estudio que permita establecer qué virus se están replicando y transmitiendo en estos vectores, con el objetivo de poder conocer la ecología de estos virus y establecer un mejor control y prevención de estas enfermedades (Oshaghi et al., 2006), siguiendo las políticas del OMSA bajo el lema “un mundo, una salud” lo cual podría tener un impacto sin precedentes en la salud pública de nuestro país. A nivel internacional este proyecto permitirá compartir con la comunidad científica genomas completos o parciales de estos virus que actualmente no existen a nivel de Centroamérica salvo en Panamá, lo que permitiría conocer aspectos importantes de la filogeografía de la región, así como patrones evolutivos, análisis de mutaciones y predicción de variación en sitios antigénicos. 22 OBJETIVO GENERAL Estudiar la prevalencia, distribución y la historia evolutiva de los virus de las encefalitis equinas del Este, Oeste y Venezolana (EEEV, WEEV y VEEV), implementando herramientas diagnósticas que permitan esclarecer el origen de estas infecciones, los subtipos circulantes, así como predecir nuevos brotes lo cual podría permitir a las autoridades bajo un esquema de una salud, implementar medidas con el fin de disminuir la incidencia de estos virus en los animales domésticos y por ende en el ser humano. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Determinar la prevalencia, y distribución geográfica de los virus EEEV, WEEV y VEEV a partir de estudios serológicos usando un ELISA IgG y la prueba de seroneutralización en reducción de placa (PRNT) como prueba confirmatoria para discriminar la ocurrencia de reacciones cruzadas. 2. Establecer por medio de un estudio de vigilancia pasiva, los patrones, y por ende los niveles con que circulan estos virus por un periodo de 11 años entre 2009 y el 2019, utilizando un ELISA de captura para detección de anticuerpos IgM en animales que presentan signos clínicos compatibles con las enfermedades producidas por estos virus, 3. Comparar RT-PCR Universales para la detección de alfavirus con el fin de seleccionar el método más sensible y específico que permita detectar la presencia de estos virus a partir de muestras de tejidos en animales son sintomatología nerviosa 4. Establecer por medio de un RT-PCR Universal con confirmación a partir de secuenciación de Sanger, cuales de los virus EEEV, WEEV, VEEV son los agentes etiológicos causantes de lesiones compatibles con encefalitis virales obtenidas en muestras histológicas durante el periodo 2012-2021 de animales con síntomas nerviosos. 5. Establecer patrones evolutivos filogenéticos y posibles recombinaciones, a partir de genomas completos usando métodos de secuenciación de nueva generación, con secuencias obtenidas en bases de datos con el propósito de estimar el posible origen de 23 estos virus y los linajes existentes en nuestro país, posibles mutaciones y el tiempo más reciente en el que los ancestros comunes de estos virus estuvieron circulando en el país. 6. Realizar un modelo de nicho utilizando la ubicación georreferenciada de muestras positivas, variables atmosféricas y geográficas de brotes para VEEV, para establecer donde podrían presentarse nuevos brotes de VEEV en nuestro país. 24 CAPÍTULO II Aporte de las pruebas serológicas al estudio de las encefalitis equinas causadas por Alfavirus. Seroprevalencia nacional y factores de riesgo de los virus de la Encefalitis Equina del Este y del virus de la Encefalitis Equina Venezolana en Costa Rica, (ANEXO II). Bernal León, Annemarie Käsbohrer, Sabine E. Hutter, Mario Baldi, Clair L. Firth, Juan José Romero-Zúñiga, Carlos Jiménez. (2020). National seroprevalence and risk factors for Eastern equine encephalitis and Venezuelan equine encephalitis in Costa Rica. Journal of Equine Veterinary Science. https://doi.org/10.1016/j.jevs.2020.103140 Resumen La Encefalitis Equina del Este (EEEV) y la Encefalitis Equina Venezolana (VEEV) son enfermedades zoonóticas endémicas en los países tropicales de las Américas, que causan encefalitis aisladas o brotes tanto en caballos como en humanos (Aréchiga-Ceballos & Aguilar-Setién, 2015; Carrera et al., 2013; Rosato et al., 1988). En 2013 se realizó un estudio transversal realizado en 243 caballos ubicados en las tierras altas y bajas del territorio costarricense. Las muestras de suero fueron analizadas con un ELISA IgG y confirmados por la prueba de neutralización por reducción de placa 80 (PRNT80). Luego de descartar muestras que se obtuvieron de caballos vacunados, o que fueron movilizados entre tierras altas y bajas, se analizaron un total 217 muestras de suero de equinos (95 muestras se obtuvieron en equinos en cantones localizados a más de 900 metros sobre el nivel del mar (tierras altas) y 122 muestras de equinos en cantones localizados a 900 o menos metros sobre el nivel de mar (tierras bajas). El rango de edad de los animales varió entre 1 y 32 años, con un promedio de 7.5 años. El número de equinos por establecimiento varió entre 1 a 80 animales. La seroprevalencia por PRNT80 fue de un 36 % (78/217 caballos) y un intervalo de confianza [IC] del 95 %: [29,9-42,5]; para el virus de la encefalitis equina venezolana y un 3% (6/217 caballos), IC 95%: [1,3-5,9]. Este es el primer estudio que estima la seroprevalencia a nivel nacional del EEEV y VEEV en 25 caballos costarricenses. Se concluye que el VEEV está ampliamente distribuido, mientras que el EEEV ocurre a una frecuencia mucho más baja y solo en áreas específicas del país. Zoonotic alphaviruses in Costa Rica: long-term IgM serosurveillance in horses from 2009 to 2019, (ANEXO III). Bernal León , Mafalda Viana, Sabine E. Hutter, Ana I. Ruiz, Mario Baldi, Annemarie Käsbohrer, Clair L. Firth, and Carlos Jiménez. (2023). Zoonoses and Public Health Journal. Resumen Las pruebas serológicas tales como los ELISAs que detectan anticuerpos IgG, permiten de manera sencilla y económica conocer la prevalencia de un determinado agente infeccioso. Por otra parte, los ELISA de captura de IgM en los animales que presentan signos clínicos compatible con la enfermedad de interés, permiten determinar casos nuevos, saber con qué frecuencia está circulando dicho agente infeccioso, y conocer factores de riesgo asociados a este agente. Las pruebas IgM de captura son muy sensibles y pueden detectar anticuerpos IgM contra EEEV tan pronto como un día después del inicio de la enfermedad en humanos (Calisher, Berardi, et al., 1986). Este tipo de ELISAs, tampoco reaccionan con virus heterólogos y en caballos los anticuerpos IgM pueden detectarse ya al tercer día después de la infección con WEEV (Calisher, Mahmud, et al., 1986). Un total de 114/303 establecimientos (37,6%) fueron positivos para al menos uno de los virus estudiados, mientras que un animal en Guanacaste en el 2010, presentó coinfección VEEV/EEEV. De un total de 548 muestras analizadas, 128 resultaron positivas para VEEV (23,4%), IC [19,9- 27,1%], mientras que 8 muestras (1,5%), IC [0,6-2,9%], fueron positivas a EEEV, ninguna muestra presentó anticuerpos IgM a WEEV por esta prueba de ELISA IgM. Por otra parte, Guanacaste, en la región Norte del país, fue la provincia que presentó o envió al laboratorio la mayor cantidad de casos positivos contra VEEV 65,6% (84/128 de las muestras positivas) y EEEV, la presencia de anticuerpos IgM contra este virus se obtuvo en un 50% de muestras positivas (4 de los 8 casos detectados). Diferencias estadísticamente significativas se observaron al comparar los meses y años en que se recolectaron las muestras, así como con efecto del fenómeno oscilatorio del sur del niño y la niña. 26 CAPÍTULO III Aporte de las pruebas moleculares al estudio de las encefalitis equinas causadas por Alfavirus. En este capítulo se presentan los resúmenes de tres estudios, el primero es la detección del VEEV a partir de muestras de tejido nervioso para lo cual se compararon cuatro RT-PCR universales para detectar alfavirus, el segundo la obtención del genoma de VEEV a partir del cerebro de una yegua con síntomas nerviosos, y el último es un análisis filogenético bayesiano, y de mutaciones a partir de secuencias del genoma de VEEV del subtipo I. Detección del virus de la encefalitis equina venezolana a partir de muestras de cerebro de equinos con síntomas nerviosos, (ANEXO IV). B León, J Estrella-Morales and C Jiménez. Detection of Venezuelan Equine Encephalitis Virus from Brain Samples of Equines with Encephalitis. Zoonotic Diseases. August, 2023. Resumen La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica confiable y sensible para detectar virus (Klapper et al., 1998), existen diferentes variantes de la prueba de PCR que se modifican para reducir costos sin comprometer la precisión. El RT-PCR Universal es una de esas variantes, que se utiliza para detectar familias o géneros de virus con varias especies en una reacción. Aunque es necesario secuenciar el producto de PCR para determinar cuál es la especie que está presente en la muestra o la cepa o el subtipo dentro de una especie, o incluso esta metodología permite el descubrimiento de nuevos Alfavirus y discrimina entre muchas especies virales que afectan a diferentes huéspedes. En este estudio, se compararon cuatro RT-PCRs, tres de ellos eran RT-PCR anidados, El RT-PCR que demostró no solo ser más sensible sino más específico y económico fue el RT-PCR desarrollado por Torii. Este RT-PCR detectó 104 unidades formadoras de placa por mL (UFP/mL), y detectó 103 UFP/mL del virus de EEE-Simbis. Una vez que se seleccionó el mejor RT-PCR se compararon 8 diferentes localizaciones del cerebro: bulbo raquídeo, cerebelo, núcleos basales, tálamo, hipocampo, corteza occipital, colículo frontal y médula 27 espinal, encontrándose que VEEV no se replica igual en todas las ubicaciones del cerebro evaluadas, siendo el hipocampo, los núcleos basales y la médula espinal las regiones donde se amplificó una mayor cantidad de partículas virales. De los 70 cerebros analizados, 40 de bovino dieron negativo, y en los restantes 30 cerebros equinos, 4 mostraron amplificación a nivel del control positivo en las regiones mencionadas. No obstante, solo dos de estas muestras pudieron secuenciarse y confirmarse como VEEV subtipo IE debido probablemente a la baja carga viral observada en las otras dos muestras lo que no permitió obtener un resultado luego del proceso de secuenciación. First Complete Coding Sequence of a Venezuelan Equine Encephalitis Virus Strain Isolated from an Equine Encephalitis Case in Costa Rica, (ANEXO V). Bernal León, Carlos Jiménez, Rocío González, Lisbeth Ramirez-Carvajal. First Complete Coding Sequence of a Venezuelan Equine Encephalitis Virus Strain Isolated from an Equine Encephalitis Case in Costa Rica. Microbiol Resour Announc September 2019. 8:e00672-19. https://doi.org/10.1128/MRA.00672-19. Resumen El genoma del virus Encefalitis Equina Venezolana VEEV es una única cadena de ARN positivo de ~11,5 kb, poliadenilado en la terminación 3', con una cubierta en la terminación 5'. El genoma codifica cuatro proteínas no estructurales (NSP1 a 4) y las proteínas estructurales procesadas a partir de una poliproteína precursora organizada como NH2- cápside-E3-E2-6K-E1-COOH (A. C. Brault et al., 2004). VEEV es una de las especies del género Alfavirus dentro de la familia Togaviridae con seis variantes serológicas, clasificadas del I a VI. La variante I se dividió en cuatro cepas, IAB e IC se consideran cepas epizoóticas virulentas (Oberste et al., 1999), mientras que ID, IE y las restantes variantes II, IIIA a IIIC, IV, V y VI, son subtipos enzoóticos que se encuentran en Norteamérica desde los Everglades, Colorado, y México hasta Centroamérica y Sudamérica (Chamberlain et al., 1964; Forrester et al., 2017; Monath et al., 1980; Sneider et al., 2019b). La primera secuencia del genoma del virus VEEV obtenida en Costa Rica, pertenece al subtipo IE y se obtuvo de una yegua con una encefalitis linfoplasmática y neutrofílica severa, la cual fue confirmada por examen histológico y clínico. El genoma obtenido tiene 28 11.440 pb; 49,2% contenido de GC, con una identidad de un 98% de nucleótidos con un virus aislado en Nicaragua en 1963. Phylogenetic and Mutation Analysis of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Sequence Isolated in Costa Rica from a Mare with Encephalitis, (ANEXO VI). Bernal León, Gabriel González, Alessandro Nicoli, Alicia Rojas, Antonella Di Pizio, Lisbeth Ramírez-Carvajal, and Carlos Jiménez. Phylogenetic and Mutation Analysis of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Sequence Isolated in Costa Rica from a Mare with Encephalitis. Vet. Sci. 2022, 9, 258. https://doi.org/10.3390/vetsci9060258. Factor de impacto: 2.518 Resumen El virus de la encefalitis equina Venezolana se ha clasificado en 6 subtipos, el subtipo I se clasifica a su vez en cuatro grupos o subtipos, de los cuales los subtipos I AB y IC están relacionados con brotes epidémicos periódicos (Powers et al., 1997), mientras que el ID y IE se consideran subtipos no virulentos o con capacidad limitada para producir brotes, el subtipo IC es endémico en Panamá, mientras que el IE se extiende desde México hasta Costa Rica (Aguilar et al., 2011; Martin et al., 1972; Oberste et al., 1999). A pesar de que se considera avirulento, el subtipo IE fue responsable de dos brotes en México, en Chiapas en 1993 y en Oaxaca en 1996 (Oberste et al., 1999), mientras que el subtipo ID produjo dos muertes de hombres jóvenes en Panamá (Aguilar et al., 2011). Debido a la evidencia serológica obtenida a principios de los años 70, el subtipo IE se considera endémico en el norte de Costa Rica (Fuentes, 1973; Martin et al., 1972); sin embargo, su origen epidemiológico sigue siendo desconocido. A partir de la primera secuencia del genoma del VEEV IE, se realizó un análisis filogénetico junto con 109 secuencias concatenadas (solo regiones codificantes) descargadas del GenBank. Basados en estos análisis, se estima que el tiempo del ancestro común más reciente TMRCA para el subtipo I fue el año 1003, mientras que el subtipo IE divergió del resto de subtipos en 1762, el TMRCA de las muestras de Costa Rica y Nicaragua se situó en 1963 y es probable que estos virus vinieran de México. Además, se propone que mutaciones presentes en el heterodímero E1/E2 podrían estar asociadas con la virulencia de este virus. 29 CAPÍTULO IV Un modelo de nicho ambiental para estimar la presencia potencial del virus de la encefalitis equina venezolana en Costa Rica, (ANEXO VII). León B, Jiménez-Sánchez C, Retamosa-Izaguirre M. An Environmental Niche Model to Estimate the Potential Presence of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in Costa Rica., Int J Environ Res Public Health. 2020;18 (1):227. Dec 30. 2020. doi:10.3390/ijerph18010227. Factor de impacto: 4.614 Resumen Se utilizó el programa MaxEnt para analizar la información de los casos de presencia de VEEV basados en los datos de georreferenciación de los casos positivos detectados en los estudios serológicos y moleculares ya descritos previamente, en conjunto con el uso de capas climatológicas de dominio público, con el propósito de identificar áreas geográficas con potencial riesgo de presentar brotes de VEEV. Se determinó que las variables que más contribuyeron en la aparición de casos de VEEV fueron la temperatura, la precipitación y la elevación. En el caso de la lluvia, a mayor precipitación mayor probabilidad de presencia de VEEV, se obtiene un 100% de probabilidad de que se den casos de VEEV cuando se presentan 700 mm de precipitación, un dato interesante fue determinar que si solo se analiza esta variable sin interacción de otras, la condición necesaria para que se de un aumento en la probabilidad de casos de VEEV, es la presencia de las primeras lluvias, sin embargo, la probabilidad de que se presenten más casos cae hasta un 45%, lo que indica que son necesarias otras condiciones para aumentar la probabilidad de casos de VEEV. Con esta información se generó un mapa que muestra cuales son los cantones que presentan más probabilidad de casos de VEEV en el país. 30 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los primeros registros sobre la prevalencia de los alfavirus en Costa Rica datan de principios de los años 70 (Fuentes, 1973; Martin et al., 1972). No obstante, no se tienen datos sobre la prevalencia nacional de estos virus. Por esta razón se realizó un muestreo serológico en equinos, con el objetivo de determinar si existían diferencias en el nivel de presencia y distribución de estos virus, así como información sobre los patrones epidemiológicos o factores de riesgo involucrados a la detección de anticuerpos IgG como evidencia de una infección previa causada por estos virus, para lo cual se dividió el país en dos regiones, localidades a más de 900 metros sobre el nivel del mar, m.s.n.m y regiones a 900 o menos m.s.n.m. En el primer artículo del capítulo II se realizó un análisis de estadística descriptiva para evaluar la seroprevalencia de EEEV y VEEV según los resultados de la prueba de la seroneutralización en reducción en placa (PRNT80) como prueba confirmatoria de los resultados obtenidos a partir de un ELISA IgG indirecto. La seroprevalencia general basada en los resultados obtenidos con la PRNT80 fue de un 36%, 78 de 217 caballos muestreados presentaron anticuerpos IgG, con un intervalo de confianza [IC] del 95%: que va de un 29,9 a un 42,5 para el virus VEEV y un 3% 6 de 217 caballos, con un [IC] del 95%: que va de un 1.3 a 5.9 para el virus de EEEV. Ambos virus están presentes en las tierras bajas y en las tierras altas. Como era de esperar, la prevalencia de VEEV fue mayor en las tierras bajas, 51 de 122 equinos presentaron anticuerpos IgG (41.8%) (CI 33.1-50.5) contra 27 de 95 equinos muestreados en las tierras altas (28.4%) (CI: 19.3-37.5). Este resultado es prácticamente idéntico al 43% de seroprevalencia global reportada en 1970 en zonas bajas (Martin et al., 1972), mientras que en el estudio realizado por Fuentes en 1971, la seroprevalencia a VEEV fue de 21,2% en las zonas del norte del país. Esta diferencia estadísticamente significativa se confirmó cuando se evaluó la variable altitud en el modelo de regresión logística, junto con las otras variables estadísticamente significativa detectadas en el estudio transversal para la detección de IgG, tales como precipitación y número de caballos por premisa. No obstante, en el análisis multivariado solo la altitud permaneció significativa con un OR menor al observado en el análisis univariado, pasando de 7.2 (CI: 2.24 a 23.17) a 5.37 (IC 1.59-18.12), lo que demuestra que 31 los animales que se mantuvieron a <100 m.s.n.m. tienen 5.37 veces más posibilidad de tener anticuerpos IgG contra VEEV que los caballos mantenidos a más de 100 m.s.n.m (p=0.006). Las diferencias observadas muestran que, si bien el VEEV se encuentra ampliamente distribuido en Costa Rica, su seroprevalencia depende de la región muestreada. Según otros autores, estas variaciones podrían estar relacionadas con la sensibilidad y especificidad de las diferentes herramientas diagnósticas utilizadas (Cole & McKinney, 1971; Sahu et al., 1994; Walton et al., 1989). Basado en los resultados observados, el ELISA de VEEV fue más específico que el ELISA de EEEV como lo evidencia el coeficiente kappa de Cohen 0.72 versus 0.23, lo anterior debido a los casos de reacción cruzada que fueron más comunes en el ELISA de EEEV (falsos positivos) que en el ELISA de VEEV (Sahu et al., 1994; Walton et al., 1989). Un estudio realizado en hámster en la década de 1970 demostró inmunidad protectora entre VEEV, WEEV y EEEV y esto podría explicar la alta tasa de falsos positivos determinados en el ELISA de EEEV utilizado comparado con los resultados obtenidos por la prueba de seroneutralización en placa PRTN (Cole & McKinney, 1971). La baja especificidad del ELISA IgG por reacciones cruzadas (a otros alfavirus) en comparación con el PRNT80 ha sido ampliamente reportada (LaBeaud et al., 2015; Oberste, Weaver, et al., 1998; Rosato et al., 1988; Thompson et al., 2014). Desafortunadamente, no tuvimos acceso a quimeras de otros subtipos de VEEV u otros alfavirus tales como el virus WEEV para poder determinar la presencia de anticuerpos IgG contra estos virus. De 78 animales seropositivos para VEEV, solo cuatro reportaron signos clínicos: tres tenían fiebre (solo dos de estos tenían una edad específica informada: 18 y 8 años) y otro presentaba signos nerviosos. La baja tasa de animales con signos nerviosos puede deberse a una cepa de VEEV de baja patogenicidad, como el subtipo IE (considerado no patógeno y endémico en Costa Rica en los años 70) (Martin et al., 1972). Sin embargo, casos clínicos causados por una infección equina natural (León et al., 2019) o experimental con este subtipo puede producir signos nerviosos y la muerte (Gonzalez-Salazar et al., 2003; Oberste, Fraire, et al., 1998). Hasta el momento, el EEEV se ha descrito en las zonas del norte (Alajuela) (Fuentes, 1973), en la costa del Caribe (Limón) y en el Valle Central (Heredia) de Costa Rica, este 32 virus aún no se ha confirmado en la costa del Pacífico. Las áreas EEEV positivas se encuentran entre las provincias más lluviosas de Costa Rica > 4000 mm precipitación anual/m2 (Solano & Villalobos, 2012) y las altitudes más bajas (<100 m), ambas variables están relacionadas con el hábitat del mosquito. Los factores ambientales (Shand et al., 2016) relacionados con la altitud, como la temperatura y el nivel de humedad, sin duda pueden considerarse relevantes junto con la precipitación, lo que resulta en más criaderos de mosquitos. Con el propósito de establecer la frecuencia con que estos virus circulan en nuestro país, si los casos de alfavirosis son estacionales, recurrentes y si tienen la misma magnitud todos los años, se realizó un estudio longitudinal de vigilancia pasiva entre el 2009 y el 2019 en caballos con síntomas nerviosos y o fiebre, en con el fin de detectar la presencia de anticuerpos IgM contra alfavirus por medio de un ELISA de captura. Durante este período, el personal de SENASA o veterinarios privados de las siete provincias de Costa Rica que fueron notificados por los dueños de equinos que presentaron síntomas nerviosos o algún signo de enfermedad compatible con una infección causada por alfavus, tomaron un total de 590 muestras de suero de caballos. Los propietarios de los caballos enviaron voluntariamente junto con los sueros información asociada relevante, como la edad, el sexo, la raza y la ubicación de cada animal muestreado. Todas las muestras de suero fueron analizadas en el Laboratorio de Virología de la Escuela de Veterinaria de la Universidad Nacional. De las 590 muestras de equinos enviadas, 42 equinos se excluyeron del estudio porque habían sido vacunados contra alguno de los virus evaluados o tenían datos de ubicación incompletos o ausentes. Se determinó que 23,4%, 128 de 548 equinos con síntomas nerviosos fueron positivos a VEEV, mientras un 1,5% (8/548) de estos animales resultó positivo a EEEV, ningún animal presentó anticuerpos IgM contra el virus de la encefalitis equina del Oeste. Esto último sugiere que el WEEV no está presente en Costa Rica, o su circulación es extremadamente baja, menos del 1%, considerando el número de muestras analizadas. Tanto en el estudio de seroprevalencia como en el estudio longitudinal la presencia de casos positivos a VEEV fue mayor que a EEEV. Estudios serológicos realizados previamente en regiones al norte del país reportaron también una mayor presencia de VEEV que de EEEV 33 (Fuentes, 1973; Martin et al., 1972). En el estudio de Fuentes, la prevalencia de IgG para VEEV fue del 21,2% mediante la prueba de microneutralización y del 7,2% para EEEV, lo que coincide con los resultados obtenidos por IgG a nivel de todo el país y con el estudio longitudinal para la detección de IgM. Mientras que los títulos de anticuerpos detectados en WEEV, en el estudio de Fuentes en 1973, se consideraron una reacción cruzada con VEEV o EEEV, de acuerdo con las pruebas de neutralización. Un total de 114/303 establecimientos (37,6%) resultaron positivos a al menos un virus, mientras que un animal en Guanacaste en el 2010 presentó una coinfección a VEEV/EEEV. Este caso en particular podría ser la única reacción cruzada observada en la prueba de IgM de captura o podría ser efectivamente el resultado de una coinfección. También se ha informado casos de coinfección con los virus EEEV y VEEV en un paciente humano en Panamá (Carrera et al., 2013) y en caballos (Fuentes, 1973). Otra razón podría ser una respuesta de vacunación reciente (no informada); sin embargo, es poco probable ya que las vacunas contra la encefalitis no se distribuyen comúnmente en el país debido a la baja demanda. En el caso de una hipotética sobreinfección de EEEV en un individuo inmune a VEEV, o viceversa, es poco probable que se produzca IgM heteróloga. Esto se debe a que la IgG preexistente, resultado de la infección primaria, neutralizaría el virus heterólogo (Calisher, Berardi, et al., 1986). En el estudio longitudinal (ELISA para detección de IgM en equinos con signos de enfermedad) se observó que los animales infectados con VEEV eran significativamente más jóvenes y estaban ubicados en lugares con niveles de elevación bajos y cálidos que los animales negativos, coincidiendo esto último con los resultados obtenidos en el estudio transversal que determinó la prevalencia de VEEV y EEEV en Costa Rica. La detección de más casos de VEEV en animales jóvenes tiene sentido, considerando que la prevalencia basada en la presencia de anticuerpos IgG contra VEEV en lugares con una elevación igual o menor a 900 msnm es de un 41.8%, lo que indica que prácticamente la mitad de la población adulta ya tienen anticuerpos contra estos virus por lo que las reinfecciones en estos animales es menos probable que en animales jóvenes. 34 Curiosamente en el estudio transversal para la determinación de IgG, la provincia de Limón presentó la mayor seroprevalencia para VEEV (59%) y EEEV (12%) lo que sugiere que los vectores competentes para estos virus cohabitan allí. Mientras que, en el estudio de vigilancia para la detección de IgM, Guanacaste fue la provincia con un mayor número de casos. Por qué estos resultados no coinciden con los obtenidos en el estudio transversal puede ser producto a la presencia de una cepa más virulenta en Guanacaste que llegue a provocar este tipo de signos clínicos o que los dueños de equinos estén más familiarizados con la enfermedad causada por las encefalitis equinas en Guanacaste que los dueños de equinos en otras parte del país y por esta razón enviaron más muestras o contactaron a los servicios oficiales o privados del país para que se tomaran y enviaran muestras para confirmar o descartar este tipo de enfermedades. Es importante señalar que durante el estudio longitudinal para la detección de IgM, en la provincia de Guanacaste se observaron dos picos o brotes (aumentos de casos con relación al promedio de casos por año observado), en los años 2009 y 2015. De acuerdo con nuestros resultados, un posible patrón de VEEV podría presentarse cada 6 años en Guanacaste. Curiosamente, también se reportaron casos de VEEV en Belice, Guatemala y Panamá en 2009, 2010, 2014 y 2015 (Organización Mundial de Sanidad Animal WOAH WAHIS), coincidiendo con los años de mayor número de casos en Costa Rica, lo que sugiere que estos casos no están restringidos a un país, sino que involucran regiones más grandes. Los años 2009 y 2015 fueron años en los que se experimentó el efecto de El Niño. El Niño tiene diferentes impactos en diferentes regiones geográficas. En Costa Rica, durante los años de El Niño, el clima es más seco y cálido en la parte del Pacífico y más húmedo en el lado caribeño del país. El Niño fue parcialmente responsable de una sequía severa de 2015 a 2016. La Niña generalmente tiene el efecto opuesto en Costa Rica, aumentando ligeramente la lluvia en el lado Pacífico y, a veces, produce sequias en el Caribe. Por otra parte, como los arbovirus se transmiten principalmente por mosquitos, las condiciones climáticas se consideran un factor importante de estas enfermedades (Weaver & Reisen, 2010; Wiwanitkit, 2006). Además, se ha sugerido que la intensidad de la actividad de las enfermedades globales en algunas regiones es entre un 2,5% y un 28% mayor durante los años con El Niño en comparación con aquellos sin él, y estos brotes podrían estar relacionados con eventos de El Niño-Oscilación del Sur (ENSO) (Anyamba et 35 al., 2019). Sin embargo, se sabe poco sobre cómo los diferentes eventos ENSO (por ejemplo, El Niño versus La Niña) podrían impulsar brotes de arbovirus en equinos. Estudios anteriores sobre los virus de la encefalitis equina no han investigado los patrones temporales ni el efecto de las condiciones climáticas sobre la presentación de casos de VEEV y EEEV en nuestro país. A pesar del incremento en el número de casos observados en Guanacaste, los resultados obtenidos del estudio longitudinal sugieren que la seropositividad para VEEV ha ido disminuyendo lentamente a lo largo de los años, el porqué de este comportamiento puede deberse al subtipo viral ya que dependiendo de este varía en velocidad e intensidad a la que se propaga el VEEV el cual, así como a las densidades de poblaciones de mosquitos, una comportamiento similar se ha observado con el virus WEEV en los Estados Unidos, en el cual se cree que esta disminución de casos no se debe a una pérdida en la virulencia del virus (Bergren et al., 2014; Forrester et al., 2008), sino, a otras posibles causas como cambios en las prácticas de irrigación, vacunación contra otros Alfavirus del mismo género y al éxito de las campañas de control de los mosquitos en los Estados Unidos (Zacks & Paessler, 2010). No obstante, estas prácticas no parecen aplicarse a nuestro país, por lo que quedaría la opción de una disminución en la virulencia del virus. A pesar de lo anterior y basados en los resultados serológicos para la detección de los anticuerpos IgG e IgM, el VEEV es el virus más prevalente probablemente en el país porque es más eficaz para inducir títulos de viremia más altos que el EEEV (Gardner et al., 2008), lo que podría hacer que este virus esté más disponible para los reservorios, vectores y hospedadores. Otra posible explicación podría deberse a una mayor abundancia y diversidad de vectores (Eisen et al., 2008) y la presencia de sus reservorios en comparación con los virus de las EEEV (Kock, 2015; Rios et al., 2009). Los pequeños mamíferos, especialmente los roedores de los géneros Proechimys, Sigmodon, Oligoryzomys y Oryzomys, sirven como reservorios para las cepas enzoóticas de VEEV (Calisher, Berardi, et al., 1986; Calisher, Fremount, et al., 1986; Carrera et al., 2013). Por ejemplo, el Sigmodon hispidus (rata algodonera) se distribuye ampliamente desde los EE. UU hasta Venezuela (Peppers & Bradley, 2000). Estos animales desarrollan niveles moderadamente altos de viremia durante 2 a 4 días y tienen poblaciones de vida corta y con altas tasas de reproducción, lo que resulta en un suministro casi continuo de 36 huéspedes susceptibles. No obstante, se necesitan más estudios para corroborar la contribución de estos vectores y reservorios en la propagación de VEEV en Costa Rica. Es importante tener en cuenta que la interpretación de las pruebas serologías puede complicarse por la reactividad cruzada de los anticuerpos con virus del mismo serogrupo y por anticuerpos de larga duración (IgG) como producto de infecciones anteriores. Por lo tanto, una prueba serológica tipo IgG requiere confirmación mediante una prueba de neutralización por reducción de placa (PRNT) o detección de seroconversión, con un aumento de al menos cuatro veces en el titulo de anticuerpos (Piantadosi & Kanjilal, 2020), este no es el caso de los ELISAS de captura IgM. En el estudio longitudinal de vigilancia pasiva, optamos por no utilizar la PRNT como medio de confirmación de la prueba ELISA IgM, ya que la PRNT es capaz de detectar cualquier tipo de anticuerpos, incluidos tanto IgM como IgG. Tomamos esta decisión debido a la posibilidad de que los caballos que hayan tenido una exposición previa a estos virus van a desarrollar una respuesta IgG, los cuales serían detectados por la PRNT, dando resultados falsos positivos, en caso de ser negativas de la prueba ELISA IgM (el cual es un marcador de casos agudos). Es importante acotar que a pesar de que los equinos estaban presentando signos nerviosos o algún tipo de signos de enfermedad, estos pueden ser el resultado del efecto de otros agentes etiológicos diferentes a los alfavirus estudiados. En un estudio publicado por Sahu en 1994, de 381 muestras analizadas por IgM ELISA, 132 el 35% tenían anticuerpos contra el virus EEEV lo que sugiere que estos caballos tuvieron una exposición reciente al virus, ya sea por vacunación o infección. Mientras 195 fueron positivas para EEEV por la prueba de inhibición de la hemaglutinación (HIT), y 205 fueron positivas por neutralización del virus (VNT) (Sahu et al., 1994). Un total de 120 de 132 sueros con anticuerpos IgM también se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos EEE IgG, y el 58% de estos sueros tuvieron títulos superiores a 1:100 por ELISA. En 50 sueros positivos a IgM y negativos a IgG por ELISA, 9 tenían anticuerpos además de EEEV contra los virus WEEV VEEV por HIT y 1 por VNT, 4 para EEEV y WEEV por HIT y 5 para estos virus por VNT, mientras 1 para EEEV y VEEV por ambas pruebas de neutralización. En el mismo estudio de Sahu, cuando se compararon 75 sueros IgM negativos a alfavirus con el método de VN, el 75,8% tenían anticuerpos contra 2 o más virus y 21 sueros (22%) 37 tenían anticuerpos contra los virus EEE, WEE o EEV, lo que demuestra que estos caballos estaban previamente vacunados o habían sido infectados con encefalomielitis. Estos resultados confirman lo expuesto anteriormente, las pruebas de neutralización incrementan la tasa de falsos positivos en comparación con el ELISA IgM de captura, debido a la presencia de anticuerpos IgG productos de infecciones previas. Los ELISAs IgM de captura son capaces de detectar anticuerpos IgM contra EEEV tan pronto como un día después del inicio de la enfermedad en humanos. Tampoco reaccionan con virus heterólogos. En caballos, los anticuerpos IgM pueden detectarse tan pronto como el tercer día después de la infección con WEEV (Calisher, Mahmud, et al., 1986). Es importante destacar que los anticuerpos IgM contra EEEV en caballos no reaccionan de forma cruzada con los antígenos WEEV y VEEV en este tipo de ELISAs (Sahu et al., 1994). Los niveles de IgM disminuyen después de 90 días de la infección (Calisher, Fremount, et al., 1986). Por lo que la detección de estos anticuerpos en animales con síntomas compatibles a los producidos por estos la convierte en la prueba de elección recomendada para un serodiagnóstico rápido, en individuos que presentan algún signo clínico por una infección causada por los virus EEE o WEE o en ambos tanto en humanos (Calisher, Berardi, et al., 1986) o en caballos (Sahu et al., 1994). Durante el estudio longitudinal, se presentó un brote de VEEV en la zona Atlántica en el 2016 que afectó al menos a una niña de 9 años que desafortunadamente falleció, el diagnóstico inicial fue Dengue y posteriormente se cambió a VEE por medio de la prueba ELISA IgM de captura usado en este estudio, este resultado fue confirmado por HIT (título de 1:640), otras posibles etiologías como el dengue fueron descartadas por la Universidad de Texas Medical Branch. Inciensa ha reportado alrededor de 19 casos por alfavirosis en humanos entre el 2013 y el 2019. En el artículo que trata este tema se discute la importancia, bajo el esquema de una salud, de considerar el VEEV como un diagnóstico diferencial del virus del Dengue el cual es un virus de la familia Flaviviridae que afecta a seres humanos. También se discute la necesidad de concientizar a los tomadores de decisiones sobre la importancia de estos agentes para evitar el subdiagnóstico o un diagnóstico erróneo tanto en el ministerio de salud como en el Ministerio de Agricultura y en particular en el SENASA. 38 Con las pruebas serológicas pudimos determinar la prevalencia y patrones epidemiológicos de las encefalitis equinas causadas por alfvirus, mientras que las pruebas moleculares nos dieron información relacionada al virus, como cuales subtipos y desde cuando estos subtipos están circulando en nuestro país, así como posibles mutaciones presentes en estos virus. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica altamente específica, sensible y confiable para detectar genoma viral. Las variantes de PCR se han modificado para mejorar y reducir el costo del método sin sacrificar la sensibilidad o la especificidad (Klapper et al., 1998); sin embargo, los ácidos nucleicos de estos virus están presentes en la sangre generalmente solo de 2 a 6 días después de la infección, y a menudo se necesita la secuenciación para identificar la especie o cepa de ARN amplificada. Los PCR Universales son una variante de PCR, que puede detectar familias o géneros de virus con varias especies en una sola reacción (Kuno, 1998), y a pesar de que es necesario secuenciar el producto de la PCR para determinar la especie específica o la cepa de alfavirus, detectada, esta metodología presenta más ventajas que desventajas. La PCR universal seguida de la secuenciación nos permite descubrir incluso nuevos virus. En el 2016 a partir de un pool de 19 moquitos culex quinquefasciatus colectados en Mwinilunga, Zambia se descubrió un nuevo alfavirus (Torii et al., 2018) y en el 2014 a partir de otro grupo de 10 mosquitos Culex declarator capturados en un bosque en Panamá se descubrió un nuevo alfavirus que se denominó tentativamente como Agua Salud (ASALV) (Hermanns et al., 2020). Además, los PCR universales nos ayudan a discriminar muchas especies virales que afectan a diferentes huéspedes al mismo tiempo (Mira et al., 2019), lo que a la larga nos permite ahorrar tiempo y dinero. Para ello, es importante validar estos ensayos tomando en cuenta los reactivos, volúmenes de reacción y equipos con que se cuenta antes de implementarlos en el laboratorio para garantizar su sensibilidad y especificidad. Factores como el diseño de los iniciadores o primers, la selección de los genes y la conservación de las regiones amplificadas pueden afectar la sensibilidad y la especificidad del ensayo. Cuatro RT-PCR fueron comparados y estandarizados para detectar Alfvirus, La Figura 1, muestras las fases que nos facilitaron seleccionar el PCR universal más sensible y específico para detectar alfavirus en muestras de tejido nervioso. A pesar que todos los RT- 39 PCR Universales cumplen con el propósito de amplificar estos virus, se observaron variaciones importantes en la sensibilidad y especificidad entre los cuatro protocolos. Estas diferencias podrían deberse al diseño de los cebadores, la selección de la región (gen) donde se ubicaron los cebadores, cuán conservada está esta región entre los diferentes alfavirus, pero también pudieron deberse a variaciones en los tipos de equipos, volúmenes de reacción y reactivos utilizados. Por ejemplo, la PCR anidada en RT de Grywna fue estandarizada con 50 µl de reacción y albúmina de suero bovino en la mezcla de reacctivos (Grywna et al., 2010) mientras que el volumen de reacción utilizado en la validación en nuestro estudio fue de 12,5 µl y la albunima de suero bovino no fue utilizada en la mezcla de reacción. Por estas razones, la verificación de los ensayos antes de su implementación es muy importante y es una de las mejores prácticas en el trabajo de laboratorio. Basados en los resultados obtenidos se selecciónó la prueba Torii RT-PCR de un solo paso (Torii et al., 2018) por ser la más sensible, específica, rápida y económica en comparación con el resto de protocolos evaluados, en los anexos se presentan las tablas de la 1 a la 12 en las que se describen las mesclas de reacción y los tiempos de ciclaje de cada uno de estos PCR en su formato de dos pasos RT-PCR o un paso RT-PCR mas el PCR anidado. En este estudio se pudo comprobar que VEEV no amplificó en todas las ubicaciones del cerebro analizadas, probablemente porque el virus no se replica en todas las regiones del cerebro. En estudios de replicación de Alfavirus en cerebros de ratones, se detectó evidencia histopatológica de daño EEEV en la corteza, el hipocampo y el tálamo (Phelps et al. 2019), mientras que la replicación viral de VEEV en el cerebro de ratones fue multifocal y localizada en asociación con capilares cerebrales (Schafer et al., 2011). En los seres humanos, EEEV produce lesiones en los ganglios basales, el tálamo y la corteza cerebral, visibles mediante tomografía computarizada (TC) o resonancia magnética nuclear (RMN) (Albe et al., 2021). En nuestro estudio, amplificamos el ARN de VEEV en el hipocampo, los núcleos basales, el tálamo y la médula espinal de los equinos. Se evaluó la posibilidad de usar extracciones de mezclas de estas regiones demostrando la posibilidad de utilizar estas mezclas en el diagnóstico de VEEV. Las diferencias observadas en la amplificación de las localizaciones de tejido corroboran la importancia de seleccionar la localización que se debe extraer para no tener falsos negativos en el PCR. Recomendamos evaluar el 40 hipocampo, la médula espinal, los núcleos basales y el tálamo al menos en el caso de VEEV individualmente o mezclados. El volumen de extracción de ARN se aumentó de 1 a 5 µl en la RT-PCR, con el fin de contrarrestar el efecto de los desafíos de detectar el ARN, debido a su susceptibilidad a la degradación por múltiples ciclos de congelación y descongelación o enzimas RNasa presentes en el tejido. Los alfavirus pueden diagnosticarse no solo en los tejidos sino también en la sangre, aunque la viremia generalmente se detecta en la sangre solo de 3 a 6 días después de la infección (Wang et al., 2006). 41 Figura 1. Flujo de ensayos para seleccionar el mejor RT-PCR para realizar el diagnóstico de Alfavirus. . 42 En Costa Rica, los casos seropositivos de VEEV oscilan entre un 23% y un 36% aproximadamente (Jiménez et al., 2018; León et al., 2020). A pesar de tener moderados valores de positividad, de los 30 cerebros equinos evaluados aquí, solo cuatro mostraron amplificación de Alfavirus. Lamentablemente, solo en dos de estas cuatro muestras se pudo obtener una secuencia, lo cual permitió no solo confirmar el resultado del PCR sino también determinar el subtipo IE VEEV, el cual fue el causante de las encefalitis fatales en estos equinos. Las razones de no obtener más secuencias, puede deberse a la baja carga viral observada en las otras dos muestras que presentaron una banda débil a nivel del control positivo, a pesar de utilizar 5 µl de ARN en lugar de uno. En un estudio en el que se utilizó la detección del virus del distemper canino CDV como control interno para evaluar el método de extracción, la degradación del ARN y la presencia de inhibidores de PCR en muestras de cerebro bovino. Se logró detectar el CDV en todas las muestras extraídas cuando se añadió directamente al proceso de extracción, pero no cuando se añadió el CDV directamente a la muestra de tejido cerebral antes de la extracción del ARN, según los autores este resultado se debido posiblemente a la rápida degradación del ARN del CDV en el cerebro (Lüthi et al., 2018). El proceso de autofagia, que utilizan las células para mantener la salud celular y la homeostasis, también puede contribuir al fracaso de la detección del ARN viral en muestras de tejido (Choi et al., 2018). Durante el proceso de recolección de muestras (más de 11 años) se logró la secuenciación del genoma del virus de VEEV a partir de una cepa de VEEV IE aislada de un caso clínico. La muestra fue obtenida del cerebro de una yegua analizada en el Laboratorio del Servicio Nacional de Sanidad Animal (SENASA-LANASEVE). La yegua mostró lesiones compatibles con una encefalitis linfoplasmática y neutrofílica, caracterizada por moderada a severa infiltración perivascular multifocal de linfocitos, células plasmáticas y escasos neutrófilos Figura 2. El tamaño del genoma fue de 11.440 pb; 49,2 % de contenido de GC (guanina-citosina) la cobertura mínima fue 1X; la media fue de 3843X y la máxima fue de 7795X. La secuencia compartió un 98% de identidad de nucleótidos con la secuencia (KC344441) aislada en Nicaragua en 1968. 43 Figura 2. Tinción histológica de hematoxilina y eosina (H&E) de los ganglios basales de la yegua infectada con VEEV con encefalitis. Estos resultados indican que la muestra aislada en Costa Rica en el 2015 está filogenéticamente relacionada con una muestra aislada en Nicaragua en 1968, no obstante este tipo de análisis no permite demostrar desde cuando están circulando estos virus y de donde vinieron. El subtipo IE se clasificó previamente en tres linajes distintos llamados Caribe, Pacífico y Panamá, esta clasificación se basó en 868 nucleótidos de la glicoproteína precursora E2 (PE2) (Oberste et al., 1999) y el nombre se le dio de acuerdo con la distribución geográfica de la muestra. De acuerdo a esta clasificación el secuencia de Costa Rica se agrupa en el cluster del Pacifico junto con muestras de Centroamérica y México, mientras que en el cluster del Caribe se ubican secuencias de México. El subtipo I del VEEV está ampliamente distribuido en América tropical, según nuestro análisis filogenético, obtenido en la tercera publicación del capítulo III, el subtipo IE ha estado circulando en América Central desde 1764 (596-1771), mientras que el subtipo IE parece ser el más temprano en divergir y el resto de los subtipos podrían derivar de este. Sin embargo, esta posibilidad no está bien sustentada (0,45) probablemente debido al número 44 limitado de secuencias analizadas, a pesar de la alta probabilidad posterior en el árbol filogenético igual o superior a 0,95. Forrester y colaboradores (2017) generaron dos árboles separados del subtipo complejo I debido al predominio de la selección purificadora en la evolución de los alfavirus, lo que podría sesgar las estimaciones de TMRCA para eventos de divergencia antiguos en virus de ARN (Forrester et al., 2017). El TMRCA de las cepas ID/IAB/IC (primer árbol de Forrester) fue de 1750 (1578–1857); desafortunadamente, esta fecha no se pudo determinar con precisión en su estudio utilizando el análisis BSREL, y solo el TMRCA del subtipo IC podría estar fechado de manera confiable en 1934 (1904-1950) (Forrester et al., 2017), en nuestro caso, el subtipo IC fue fechado en 1941 (1926-1954), mientras que el TMRCA para el grupo ID/IAB/IC data de 1795 (1651-1922). En Costa Rica, el subtipo IE de VEEV es endémico al menos en el norte del país (Fuentes, 1973; León et al., 2019; Martin et al., 1972). Con base en la evidencia serológica, Martin et al., (1970) sugirieron que los virus VEEV IE estuvieron activos en la región entre 1961- 1962 y nuevamente en 1967-1968 [1], coincidiendo con TMRCA de la secuencia de Costa Rica 1963 (95% HPD 1957–1968). El antepasado que originó el subtipo IE podría haber venido de Panamá o de un país cercano en América del Sur, y similar al brote de IAB en 1969 (Campillo-Sainz, 1968; Martin et al., 1972), el subtipo IE podría haberse propagado a América del Norte y del Sur y volverse endémico en Guatemala, y México, respectivamente, circulando en ciclos salvajes. Las diferencias entre los antígenos virales podrían estar correlacionadas con las diferencias en la distribución de sus reservorios o vectores, causadas por la migración o evolución de la población. Teniendo en cuenta las mutaciones identificadas en los genes de la glicoproteína E1 y E2, en la secuencia aislada en la segunda publicación del capítulo III, de las tres mutaciones en E2 descritas en la tercera publicación de ese capítulo, Q81R, S182R, fueron catalogadas como cambios de selección positivas/diversificada según FEL, y de estas S282L producen un cambio en las propiedades de los aminoácidos. En nuestro caso, dos de los tres aminoácidos presentes en la proteína E2 están cargados positivamente. La mutación E2 R81 encontrada en la secuencia de Costa Rica se comparte solo con tres secuencias, dos 45 secuencias panameñas del subtipo ID, KC344473 1997, y KC344503 1977, y una del subtipo epizoótico IC la secuencia venezolana KC344508 1974. Un estudio publicado confirmó que un pequeño número de mutaciones que se traducen en aminoácidos con carga positiva (Arg, Lys) en los genes de la envoltura, cinco en E2 y una sola diferencia en E1 y E3 pueden generar viremia y síntomas de encefalitis más severos, las cuales interesantemente estuvieron implicados en la transformación del VEEV enzoótico no patogénico al fenotipo competente capaz de producir viremia en equinos (Greene et al., 2005). Según nuestro análisis estructural, las mutaciones en E1/E2 pueden conducir a una desestabilización del heterodímero que podría estar implicada no solo en el reconocimiento del receptor sino también en el incremento de la virulencia fenotípica. Estudios experimentales in vitro o en modelos animales podrían dar una idea del efecto y del papel específico de las mutaciones observadas en el virus aislado en Costa Rica. A través de las diferentes etapas que han ido aportando información sobre los virus que causan las encefalitis equinas en Costa Rica, hemos venido agregando piezas al rompecabezas del virus de la encefalitis equina venezolana, sin embargo, hasta ahora no hay información o estimaciones de posibles lugares donde este virus puede infectar a caballos o humanos o causar brotes, o incluso que lugares tienen más posibilidad de presentar casos positivos. Un estudio de nicho ecológico, es la suma de los factores ambientales que actúan sobre un particular organismo, que ocupa un área específica o subdivisión de un hábitat (Sillero, 2011). Modelos ecológicos de nicho se pueden calcular a partir de la presencia/ausencia de una especie o un agente infeccioso, o con datos de presencia y pseudo-ausencia o solo con datos de presencia. (Sillero, 2011). En los últimos años la popularidad de los modelos de nicho a partir de datos de presencia se ha ido incrementando en parte debido a la mayor disponibilidad de este tipo de registros, especialmente en el área de salud en la que solo dispone de información sobre casos clínicos producidos por un determinado agente infeccioso. Para que un ser vivo padezca una enfermedad deben convergir diferentes componentes en un mismo tiempo y lugar, por ejemplo que el animal sea susceptible a ese agente en particular, que el ambiente tenga las condiciones ideales para el reservorio y vector, y que el agente esté también presente. En un caso positivo (presencia), los tres componentes 46 estuvieron presentes, mientras que, en un caso negativo, las condiciones ambientales pueden ser las idóneas pero en ese momento puede que el virus no está presente ya sea en el vector o en el reservorio estén, lo cual no significa que debemos descartar este nicho ya que en otro momento en el mismo punto se pueda presentar un caso. MaxEnt es un programa que (Koch et al., 2016) modela nichos y que utiliza un algoritmo de máxima entropía para analizar los valores que conforman capas en las que se registran condiciones, geográficas, y o ambientales. Es decir, el programa analiza las variables y elige la de máxima entropía, en otras palabras los menos restringidos. Este programa de aprendizaje automático utiliza solo datos de presencia de un espécimen en particular, a través de un paisaje definido por el usuario que se divide en celdas o cuadrículas, compara las condiciones donde se presentan estos casos para modelar posibles nichos en otras regiones que podrían tener estas mismas condiciones favorables y de esta manera estima la idoneidad de la presencia de casos nuevos en dichos sitios. Este programa genera un mapa con colores que indican aquellos sitos que tienen una alta probabilidad de tener casos de VEEV así como sitios con poca o ninguna probabilidad de que ocurran estos casos. La capacidad de predicción del modelo depende de qué tan bien se ajusten los datos al modelo de entrenamiento, así como el tipo de variables utilizadas en el modelo, y el valor de idoneidad está representado por entrenamiento del área bajo la curva AUC. Esto debe entenderse como una medida de rendimiento según los diferentes umbrales, una curva de probabilidad, cuanto más cerca esté esta probabilidad al valor 1 mejor será el modelo para predecir. Aunque el valor del AUC de entrenamiento en este estudio podría considerarse bajo (0,80) en comparación con otros estudios, (presencia del virus del Ébola AUC 0.9 (Nyakarahuka et al., 2017) o vector de mosquitos presencia 0.94 y 0.9 (Koch et al., 2016; Miller et al., 2012), sin embargo, fue similar a lo reportado en otro modelo basado en la presencia del virus de la Encefalitis Equina del Este (EEEV), otro especie de Alfavirus 0.770 en los datos de entrenamiento y 0.758 para los datos de prueba (Burch et al., 2020). Se considera un AUC de 0.8 de aceptable a excelente (Phillips et al., 2006). Las curvas de respuesta demuestran que la presencia de VEEV está ligada a varias variables; cinco de ellas tienen el mayor valor de la contribución al modelo, dos fueron 47 relacionados con la temperatura (1ra y 3ra posiciones), dos con la precipitación (2da y 4ta) y la última con la altitud o elevación del relieve. Las variables de temperatura y precipitación tienen un papel importante en la presencia de VEEV, aunque la altitud no es una variable climatológica está correlacionada con la precipitación y temperatura. En el caso de la elevación la presencia de VEEV aumenta hasta un 80% con la altitud y luego cae después de alcanzar los 1400 m.s.n.m., sin embargo, la incidencia disminuyó cuando la altitud es superior a 100 m.s.n.m. cuando se analiza la variable sola sin el aporte de otras variables. Esto significa que otras condiciones favorecen la aparición de VEEV cuando el relieve es superior a esa altura; un factor es la presencia de diferentes especies de vectores/reservorios que pueden ser más o menos abundante en relación a esta variable. Se agregó la variable altitud al modelo considerando su impacto como factor de riesgo asociado con la presencia de anticuerpos IgG contra VEEV en equinos, en el estudio de prevalencias realizado en el 2013 (León et al., 2020). Sin embargo, la altitud fue la variable más importante cuando se analizó sola sin la interacción de otras variables en un estudio realizado en el estado de Florida con casos positivos a EEEV recolectados entre 2005 y el 2010 (Burch et al., 2020). MaxEnt ha demostrado ser extremadamente útil para la conservación de especies, pero también permite a los epidemiólogos y trabajadores de la salud determinar lugares con condiciones ideales para la presencia de nuevos casos de agentes etiológicos. El mapa de la Figura 3 podría utilizarse en futuros estudios para colocar trampas para mosquitos para monitorear las especies de mosquitos que dan positivo para la presencia de VEEV o incluso para establecer animales centinela. 48 Figura 3. El mapa de salida de MaxEnt. La figura muestra la posibilidad de que se den casos de VEEV en cada uno de los 82 cantones de Costa Rica. Los rectángulos al lado del nombre de los cantones (etiquetas) representan el riesgo potencial de presencia de VEEV en dicho cantón. CONCLUSIONES Nuestros hallazgos muestran que el VEEV y el EEEV están presentes tanto en las tierras altas como en las tierras bajas de Costa Rica. No obstante, VEEV tiene una mayor prevalencia produciendo brotes todos los años a lo largo y ancho del país, a pesar de lo anterior es también claro que hay una mayor denuncia de casos en la provincia de Guanacaste, en comparación con cualquier otra provincia. EEEV tiene una prevalencia 10 veces menor a la detectada para VEEV y su distribución se limita al centro norte este del país, y a diferencia de VEEV solo se detectaron casos en 4 de los 11 años evaluados, siendo el 2013 el año donde se dieron más casos. 49 RT-PCR universal de Torii, es una herramienta molecular óptima para la detección de alfavirus en muestras de tejido nervioso confiable y sensible que junto con la secuenciación de Sanger o de nueva generación nos permitió confirmar que el subtipo IE es endémico en las provincias del norte del país, y estimar el TMRCA de los virus de VEEV que componen el subtipo IE, Las herramientas moleculares y bioinformáticas nos dieron un punto de partida para comparar las mutaciones presentes en la secuencia de Costa Rica en el E1/E2 con nuevos casos VEEV, o para poder diagnosticar y analizar cualquier otro alfavirus que produzca encefalitis en equinos. Confirmamos el efecto que tienen variables como la temperatura, precipitación y la elevación en la presencia de casos de VEEV en Costa Rica, las cuales repercuten en los ciclos biológicos de sus vectores y reservorios. Con esta información y con los resultados de presencia de casos de VEEV se generó un mapa por cantón en el que se indican los lugares donde podrían aparecer nuevos casos de VEEV en los próximos años, y tomar decisiones sobre cómo manejar este virus en el futuro, así como para monitorear los cantones con más posibilidades de tener casos de VEEV en caballos o en humanos. Basados en esta información casos clínicos o brotes ocasionales de VEEV y EEEV deben esperarse, no solo en equinos, pero también en seres humanos. Veterinarios, propietarios de caballos, así como los funcionarios de salud deben estar al tanto de estos virus y sus potenciales efectos zoonóticos, así como la importancia de considerar VEEV como un diagnóstico diferencial de dengue, así como en caso de encefalitis virales. Aún más importante, bajos los estándares de una salud: la detección de brotes de encefalitis en caballos podría servir como un sistema de alerta temprana para posibles casos de encefalitis transmitida por vectores en humanos. 50 REFERENCIAS Aguilar, P. V., Robich, R. M., Turell, M. J., O’Guinn, M. L., Klein, T. A., Huaman, A., Guevara, C., Rios, Z., Tesh, R. B., Watts, D. M., Olson, J., & Weaver, S. C. (2007). Endemic eastern equine encephalitis in the Amazon region of Peru. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 76(2), 293–298. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17297038 Aguilar, P. V, Estrada-Franco, J. G., Navarro-Lopez, R., Ferro, C., Haddow, A. D., & Weaver, S. C. (2011). 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