UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS (BAL) AISLADAS DE ENSILADOS DE PIÑA COMO MICROORGANISMOS CON POTENCIAL PROBIÓTICO Y DETERMINACIÓN DE SU APLICABILIDAD COMO CULTIVO BIOPROTECTOR EN LECHE AGRIA Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Ciencia de Alimentos para optar al grado y título de Maestría Académica en Ciencia de Alimentos JANNETTE WEN FANG WU WU Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2020 II Dedicatoria Dedico esta tesis a mis padres Sheng-Hsiung Wu Chen y Pi-Yueh Wu Lee, por brindarme todo su apoyo en todo momento; a mí hermana Judy, por su guía y a todas aquellas personas que formaron parte de esta experiencia. III Agradecimientos A mi equipo asesor: Natalia, Jessie y Mauricio, por su guía y apoyo en todo momento, especialmente durante los últimos meses de incertidumbre. A Vanny, Meli, Laura, Fani, Evelyn y Alejandra por ser grandes compañeras y amigas, y por las tardes de café y las carreras entre cursos y trabajos, los chistes y los consejos. A Adrián y a Mariajo, por escucharme en mis momentos de frustración y darme palabras de aliento, para seguir adelante. A Giova y Luis que, como siempre, estuvieron ahí para ayudar cuando más se les necesitó. A Alonso por su ayuda en planta. A Juan Carlos, por las tardes de socialización con café, y por su apoyo “psicológico” en momentos de estrés. A los compañeros del Laboratorio de Microbiología de Aguas, por su amabilidad y disposición a ayudar en todo momento. Y por último, gracias a todas aquellas personas que, por mi falta de elocuencia o atención, no mencione anteriormente, pero que fueron parte de este proceso de una u otra forma. IV V Tabla de contenidos DEDICATORIA .............................................................................................................................................. II AGRADECIMIENTOS ................................................................................................................................. III HOJA DE APROBACIÓN............................................................................................................................. IV RESUMEN .................................................................................................................................................... VII LISTA DE CUADROS ................................................................................................................................ VIII LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................................................... IX LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................................................ X 1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................... XI 2. OBJETIVO .................................................................................................................................................... 5 2.1. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................................................... 5 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................................................... 5 3. MARCO TEÓRICO ..................................................................................................................................... 6 3.1. MICROORGANISMOS PROBIÓTICOS ..................................................................................................... 6 3.1.1. Definición de un probiótico ...................................................................................................... 6 3.1.2. Criterios para la definición de un microorganismo probiótico ................................................ 9 3.1.3. Características genéticas y fisiológicas de bacterias lácticas ................................................ 12 3.1.4. Resistencia a antibióticos ....................................................................................................... 15 3.1.5. Grupo Lactobacillus casei ...................................................................................................... 20 3.1.5.1. Propiedades funcionales y antimicrobianas de L. casei ......................................................... 21 3.1.5.1.1. Bacteriocinas y otros compuestos con potencial antimicrobiano ...................................... 23 3.2. EFECTO BIO-PROTECTOR .................................................................................................................. 24 3.3. PRODUCTOS LÁCTEOS FERMENTADOS .............................................................................................. 25 3.3.1. Leche agria ............................................................................................................................. 25 4. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................................. 27 4.1. Localización del proyecto ........................................................................................................... 27 4.2. Aislamientos bacterianos ............................................................................................................ 27 4.3. IDENTIFICACIÓN DE BAL CON MARCADORES MOLECULARES ......................................... 27 4.3.1. Extracción de material genético ............................................................................................. 27 4.3.2. Amplificación por PCR ........................................................................................................... 28 4.3.3. Análisis de secuencias ............................................................................................................ 28 4.4. DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGÓNICA IN VITRO CONTRA SALMONELLA SP. Y LISTERIA MONOCYTOGENES ......................................................................................................... 29 4.4.1. Evaluación de efecto antagónico determinado en placa. ....................................................... 29 4.4.2. Ensayos de actividad inhibitoria del sobrenadante. ............................................................... 30 4.4.3. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGÓNICA DE L. CASEI _6714 A NIVEL DE CULTIVO CELULAR CONTRA CEPAS ENTERO-INVASIVAS DE SALMONELLA TYPHIMURIUM. ......................................................................................................................................... 331 4.4.3.1. Cultivo de líneas celulares...................................................................................................... 31 4.4.3.2. Evaluación de la capacidad de adhesividad de L. casei_ 6714 .............................................. 32 4.4.3.3. Evaluación del efecto antagónico contra patógenos invasivos .............................................. 32 4.4.3.4. Análisis de resultados ............................................................................................................. 33 VI 4.5. EVALUACIÓN DE SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS DE L. CASEI_6714 ........................ 33 4.6. EFECTO DE L. CASEI_6714 SOBRE CRECIMIENTO DE L. MONOCYTOGENES Y LA FERMENTACIÓN EN LECHE AGRIA ARTESANAL. ........................................................................... 34 4.6.1. Cultivos iniciadores ................................................................................................................ 34 4.6.2. Preparación de la matriz ........................................................................................................ 35 4.6.3. Evaluación del efecto bioprotector. ........................................................................................ 36 4.6.4. Análisis estadístico ................................................................................................................. 36 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................................ 38 5.1. IDENTIFICACIÓN DE BAL CON MARCADORES MOLECULARES ......................................... 38 .......................................................................................................................................................................... 41 5.2. DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGÓNICA IN VITRO CONTRA SALMONELLA SP. Y LISTERIA MONOCYTOGENES ......................................................................................................... 42 5.2.1. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGÓNICA DE L. CASEI _6714 A NIVEL DE CULTIVO CELULAR CONTRA CEPAS ENTERO-INVASIVAS DE SALMONELLA TYPHIMURIUM. ........................................................................................................................................... 45 5.3. EVALUACIÓN DE SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS DE L. CASEI_6714 ........................ 47 5.4. EFECTO DE L. CASEI_6714 SOBRE CRECIMIENTO DE L. MONOCYTOGENES Y LA FERMENTACIÓN EN LECHE AGRIA ARTESANAL ............................................................................ 49 6. CONCLUSIONES .................................................................................................................................. 58 8. RECOMENDACIONES………………………………………………………………………………………………………………..59 8. BIBLIOGRAFÍA CITADA ................................................................................................................... 60 9. ANEXOS……………………………………………………………………………………………………………………………79 VII Resumen Los probióticos son suplementos alimentarios, generalmente bacterianos, que benefician la salud del consumidor al ser ingeridos en cantidades específicas. La selección de un organismo como probiótico requieren de estudios in vitro e in vivo que permiten asegurar su funcionalidad y seguridad. El objetivo de este trabajo fue el aislar e identificar, con marcadores moleculares, BAL presentes en ensilados de subproductos industriales de piña para, posteriormente, evaluar su potencial aplicación como probiótico y aditivo bioprotector en la industria de alimentos. Para la identificación molecular de los aislamientos, se amplificó previamente el gen ribosomal 16S, además, se utilizó el gen fenilalanina sintetasa (pheS). Se aislaron un total de 12 BAL que fueron identificadas como: L. fermentum (2), L. casei (7), Weissella ghanensis. (1) y L. parafarraginis (2). Se determinó que presentaban una capacidad antagónica in vitro significativa (p < 0.0001) contra cepas Salmonella sp. y L. monocytogenes. Además, se observó que una cepa seleccionada (L. casei_6714) demostró ser efectiva en la reducción de la inva sividad de Salmonella serovar Typhimurium en células HeLa. La misma cepa fue evaluada como bioprotector contra L. monocytogenes en leche agria elaborada artesanalmente en donde se comparó su efecto contra un cultivo iniciador y se observó una acidificación más acelerada y un leve efecto en la reducción de la población del patógeno. VIII Lista de cuadros Título Página Cuadro I. Cepas de bacterias probióticas más comunes, origen de aislamiento, efecto terapéutico comprobado y productos en los que se pueden utilizar. 8 Cuadro II. Miembros más comunes de las bacterias lácticas. 15 Cuadro III. Antibióticos de uso común clasificados según su mecanismo de acción 17 Cuadro IV. Iniciadores seleccionados para la identificación de las cepas de Lactobacillus sp 28 Cuadro V. Bacterias utilizadas en la selección del método de inoculación del patógeno óptimo. 30 Cuadro VI. Antibióticos que se evaluaron durante la prueba de susceptibilidad de las BAL. 34 Cuadro VII. Designación de tratamientos para las pruebas de efecto bioprotector de las BAL en leche agria. 35 Cuadro VIII. Halos de inhibición observados contra Salmonella sp. y L. monocytogenes en los ensayos de antagonismo contra las bacterias ácido lácticas (BAL). 42 Cuadro IX. Valores de absorbancia a 620 nm obtenidos en la determinación de la actividad antimicrobiana del sobrenadante de L. casei _6714 contra Salmonella sp. y L. monocytogenes (promedio ± desviación estándar, n = 3) 44 Cuadro X. Adhesión de L. casei _6714 a células HeLA por campo microscópico. 45 Cuadro XI. Efecto antagónico de L. casei_ 6714 contra la invasión de Salmonella Typhimurium a células HeLa (promedio ± desviación estándar) 47 Cuadro XII. Determinación de la resistencia-susceptibilidad a antibióticos seleccionados sobre L. casei_6714 (promedio ± desviación estándar, n = 3). 48 Cuadro XIII. Valores promedio de la población estabilizada de BAL en las muestras de leche agria a las 24 horas (promedio + desviación estándar, n = 2). 52 Cuadro XIV. Pendientes de las curvas de reducción de L. monocytogenes en las muestras de leche agria (n =2). 56 IX Lista de figuras Título Página Figura 1. Diagrama de flujo para la preparación de las muestras de leche agria a ensayar. Los inóculos se adicionaron según la distribución de tratamientos a evaluar (Cuadro VI). 36 Figura 2. Árbol filogenético que se realizó utilizando las secuencias del gen fenil alanil- ARNt sintasa (pheS) (420 nt). En negrita se muestran las secuencias de este trabajo. Se utilizó L. delbrueckii subsp. lactis KTCT 3034 como grupo externo. 41 Figura 3. Curva de crecimiento de las BAL para los diferentes tratamientos de leche agria (n = 2). Nota: Los tratamientos corresponden a: cultivo iniciador (control negativo, T1); cultivo iniciador + BAL (T2); BAL + L. monocytogenes (T3); cultivo iniciador + L. monocytogenes (T4) y cultivo iniciador + BAL + L. monocytogens (T5); A y B corresponden a las repeticiones 51 Figura 4. Comportamiento del pH durante la fermentación de la leche agria Nota: Los tratamientos corresponden a: cultivo iniciador (control negativo, T1); cultivo iniciador + L. casei_6714 (T2); L. casei_6714 + L. monocytogenes (T3); cultivo iniciador + L. monocytogenes (T4) y cultivo iniciador + L. casei_6714 + L. monocytogens (T5); A y B corresponden a las repeticiones. 54 Figura 5. Curva de crecimiento de L. monocytogenes en los diferentes tratamientos evaluados durante la elaboración de leche agria (n = 2) donde T3 corresponde al co- cultivo de L. casei_6714 y L. monocytogenes; T4 corresponde al co-cultivo del cultivo iniciador y L. monocytogenes; y T5 corresponde al co-cultivo de L. casei_ 6714 + cultivo iniciador + L. monocytogenes; A y B corresponden a las repeticiones. 65 Figura 6. Fotografías de las placas y los halos de inhibición observados en L.monocytogenes y Salmonella sp. para las BAL evaluadas (nota: únicamente con carácter representativo). 80 Figura 7. Fotografías de las células HeLa observadas en el ensayo de adhesividad, donde: (A) Control, (B) es el tratamientos con L. casei_ 6714 y (C) L. fermentum_6702. Nótese la diferencia en la acumulación de bacterias a nivel de la superficie celular. 81 X Lista de abreviaturas Abreviatura Siginificado AND Ácido desoxirribonucleico. AICC Agar infusion cerebro corazón. AL Ácido láctico. ARN Ácido ribonucleico. ATP Adenosin trifosfato. BAL Bacteria ácido láctica. CDC Centro de Control de Enfermedades, siglas en inglés. CTS Caldo tripticasa de soya. SDS Dodecilsulfato sódico. EFSA Autoridad Europea de Inocuidad Alimentaria, siglas en inglés. EMP Embden- Meyerhof- Parnas. EMEM Medio esencial mínimo de Eagle, siglas en inglés. ETA Enfermedad de transmisión alimentaria. EDTA Etilendiaminotetraacético. FAO Organización de las Naciones unidas para la Alimentación y la Agricultura Familia ABC ATP –binding- casette. GRAS Generalmente considerado como seguro, siglas en inglés. INCIENSA Instituto Costarricense de Investigación y Enseñanza en Nutrición y Salud. LPS Lipopolisacárido MIC Concentración mínima inhibitoria, siglas en inglés. MRS Medio DeMan- Rogosa- Sharpe. OMS Organización Mundial de la Salud. PCR Reacción en cadena de la polimerasa, siglas en inglés. QPS Presunción Calificada de Inocuidad. TGI Tracto gastrointestinal XLD Medio Xilosa-Lisina-Deoxicolato. 1 1. Introducción La comercialización y consumo de alimentos funcionales presentan un crecimiento importante en el mercado nacional y mundial; en la actualidad, es posible encontrar una gran variedad de productos disponibles en los comercios (Vijaya et al., 2015). Los alimentos funcionales son elaborados a partir de ingredientes naturales que tienen propiedades terapéuticas declaradas y comprobadas con respaldo científico. Uno de los alimentos funcionales más comunes y mejor conocidos son aquellos que contienen probióticos. Los probióticos son suplementos alimentarios; por lo general, son bacterias, que benefician la salud del consumidor al ser ingeridos en cantidades especificas (Kullisaar et al., 2006; Kumar et al., 2015). Estos suplementos se han asociado a diversos efectos beneficiosos para la salud (de Vrese & Offick, 2010; Isolauri et al., 2002; Leahy et al., 2005) y suelen estar constituidos por diversas cepas microbianas con características específicas comprobadas (Isolauri et al., 2002); además de sus beneficios como ingredientes funcionales, se utilizan de una forma muy amplia en diversos productos fermentados para la obtención de propiedades físicas y sensoriales de mucho interés (Granato et al., 2010). La categorización de un microorganismo como probiótico requiere de diversos estudios in vitro e in vivo que proveen indicadores que pueden ser luego extrapolados para estimar su comportamiento en el entorno real (Jensen & Science, 2014; Todorov et al., 2012). La mayoría de los probióticos comerciales y cepas estudiadas son especímenes aislados de productos lácteos fermentados, o bien, aislados del sistema digestivo del ser humano. Por diversas razones, en estudios recientes ha surgido el interés en la identificación de probióticos aislados de “fuentes no convencionales” tales como como material vegetal (Jonganurakkun et al., 2008; Kang et al., 2009) o bebidas fermentadas no lácteas (Ranadheera et al., 2017). Estudios recientes sobre la microbiota intestinal humana sugieren que cambios en las comunidades bacterianas pueden aumentar la predisposición a diferentes trastornos fisiológicos (Shreiner et al., 2015; Valdes et al., 2018). Los microorganismos probióticos pueden ayudar a restaurar la microbiota intestinal e introducir funciones beneficiosas que resultan en la prevención de algunos fenotipos que se han asociado a enfermedades sistémicas o intestinales (Hemarajata & Versalovic, 2013; Valdes et al., 2018), tales como la reducción 2 de síntomas de inflamación por medio de la modulación de respuesta inmunológica (Lavasani et al., 2010). Además, los probióticos pueden producir efectos preventivos y terapéuticos ante diferentes etiologías como la diarrea, por lo que se han convertido en factor de interés tanto a nivel de industria alimentaria como en aplicaciones farmacéuticas para restaurar la microbiota intestinal o compensar otras disfunciones gastrointestinales (Arias et al., 2013; de Vrese & Offick, 2010; Hütt et al., 2006; Nagendra, 2007). En los últimos años, se han utilizado productos y/o alimentos enriquecidos con microorganismos probióticos para el control y prevención de la diarrea después de tratamientos con antibióticos y como reconstituyentes del microbioma intestinal. También se han utilizado para la supresión de la diarrea de viajero y para tratar diarrea infantil (Amara & Shibl, 2015). Estudios preliminares mostraron que bacterias probióticas podrían inhibir la colonización de Helicobacter pylori, microorganismo asociado con la producción de gastritis, úlceras y cáncer gástrico en modelos murinos (Aiba et al., 1998; García et al., 2017; Macfarlane & Cummings, 2002; Servin, 2004), así como muchas otras patologías que van desde alergias alimentarias hasta hipercolesterolemia, enfermedades cardiovasculares y trastornos autoinmunes como el Síndrome Guillain Barré (Bourrie et al. 2016; Valdes et al. 2018). Por estos motivos, las bacterias probióticas han llegado a adquirir un papel importante en la lucha y la prevención contra enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs). Debido a las necesidades actuales del mercado, el identificar nuevos microorganismos con potencial biotecnológico es importante; a pesar de esto, estas cepas deben ser caracterizadas de forma que se evalúen propiedades indispensables tales como su sobrevivencia en condiciones extremas del sistema digestivo (García et al., 2017; Hernández-Alcántara et al., 2018) y/o su sobrevivencia en etapas posteriores del proceso digestivo (García-Ruiz et al., 2014). A nivel mundial, Salmonella sp. es una de las causas más comunes de intoxicación alimentaria. Las personas enfermas pueden presentar síntomas alrededor de 4 a 7 días después de consumir el alimento contaminado y suele ser un cuadro autolimitado, sin embargo, la salmonelosis puede tener consecuencias graves en la población vulnerable (Food Safety Gov, 2017). En el país, los casos asociados a salmonelosis son muy comunes. Datos reportados por INCIENSA (2013), muestran que, de un total de 235 aislamientos de Salmonella sp. procedentes de muestras clínicas, un 31,9 % corresponden a S. enteritidis, 3 15,3 % a S. Typhimurim y 4,3 % a S. Typhimurium var. Copenhagen. Los brotes se presentaron en poblaciones de todas las edades y sexos, con una distribución por todo el país y en su mayoría estuvieron asociados al consumo de alimentos contaminados. Con respecto a Listeria monocytogenes, el país no cuenta con información sobre brotes ocasionados por este organismo; empero, datos del Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés) en los Estados Unidos, entre los años 2012 -2018 se reportan varios brotes localizados e interestatales de listeriosis asociados con productos lácteos procesados, principalmente quesos, ensaladas preparadas, jamón y productos derivados de cerdo. El género Listeria sp. es comúnmente aislado en productos lácteos y vegetales, tiene una amplia distribución en el medio ambiente, por lo que la contaminación con estas bacterias puede darse muy fácilmente (Food Safety Gov, 2018). Listeria monocytogenes se desarrolla en plantas de procesamiento y se ha observado que es capaz de sobrevivir y crecer a bajas temperaturas. Su rango de crecimiento es de 10 - 42 °C, con un óptimo de entre 20 – 35 °C (Food Safety Gov, 2018). Las BAL que presentan características promisorias, han mostrado efectos antagonistas con una gran efectividad en el control tanto de L. monocytogenes como Salmonella sp., por lo que adquieren un interés adicional como probióticos (Sanders et al., 2010). En la actualidad, muchos de los estudios que se están realizando están enfocados en la búsqueda de cepas probióticas con propiedades específicas, así como tecnologías que permitan optimizar su producción. La selección del microorganismo, el uso de prebiótico y las matrices alimentarias que sirvan de vehículo durante la formulación y desarrollo de alimentos probióticos son esenciales para maximizar la eficacia funcional del probiótico durante la manufactura, almacenamiento y post ingestión (Granato et al., 2010; Gueimonde & Sánchez, 2012; Nagendra, 2007). De hecho, Ranadheera et al. (2010) reportan que existe un efecto sinérgico entre las matrices alimentarias y el microorganismo durante el procesamiento y en el ambiente gastrointestinal. Además de sus propiedades funcionales, las BAL se reconocen por sus propiedades bio-preservativas, ya que es posible obtener de las mismas la producción de distintos compuestos antimicrobianos tales como el ácido láctico (AL), diacetilo, bacteriocinas y otros metabolitos (Rouse & van Sinderen, 2008). Dadas las exigencias actuales de los consumidores por productos saludables, frescos y naturales que sean libres de aditivos 4 químicos, el uso de bacterias bioprotectoras como las BAL, para aumentar la calidad y vida útil de los productos, ha adquirido un fuerte interés (Castellano et al., 2008). Bajo las premisas antes expuestas, al estudiar el efecto bioprotector en combinación con las propiedades funcionales propias de BAL con potencial probiótico, que se han aislado de residuos de agroindustria del país, se podría obtener información invaluable para el desarrollo de aplicaciones innovadoras que puedan ser integradas a las tendencias del mercado actual. Con el objetivo de alcanzar el máximo beneficio de este tipo de productos, es de vital importancia que se estudien diversos aspectos como el perfil funcional y fisiológico de estos microorganismos y se evalué su interacción a nivel del producto. Ante este panorama, esta investigación consistió en expandir el conocimiento existente con respecto a las BAL que fueron aisladas de residuos agroindustriales, específicamente ensilados de piña, con la finalidad de evaluar su potencial probiótico y bioprotector, de forma que se logre sentar una base para estudios futuros. 5 2. Objetivo 2.1.Objetivo general Identificar y ccaracterizar según su potencial probiótico, BAL aisladas de ensilados de piña y determinar su aplicación como cultivo bioprotector en el procesamiento de leche agria artesanal. 2.2.Objetivos específicos 1. Identificar con marcadores moleculares BAL aisladas de ensilados elaborados a partir de subproducto industrial de piña. 2. Determinar la capacidad antagónica in vitro de las BAL aisladas contra Salmonella sp. y Listeria monocytogenes. 3. Evaluar la resistencia de la cepa L. casei _6714 a diferentes antibióticos de uso común. 4. Describir el efecto bioprotector de la cepa L. casei _6714 sobre L. monocytogenes en leche agria artesanal. 6 3. Marco teórico 3.1. Microorganismos probióticos 3.1.1. Definición de un probiótico La descripción etimológica de la palabra probiótico es “para la vida” y en la actualidad se utiliza para describir diversos grupos microbianos que pueden ser utilizados en la dieta de animales y humanos (FAO/WHO, 2006). Este concepto de funcionalidad nace de las observaciones originales del científico y ganador del premio Novel, Eli Metchnikoff, con respecto al rol que jugaban ciertas bacterias en el funcionamiento del sistema gastrointestinal (Anukam & Reid, 2007). Según Metchnikoff (1907), la dependencia de la microbiota intestinal y su interacción a nivel fisiológico con los alimentos hace posible adoptar medidas de consumo, que permitan modificar su diversidad en el tracto gastrointestinal, con el fin de garantizar la presencia de microorganismos beneficiosos. Años más tarde, el pediatra francés Henry Tissier observó que las muestras fecales de niños con diarrea presentaban un bajo recuento de bacterias de cierto morfotipo, mientras que, en niños saludables, ese mismo morfotipo se observaba en abundancia, por lo que sugirió que la administración de dichos microorganismos podría ayudar en la restauración de la salud intestinal (Mavroudi, 2012; Tissier, 1906). Los estudios realizados por Metchnikoff y Tissier fueron los primeros en establecer el concepto base del término probiótico; mas no fue hasta años después que la palabra se estableció como tal. Después de esto, diversos autores han propuesto distintas definiciones para estos organismos. Fuller (1989), con el objetivo de resaltar la naturaleza microbiana de los agentes, definió la palabra como un suplemento alimenticio vivo que beneficia al hospedero por medio de la mejora del balance intestinal; años más tarde Havenaar y Huis In’t Veld (1992) propusieron que se trataba de una mezcla de uno o más organismos viables, que al ser administrados a un animal o humano, beneficiaban al hospedero al promover las propiedades de la flora indígena. Según Latha, et al. (2015) el concepto actual no dista mucho de estas primeras definiciones y como se mencionó antes, los microorganismos probióticos son ingredientes funcionales que pueden ser agregados a gran diversidad de alimentos, deben ser consumidos en dosis de al menos 6 logaritmos a lo largo del tiempo, y pueden producir efectos fisiológicos deseables en el consumidor (Gueimonde & Sánchez, 2012; Kullisaar et al., 2006; Rezac et al., 2018). 7 Entre los efectos beneficiosos que se han asociado al consumo de probióticos se destaca el mantenimiento de una microbiota intestinal sana, la modulación y mejora de síntomas asociados con la intolerancia a la lactosa, mejorías en la función renal, bienestar digestivo, prevención y alivio de trastornos digestivos como el colon irritable y la diarrea, reducción de los niveles de colesterol, regulación de la respuesta inmune e inclusive, el tratamiento de enfermedades neuro-psiquiátricas (de Vrese & Offick, 2010; Isolauri et al., 2002; Leahy et al., 2005). Los organismos probióticos pueden ser utilizados en forma individual o en mezclas sinérgicas de dos o más cepas dadas, su aplicación depende del efecto deseado a nivel terapéutico o sensorial del producto (Charalampopoulos & Rastall, 2009). La gran mayoría de los microorganismos probióticos son bacterias. Entre las cepas más comunes se encuentran los géneros Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus y Bifidobacterium (Isolauri et al., 2002). Además de las características ya mencionadas, estas bacterias se utilizan también como cultivos iniciadores en diversos productos fermentados (Latha et al., 2015). El Cuadro I muestra la información asociada a organismos probióticos y sus orígenes, así como sus aplicaciones más comunes. A pesar del gran número existente de cepas comerciales, la investigación en busca de nuevas cepas se ha convertido en una necesidad con el fin de mejorar los procesos y sus aplicaciones (Gilliland, 2002). 8 Cuadro I. Cepas de bacterias probióticas más comunes, origen de aislamiento, efecto terapéutico comprobado y productos en los que se pueden utilizar. Cepa Origen Efecto terapéutico Productos aplicables Bifidobacterium sp. Aislamiento fecal de infantes Desplazamiento de bacterias patógenas. Alivio de estreñimiento, eczema y colon irritable Yogurt, encapsulados, leches en polvo Clostridium butyricum 588 Aislamiento de suelo Modificación del microbioma. Efectivo para desorden autista autoinmune e infecciones de Helicobacter pylori Encapsulados Bebidas fortificadas Lactobacillus acidophilus Lb Aislamiento intestinal Alivio de síntomas de diarrea Vegetales fermentados, encapsulados Lactobacillus casei subsp Shirota Aislamiento de heces humanas Previene la colonización de patógenos Yogurt y otras leches fermentadas Lactobacillus plantarum 299v (DSM9843) Aislado de colon humano Reducción de inflamación Vegetales fermentados, encapsulados Lactobacillus rhamnsosus GG (ATCC 53013) Aislamiento fecal Mejora el microbioma del colon Encapsulados, leches fermentadas L. rhamnosus CNCM I- 1720 Aislamiento de producto lácteo Tratamiento de úlcera pépticas Leches fermentadas L. helveticus CNCM I- 1722 Aislamiento de producto lácteo Tratamiento de úlceras pépticas Leches fermentadas Saccharomyces boulardii CNCM I-745 Aislamiento de fruta (lychee) Alivio de síntomas de diarrea, infección de H. pylori Encapsulados Adaptado de: McFarland, 2015. 9 3.1.2. Criterios para la definición de un microorganismo probiótico La identificación de candidatos para ser considerados microorganismos probióticos viables es un proceso intensivo y complejo en el que se procura verificar varios criterios básicos. Por lo general, estos criterios o propiedades se agrupan en cinco amplias categorías (McFarland, 2015): a) Sobrevivencia en el órgano objetivo. Las pruebas realizadas en esta categoría van a depender del órgano meta al que debe llegar el organismo. Por lo general, la gran mayoría de los probióticos deben de sobrevivir el tránsito digestivo en la vía boca-colon (Charalampopoulos & Rastall, 2009; Zago et al., 2011). Esto implica que las cepas en estudio deben de ser evaluadas en sistemas simulados del tránsito intestinal para poder determinar su capacidad de tolerancia a enzimas antimicrobianas como las lisozimas y la tolerancia a pH muy bajos como las del ambiente gástrico y la bilis (Pan et al. , 2009). Una vez corroborado esto, las cepas promisorias deben ser estudiadas en un modelo in vivo en el cual los organismos no solo se enfrenten a estos ambientes físicos, sino que también se afronten a la competencia del microbioma normal de un ser vivo (McFarland, 2015). b) Interacción con el sistema hospedero. En general, el probiótico ideal debe tener interacciones beneficiosas con el organismo que lo consume; estas interacciones pueden ser con respecto a procesos metabólicos propios del individuo o bien ante factores externos, tales como la dieta o el tratamiento con medicamentos (Benítez- Páez & Sanz, 2017). Idealmente, las cepas probióticas deben ser poco afectadas por medicamentos concomitantes o antibióticos que se consumen de forma simultánea con el probiótico, de forma que se pueda asegurar su sobrevivencia en el tracto intestinal después del tratamiento (Gueimonde et al., 2013; Kumar et al., 2015; McFarland, 2015). Los antibióticos pueden prevenir el crecimiento o eliminar un microorganismo por diversos mecanismos y, desde su descubrimiento, se mantienen como una de las principales estrategias terapéuticas utilizadas para el tratamiento de diversas etiologías infecciosas en el ser humano y animales 10 (Imperial & Ibana, 2016; Nami et al., 2015). Para poder definir a un organismo potencialmente probiótico bajo el criterio de resistencia a los antibióticos se deben evaluar las propiedades innatas de los organismos que les permiten tener la resistencia; por ejemplo Accharomyces boulardii es una levadura que tiene función como probiótico, debido a su naturaleza, solo se ve afectada por antifúngicos y, por ende, los antibióticos no tienen efecto sobre ella, por lo que posee una resistencia intrínseca (McFarland, 2015). Por lo general, las bacterias que se muestran promisorias como probióticos, deben ser evaluadas en pruebas de susceptibilidad a diversos antibióticos de uso común, que permitan determinar su grado de sensibilidad o resistencia. De manera ideal, los organismos deberían presentar resistencia; sin embargo, la misma deberá ser intrínseca o inherente, y de ninguna forma transferible a otras bacterias por procesos de transferencia horizontal de genes tales como transformación, transducción o conjugación, para evitar la incidencia de resistencia generalizada ante un fármaco (Kumar et al., 2015; Sharma et al., 2014). c) Actividad antipatogénica. La capacidad de inhibir o interferir en el mecanismo de infección de un organismo patógeno es una característica clave para una bacteria con características probióticas promisorias; a pesar de esto, no todos los probióticos tienen un efecto directo contra el patógeno. El antagonismo de los probióticos es muy diverso, y, en muchos casos, se desconoce a ciencia exacta su mecanismo, aunque se asocia a dos posibles rutas: (a) la regulación del sistema inmunológico (McFarland, 2015) y (b) la producción de antimicrobianos en su metabolismo. Muchos de los efectos antimicrobianos se han asociado a la producción de AL y ácido acético, como producto del metabolismo de carbohidratos. El incremento en la concentración de estas sustancias genera una disminución del pH del medio, ocasiona una inhibición en el crecimiento de diversos microorganismos patógenos y disminuye la probabilidad de deterioro de los alimentos (Klewicki & Klewicka, 2004; Lee & Salminen, 1995). Algunos autores sugieren que una alta actividad antimicrobiana de cepas como Lactobacillus sp. y Bifidobacterium sp. ante Salmonella enterica Typhimurium y 11 Escheriquia coli O157:H7 se debe principalmente a la presencia de ácidos orgánicos; además, hay evidencia que sugiere una producción de otros metabolitos como las bacteriocinas que favorecen el efecto inhibitorio(Gálvez et al., 2011; Montero Castillo et al., 2015; Pinar & Yalçin, 2015). Por otra parte, los probióticos modulan la microbiota del comensal aportando variabilidad beneficiosa a la diversidad que la compone y crean mayor competencia por sitios de unión, receptores y nutrientes, desfavoreciendo la proliferación de patógenos (Arias et al., 2013; Fayol-Messaoudi et al., 2005). Este tipo de interacciones pueden ser estudiadas a nivel in vitro por medio de ensayos de efecto inhibitorio y de cultivo celular. Los ensayos de efecto inhibitorio, se pueden realizar con medios de cultivo, que permiten determinar el grado de efectividad que presenta cierto microorganismo sobre el crecimiento de un patógeno seleccionado (Shukla & Sharma, 2015; Sousa et al., 2013); mientras que el uso de cultivos celulares permite visualizar la interacción que ocurre entre el microorganismo y las células del tejido que se está estudiando, de manera que se obtiene una mejor idea de lo que sucede, tanto a nivel tisular, como durante un proceso de infección (Tsai et al., 2005; Gopal et al., 2001). d) Inocuidad. Es importante mencionar que todo organismo que desee utilizarse como un potencial probiótico debe ser inocuo y seguro (GRAS, por sus siglas en inglés). La verificación del riesgo de un organismo nuevo puede hacerse por diversos métodos. El más simple es quizás la determinación de su identidad taxonómica, se puede realizar su identificación a nivel de especie y asociarlo de esta manera con cepas de interés (Sanders et al., 2010). Dentro de esta categoría, también se debe considerar el riesgo de transmisión de genes de resistencia (H. Kumar et al., 2015) y su estabilidad genética. La estabilidad genética de una cepa probiótica refleja la susceptibilidad del organismo a experimentar rearreglos genómicos que se dan por evolución. Los mismos pueden causar variaciones específicas o aleatorias mediante mutación, deleción o inserción; se originan por mecanismos como la recombinación homóloga o transferencia horizontal, lo que puede causar que el organismo y/o sus características cambien (Sanders et al., 2010). Existen diversas iniciativas que buscan asegurar la inocuidad de los 12 probióticos destinados al consumo humano; sin embargo, en la actualidad, a pesar de que existe, por ejemplo, una guía de regulación para aditivos alimentarios de origen microbiano, hasta el momento no existe una guía normalizada para organismos asociados a alimentos. Algunos ejemplos de estas normativas son la Autoridad Europea de Inocuidad Alimentaria (EFSA), que ha planteado guías de referencia que pueden ser utilizadas para su regulación. En la actualidad EFSA utiliza un sistema de Presunción Calificada de Inocuidad (QPS, por sus siglas en inglés) que le permite determinar la inocuidad de suplementos alimentarios de origen microbiano (European Comission, 2003). Del mismo modo organizaciones como la Organización de las Naciones unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO, por sus siglas en inglés) y la Organización Mundial de la Salud (OMS) han desarrollado diversos proyectos que buscan estandarizar los criterios para el aseguramiento de la inocuidad de los organismos utilizados (Sanders et al., 2010). e) Consideraciones de manufactura. Estos aspectos son importantes para poder definir la aplicabilidad real del organismo. Entre las cosas que se evalúan dentro de esta categoría se consideran la facilidad de producción, estabilidad, vida útil, condiciones de almacenamiento, logística y competitividad (McFarland, 2015). Además se toman en consideración los efectos que puede tener en el alimento o producto en el cual va a ser adicionado y los mecanismos con los que se puede asegurar la viabilidad y efectividad del mismo (Gueimonde & Sánchez, 2012). 3.1.3. Características genéticas y fisiológicas de bacterias lácticas La gran mayoría de los organismos probióticos utilizados en humanos pertenecen al complejo taxonómico de las bacterias acido lácticas (BAL) y bifidobacterias. Estos dos grupos incluyen a un gran número de especies y cepas que presentan propiedades que, aplicadas en el contexto de alimentos y probióticos, son de gran peso. Las BAL son un grupo funcional de microorganismos constituidos por especies Gram-positivas, catalasa negativas, productoras predominantemente de AL como producto del metabolismo fermentativo de carbohidratos (Pot et al., 2014; Salvetti et al., 13 2012). De acuerdo con el género o especie, la BAL podrá fermentar azúcares para producir únicamente AL (homofermentadoras) o bien una mezcla de AL, etanol y dióxido de carbono (heterofermentativas); en algunos casos, existen miembros que pueden presentar un metabolismo mixto (Jackson & Jackson, 2000). La mayoría de las BAL son especies ubicuas de diversos ambientes y suelen constituir la microbiota normal de plantas, seres humanos y animales. En el caso de los dos últimos, las BAL son capaces de colonizar el tracto digestivo y urogenital; además, pueden ser aisladas de diversos productos alimentarios (Hill et al., 2018). El grupo es taxonómicamente muy variado y ha experimentado muchos cambios a lo largo del tiempo. Orla-Jensen (1919) describió los primeros siete géneros del grupo; a pesar de eso, en la actualidad, el único género sobreviviente corresponde a Streptococcus sp. Distintos autores reconocen que el grupo de BAL está conformado por 16 géneros (Cuadro II), de los cuales doce se encuentran vinculados con alimentos (Narvhus & Axelsson, 2003). El género más abundante de BAL conocidas corresponde al grupo Lactobacillus sp., y el mismo se caracteriza por ser un productor importante de AL y sus especies más representativas son de aplicación generalizada en productos alimentarios como cultivos iniciadores o probióticos (Isolauri et al., 2002). Desde un punto de vista taxonómico, Lactobacillus sp. incluye alrededor de 200 especies (Hill et al., 2018; Zheng et al., 2015). Como otras BAL, los lactobacilos son organismos Gram positivos, no esporulados en forma de bastón o cocobacilo, que se caracterizan por tener un metabolismo fermentativo, microaerofílico y quimioorganótrofo que requieren de medios enriquecidos para crecer; son catalasa negativos, aunque pueden tener una cierta capacidad pseudocatalasa en algunas cepas. Considerando la composición de su ADN, por lo general presentan un contenido Guanina-Citosina (GC) menor al 54 % y son ubicuas en el medio ambiente (Felis & Dellaglio, 2014). El género Lactobacillus pertenece al filo Firmicutes y a la familia Lactobacilliaceae; se agrupa dentro de la misma familia que los géneros Paralactobacillus y Pediococcus (Zheng et al., 2015) y es filogenéticamente cercano a Leuconostocaceae. Considerando las características metabólicas, los lactobacilos pueden tener diferentes mecanismos de fermentación (Felis & Dellaglio, 2014): 14 • Homofermentativa obligada: los lactobacilos son capaces de fermentar hexosas para la producción exclusiva de ácido láctico siguiendo la ruta Embden- Meyerhof- Parnas (EMP), mientras que las pentosas y el gluconato no puede ser fermentado debido a la deficiencia de fosfocetolasas. • Heterofermentativas facultativas: los lactobacilos son capaces de degradar hexosas a AL por la vía EMP, pero también pueden degradar pentosas y gluconato, dado que poseen aldolasas y fosfocetolasas. • Heterofermentativas obligados: degradan hexosas por la vía del fosfogluconato y producen lactato, etanol o ácido acético y dióxido de carbono; la mayoría de las pentosas se fermentan por esta ruta. 15 Cuadro II. Miembros más comunes de las bacterias lácticas. Género Características Especies Fuente Productos alimentarios Lactobacillus Bacilo, Gram positivo, catalasa negativa, no esporulado, hetero y homofermentadora L. acidophilus, L. helveticus, L. casei L. plantarum, L. brevis, L. fermentum, L. reuteri Vagina, Tracto gastrointestina l, Materia vegetal fermentada Yogurt Vino Cervezas Queso Ácido láctico Leuconostoc Cocoide, Gram positivo, catalasa negativa, no esporulado, productora de dextrano L. inhae L. kimchii L. lactis Sourdough Col fermentada Vegetales fermentados Dextranos Ácido láctico Sourkraut Enterococcus Cocos, Gram positivo, Catalasa negativa No esporulada Capnofílicos E. faecalis E. faecium Ambiente Productos cárnicos fermentados Enterocina Ácido láctico Streptococcus Coco, Gram positivo, Catalasa negativa, No esporulado S. bovis S. mitis S. oralis S. suis Canal vaginal Tracto gastrointestina l (TGI) Leche bovina Lactato Productos cárnicos fermentados Weisella Cocobacilo, Gram positiva, Catalasa negativa, No esporulado W. fabaria W. confuse W. halotolerans W. hellenica W. kimchii W. paramesenteroides Materia vegetal Vegetales fermentados Jugos fermentados Lactococcus Coco,Gram positiva, no esporulado, No móvil L. lactis Productos lácteos Queso Leches fermentadas Ácido láctico Elaborado a partir de: Fusco et al., 2015; Masood et al., 2011; Narvhus & Axelsson, 2003. 3.1.4. Resistencia a antibióticos Como se mencionó anteriormente, la resistencia a antibióticos es un tema importante dentro del contexto de los probióticos y es uno de los rubros que se toman en consideración cuando se está definiendo el potencial de un nuevo microorganismo. 16 Los antibióticos son fármacos utilizados para prevenir y tratar infecciones bacterianas, y pueden ser de origen sintético o natural (Sharma et al., 2014). Los antibióticos se pueden dividir en cinco grupos según el mecanismo de actividad antimicrobiana que presentan: (1) agentes que inhiben la síntesis de la pared celular, (2) despolarizan la membrana celular, (3) inhiben la síntesis de proteínas (dos mecanismos dependiendo de la subunidad del ribosoma en la que actúan), (4) inhiben la síntesis de ácidos nucleicos e (5) inhiben las rutas metabólicas en las bacterias (Reygaert, 2018). En general, todos los antibióticos utilizados comercialmente para el tratamiento de infecciones caen dentro de alguna de estas categorías como se observa en el Cuadro III. 17 Cuadro III. Antibióticos de uso común clasificados según su mecanismo de acción Mecanismo de acción Antibiótico Inhibición de la síntesis de pared celular β-Lactamas Carbapenam Cefalosporina Monobatamas Penicilina Depolarización de la membrana celular Glicopéptidos Lipopéptidos Inhibición de la síntesis de proteínas Unión a la subunidad 30S ribosomal Aminoglicosidos Tetraciclinas Unión a subunidad 50S ribosomal Cloranfenicol Lincosamidas Macrolidos Oxazolidinona Estreptograminas Inhibición de síntesis de ácidos nucleicos Quinolonas Fluoroquinolona Inhibición de rutas metabólicas Sulfonamida Trimetoprim Fuente: Martinez, 2014; Sharma et al., 2014. La resistencia a los antibióticos ocurre cuando las bacterias y hongos alteran su fenotipo en respuesta al uso de estos medicamentos y desarrollan la capacidad de evadir o inhibir el 18 efecto del fármaco diseñado para eliminarlos, por lo que estos no se ven suprimidos y pueden continuar creciendo y desarrollando la infección (CDC, 2019). Esto implica que las infecciones causadas por estos microorganismos se vuelven sumamente difíciles de controlar, y esto se traduce en consecuencias en la salud pública y económicas. En la actualidad, el uso de antibióticos se ha convertido en la primera línea de defensa contra infecciones; sin embargo, factores como el mayor consumo de medicamentos antimicrobianos, tanto por humanos como por animales, y la prescripción inadecuada (Reygaert, 2018), han causado una aceleración importante en la aparición de la resistencia debido a la presión selectiva que estos agentes ejercen sobre los microorganismos en el ambiente y la alta capacidad de adaptación para su sobrevivencia (Andersson & Hughes, 2010). Los microorganismos, vistos como un conjunto, no necesariamente presentarán susceptibilidad o resistencia de forma uniforme y generalizada ante un antimicrobiano en específico; el grado de resistencia puede presentar variaciones dentro un mismo grupo o entre grupos relacionados, dependiendo del origen y la naturaleza de esa resistencia. Las bacterias como grupo o especie no son necesariamente susceptibles o resistentes de manera uniforme a ningún agente antimicrobiano en particular. Los niveles de resistencia pueden variar mucho dentro de los grupos bacterianos relacionados (Coculescu, 2009). La susceptibilidad y la resistencia generalmente se miden en función de la concentración inhibitoria mínima (MIC, por sus siglas en inglés), la cual se define como la concentración mínima de fármaco que inhibirá el crecimiento de la bacteria (Coculescu, 2009; Martinez, 2014). Por otra parte, el concepto de “susceptibilidad” se ubica en un rango promedio del MIC. Si una especie presenta una susceptibilidad dentro del rango de “Resistencia”, se puede asumir que dicha especie presenta una resistencia intrínseca a ese fármaco (Reygaert, 2018), aunque las bacterias también pueden adquirir genes de resistencia de otros organismos relacionados. El nivel de resistencia varía según la especie y los genes adquiridos. A partir de esta premisa, entonces se puede decir que los fenómenos de resistencia pueden clasificarse en dos tipos; las resistencias naturales o intrínsecas y las resistencias adquiridas. 3.1.4.1. Resistencia intrínseca La resistencia intrínseca, también llamada natural, es aquella que siempre se expresa según la especie, o bien, puede ser inducida después de la exposición a un agente (Reygaert, 19 2018). La resistencia intrínseca se define, entonces, como un rasgo que se comparte de manera universal dentro de una especie bacteriana; dicho rasgo es independiente de la exposición previa al antibiótico y se encuentra codificado dentro de su cromosoma (Martinez, 2014). Algunos ejemplos de mecanismos bacterianos más comunes involucrados en la resistencia intrínseca son, por ejemplo, la permeabilidad reducida de la membrana externa de bacterias Gram negativas, dada por la presencia de lipopolisacárido (LPS), o bien, expresión inducida de bombas de eflujo (Martinez, 2014; Reygaert, 2018) 3.1.4.2. Resistencia adquirida Como su nombre lo sugiere, las resistencia adquirida corresponde a mecanismos de resistencia que los organismos adquieren de otras especies no necesariamente relacionadas por medio de mecanismos de transferencia horizontal de genes, por medio de procesos como transformación, transducción y conjugación (Reygaert, 2018). La adquisición de esos genes puede ser temporal o permanente y la ruta más común por la que se adquieren ese tipo de genes, es por transferencia de plásmidos. Es importante recordar que un plásmido corresponde a una molécula pequeña de ADN en forma circular que tienen la capacidad de autoreplicarse, y, generalmente, contiene un número limitado de genes pequeños asociados a funciones no indispensables y constituyen ventajas competitivas (Bender et al. , 2017; Coculescu, 2009) 3.1.4.3. Susceptibilidad a los antibióticos de las BAL En el caso de las BAL, se ha mostrado un interés importante en su susceptibilidad a los antimicrobianos debido a su amplia distribución en los ambientes, ya que se ha observado la aparición de resistencias asociadas a una exposición ambiental que induce la manifestación de resistencias intrínsecas y extrínsecas que son potencialmente transferibles (Fraqueza, 2015) . Las BAL son organismos altamente adaptables, y muchas especies como L. lactis, Enterococci sp. y Lactobacillus sp., aisladas de productos fermentados han mostrado resistencia a antibióticos como la tetraciclina, eritromicina y vancomicina (Mathur & Singh, 2005). Las BAL son consideradas naturalmente resistentes a ciertos antibióticos, por ejemplo, estudios en aislamiento obtenidos de productos lácteos fermentados encontraron una alta incidencia de Lactobacillus sp. resistentes a la vancomicina, eritromicina, gentamicina y ciprofloxacina (Erginkaya et al., 2018). Sin embargo, estudios posteriores han sugerido que 20 dichos genes de resistencia no son transferibles ( Flórez & Mayo, 2017; Álvarez-Cisneros & Ponce-Alquicira, 2019) 3.1.5. Grupo Lactobacillus casei El grupo L. casei comprende sobre todo tres especies muy relacionadas entre sí: L. casei, L. paracasei y L. rhamnosus. Estas especies se han estudiado por sus aplicaciones comerciales, industriales y su potencial efecto sobre la salud (Hill et al., 2018; Sutula et al., 2013). A nivel comercial, estas especies se utilizan como cultivos iniciadores en procesos fermentativos de distintos alimentos para lograr sabores, texturas y otras características deseables; por otra parte, se ha determinado que son capaces de producir diversos metabolitos bioactivos que presentan beneficios prometedores al ser consumidos. L. casei, al igual que otros miembros de las BAL, es un bacilo de tamaño celular alrededor 0.7-1.1 x 2.0-4.0 µm, Gram-positivo, no esporulado, no móvil, anaerobio facultativo, que carece de citocromos (Holzapfel et al., 2001) y es ubicuo, por lo que puede ser aislado de diversos ambientes que van desde materia orgánica fermentada hasta el tracto intestinal y reproductivo de animales y humanos. Su pH óptimo de crecimiento ronda un valor de 5.5, a pesar de que, como muchas otras BAL, es capaz de tolerar un pH de hasta 2.0; no sintetiza porfirinas y posee un metabolismo estrictamente fermentativo, con ácido láctico como producto mayoritario (Alonso et al. , 2014; Axelsson, 1998; Kandler & Weiss, 1986; Zotta et al., 2014). L. casei forma parte del grupo de especies heterofermentativas facultativas, el cual produce ácido láctico a partir de hexosas, por medio de la vía Embden-Meyerhoff, y, a partir de pentosas, por la ruta del 6 – fosfogluconato/fosfocetolasa (Axelsson, 1998; Kandler & Weiss, 1986). La temperatura óptima de crecimiento es de 35 °C; sin embargo, puede haber crecimiento a temperaturas menores de hasta 15 °C, pero no se da crecimiento importante a temperaturas de 45 °C (Alonso et al., 2014). Es una especie considerada como “fastidiosa” debido a que requiere de complementos adicionales, tales como riboflavina, ácido fólico, pantotenato de calcio y factores de crecimiento, para un desarrollo óptimo (Kandler & Weiss, 1986). El genoma de L. casei está constituido por un cromosoma circular de alrededor 2.9 Mb y un plásmido de 0.029 Mb. El cromosoma principal codifica para al menos 2 751 proteínas (Kang et al., 2017). De acuerdo con Kang et al. (2017), L. casei se confunde con frecuencia con otras especies muy relacionadas tales como L. paracasei y L. rhamnosus debido a la alta 21 similitud de sus genes. Lo anterior dificulta su identificación y clasificación por métodos genéticos y, por ende, su discriminación (Bottari et al., 2017). Se han planteado métodos de identificación utilizando los genes distintos al 16S, como, por ejemplo, genes que codifican para el factor de elongación Tu (tuf), la proteína recA, la subunidad alfa de ARN polimerasa (rpoA), la prolin imino peptidasa (pepR), proteína chaperona dnaK y dnaJ/dnaK. En su estudio, Bottari et al. (2017) compararon los genes anteriormente mencionados, con la identificación obtenida a partir del gen 16Sr, y se determinó que, de 19 cepas de L. casei, solo 16 coincidieron en los otros genes distintos del 16S; de la misma forma, de 35 cepas de L. paracasei, 31 se corroboraron como miembros de la especie, dos correspondieron a L. casei, una fue re-identificada como L. rhamnosus y una cepa obtuvo resultados ambiguos; para el caso de L. rhamnosus, de las 12 cepas estudiadas, únicamente seis fueron corroboradas, y, de las restantes, una se identificó como L. casei y las demás produjeron resultados ambiguos. Lo anterior demuestra que la similitud genética entre las especies es realmente alta. Otra característica importante de mencionar es su adaptación al medio donde se encuentre. Toh et al. (2013) realizaron una comparación de los genomas de distintas cepas de L. casei, L. paracasei y L. rhamnosus aisladas de productos lácteos y determinaron que el cromosoma de estas bacterias presentaba genes exclusivos que favorecían una rápida adaptación al medio. Estas características son de interés para el desarrollo de aplicaciones tecnológicas. 3.1.5.1.Propiedades funcionales y antimicrobianas de L. casei Como se mencionó antes, L. casei es un grupo genéticamente muy heterogéneo y con una alta capacidad adaptativa, lo que permite colonizar diversos ambientes naturales o artificiales, creados por el hombre. Las cepas de L. casei han sido ampliamente estudiadas con respecto a sus propiedades como promotoras de beneficios en la salud, por lo que la industria de alimentos ha mostrado un interés importante en evaluar la viabilidad de las cepas en diversos productos debido a sus numerosas propiedades tecnológicas y funcionales (Buriti & Saad, 2007; Buriti et al., 2007; Nagendra, 2007); sin embargo, una de las características que han ganado mayor interés en los últimos años ha sido en torno a sus potenciales usos terapéuticos como alimento funcional o como farmabiótico. El complejo L. casei abarca diversas cepas que han demostrado tener potencial probiótico. 22 La principal aplicación de L. casei como alimento funcional se enfoca en su uso como modulador de la composición de la microbiota o bien como agente antagónico ante microorganismos entero-patogénicos, gracias a su capacidad antimicrobiana (Masoumikia & Ganbarov, 2015). El desarrollo de diversos estudios ha permitido la comprensión de los mecanismos de acción que tiene el complejo, así como el espectro de patologías en las cuales muestran un efecto positivo. Por ejemplo, Sutula et al. (2013) evaluaron el efecto del consumo de L. casei Shirota en la salud bucal de individuos con dentaduras sanas y se logró determinar que la presencia de la bacteria no afectaba en gran medida la diversidad en la cavidad bucal; sin embargo, estos hallazgos sugerían que el tratamiento era prometedor en casos de infecciones bucales o halitosis. Chain et al. (2017) evaluaron el efecto de la administración de L. casei sobre cáncer colo-rectal en un modelo murino, y se determinó que su aplicación tiene un efecto protector significativo debido a sus propiedades inmuno- modulatorias que disminuyen la producción de citoquinas pro-inflamatorias. Del mismo modo, Dietrich et al., (2014) comprobaron que una bebida probiótica comercial presentaba un efecto positivo en la reducción del malestar asociado a la diarrea por antibióticos. Los estudios con respecto a los efectos beneficiosos de L. casei como probióticos son muy abundantes, y han permitido su aplicación como aditivo en diversos productos. En general, los mecanismos de acción antagonista de estos organismos aún no se definen a ciencia exacta, pero, a medida que los estudios en estas áreas progresan, el surgimiento de nuevas aplicaciones, como lo son las terapias contra enfermedades, desarrollo de productos no lácteos, entre otras, viene en crecimiento (Sanders et al., 2016). En la mayoría de los casos, la capacidad antagónica se ha asociado a la competencia dentro de una comunidad microbiana (García-Bayona & Comstock, 2018). Estos mecanismos de competencia son muy diversos y pueden clasificarse por su naturaleza en dos categorías: (a) competición explotativa, en donde los organismos consumen los recursos requeridos por otros organismos en el ambiente y (b) competición por interferencia, la cual consiste en la secreción de compuestos que inhiben el desarrollo de otros microorganismos (Little et al. , 2008). Esta última es la que representa el mayor interés a nivel de aplicaciones biotecnológicas. La competencia por interferencia puede estar mediada por la producción de diferentes tipos de moléculas como antibióticos de bajo peso molecular, péptidos antimicrobianos que pueden ser sintentizados ribosomal y no ribosomalmente, metabolitos secundarios como el 23 peróxido de hidrógeno o la modificación de compuestos producidos por el hospedero, señales de interferencia y toxinas (Buffie et al., 2015; García-Bayona & Comstock, 2018; Little et al., 2008) 3.1.5.1.1. Bacteriocinas y otros compuestos con potencial antimicrobiano Las bacteriocinas son un grupo de péptidos antimicrobianos producidos por algunos organismos, entre ellos L. casei y por lo general se producen cuando hay otros organismos activos; esto les permite obtener ventajas competitivas en un ambiente dado. Por lo general, las bacteriocinas son péptidos sintetizados por el ribosoma como metabolitos primarios (Zacharof & Lovitt, 2012). Las bacteriocinas son moléculas catiónicas pequeñas compuestas por alrededor de 30-60 aminoácidos que forman hélices anfifílicas y estables a altas temperaturas (100 °C, por 10 min), y tienen una amplia variabilidad de espectro de actividad, peso molecular, origen genético y propiedades bioquímicas (Mokoena, 2017; Parada et al. , 2007). El sitio de acción de las bacteriocinas es la membrana citoplasmática bacteriana y, por lo general tienen como blanco las vesículas energizadas de la membrana, con lo que pueden intervenir en la fuerza protón motriz (Parada et al., 2007). Se ha observado que L. casei es productora de bacteriocinas. Müller y Radler (1993) lograron aislar y purificar la bacteriocina intracelular caseicina a partir de extractos celulares de L. casei. La caseicina A y la caseicina B son péptidos antimicrobianos generados a través de la fermentación bacteriana del caseinato, y se han reportado como activos contra muchos patógenos Gram-negativos como Cronobacter sakazakii, Cronobacter muytjensii, Salmonella sp., Salmonella enterica serovar Typhimurium, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas fluorescens, y contra Gram-positivos como Staphylococcus aureus (Norberg et al., 2011). También se ha comprobado que el complejo puede producir lactocina una bacteriocina nativa que tiene una actividad antimicrobiana de amplio espectro, un amplio rango de pH y es resistente a altas temperaturas (Yu et al., 2020). El complejo L. casei se ha identificado como productor de biosurfactantes naturales constituidos por una mezcla de lípidos y azúcares similares a glicolípidos. Los biosurfactantes son moléculas anfifilicas con propiedades emulsificantes. Su actividad posee un cierto grado de capacidad antibacterial, antifúngica, antiviral y anti-adhesiva que demuestra una potencial aplicación en el tratamiento de patógenos en alimentos y podría ser 24 una herramienta para el control de la formación de biofilms (Sharma & Singh Saharan, 2014). Tanto las bacteriocinas como los surfactantes han presentado actividad antimicrobiana importante contra Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Typhi, Shigella flexneri, S. aureus, S. epidermidis, Bacillus cereus y L. monocytogenes. Esto ha generado un fuerte interés industrial y biomédico en este tipo de sustancias debido a las implicaciones que podrían tener en el control de biofilms. Además, se podrían utilizar en el procesamiento de alimentos para la prevención del deterioro y evitar la transmisión de enfermedades que pueden implicar un riesgo para el consumidor. Por lo general, la aplicación de biosurfactantes en superficies modifica su hidrofobicidad y previene su adhesión; este principio también representa un punto importante como probiótico, ya que pueden prevenir la colonización intestinal de otros microorganismos (Sharma & Saharan, 2016). 3.2. Efecto bio-protector Además de sus propiedades funcionales, las BAL se reconocen por sus propiedades como biopreservantes. Este proceso consiste en la extensión de la vida útil y aseguramiento de la inocuidad de un alimento mediante el uso de microbiota controlada y/o compuestos antimicrobianos (Ananou et al., 2007; Rouse & van Sinderen, 2008). L. casei presenta un amplio espectro inhibitorio, ya que es capaz de inhibir el crecimiento de otras bacterias de deterioro o patógenas, mohos y levaduras por mecanismos de competencia, producción de bacteriocinas como la caseicina ( Li et al., 2013) o por efecto de la exclusión competitiva (Siedler et al. , 2019;Rouse & van Sinderen, 2008). Dadas las exigencias actuales de los consumidores por productos saludables, frescos y naturales que sean libres de aditivos químicos, el uso de bacterias bioprotectoras como las BAL, para aumentar la calidad y vida útil de los productos, ha adquirido un fuerte interés. Según Castellano et al. (2008), la aplicación de BAL como cultivo protector permite aumentar la estabilidad e inocuidad de productos cárnicos. En su estudio, se demostró que L. curvatus CRL705 posee una inhibición efectiva sobre L. innocua y Brochothrix thermosphacta en carne molida fresca; además retuvo su efecto inhibitorio durante el almacenamiento a baja temperatura. En el caso de productos lácteos, el uso de BAL como bioprotector también es muy común, especialmente para el control del deterioro fúngico. En su estudio, Leyva-Salas et al. (2018) probaron 32 cepas de BAL y bacterias probióticas, en forma individual y en combinación, para determinar 25 su efectividad en el control y la inhibición en el crecimiento de Penicillium commune, Mucor racemosus y Rhodotorula mucilaginosa en yogurt, natilla y queso, demostrando que la aplicación de estos microorganismos permitía prolongar la vida útil de estos productos. 3.3. Productos lácteos fermentados Los productos lácteos fermentados o leches fermentadas son alimentos que se elaboran a partir de leche fresca. Este proceso se da a partir de bacterias lácticas que pueden ser inoculadas adrede o, bien, forman parte de la microbiota normal de la matriz (Walstra et al., 2006). Esta categoría toma en consideración una gran variedad de productos tales como el yogurt, kéfir, suero de mantequilla (“buttermilk”) fermentado, crema y leche agria, kumis, entre otros (Tetrapak, 2017). La leche que ha sido espontáneamente fermentada por la microbiota normal presente, se consume como alimento en diversas partes del mundo, como parte de una tradición o comportamiento cultural y consiste en uno de los métodos más antiguos de preservación de lácteos basado en la acidificación natural (Roginski, 2004). Por lo general, la presencia de BAL en estas matrices promueve la producción de compuestos que favorecen la inhibición de microorganismos no deseados; sin embargo, puede darse el desarrollo de microorganismos patógenos como Salmonella sp., E. coli y Staphylococcus aureus que podrían contaminar el producto durante el procesamiento y almacenamiento (Cissé et al., 2019; Andrade et al., 2015) lo cual implica una amenaza importante a nivel de salud pública. Según datos de la Cámara Nacional de Productores de Leche (CNPL), para el 2018 se reporta que las exportaciones de productos lácteos generaron alrededor de $ 472 millones de dólares. En el caso de Costa Rica, la producción de lácteos representa el 31 % de la producción láctea en la región. Se estima que la participación del país seguirá creciendo en mercado conforme aumente su competitividad por medio del mejoramiento de sus costos, aumento de sus medidas sanitarias y diversificación de la producción (Elmundocr, 2018). 3.3.1. Leche agria La leche agria es un producto fermentado producido a partir de la fermentación espontánea de la leche cruda gracias a la acción metabólica de los microorganismos presentes 26 de forma nativa en la matriz, o bien, por la adición de cultivos iniciadores en leches que han recibido algún proceso de higienización (Kumar et al., 2015; Mora, 2018). La leche agria es de consumo común en Costa Rica. Con la excepción de algunos ejemplos muy específicos elaborados comercialmente, la gran mayoría de la leche agria es elaborada de forma artesanal por pequeñas empresas lecheras y, en muchos de los casos, bajo condiciones que no son las óptimas (Espinoza-Mora, 2018). La prevalencia de patógenos alimentarios en la leche y productos lácteos derivados se ve influenciada por diversos factores que van desde las condiciones de recolección de la leche hasta las prácticas de manufactura (Abel et al., 2016; Oliver et al., 2005). Debido al aumento en el interés y el consumo de este tipo de alimentos, es importante que, además de promover las prácticas adecuadas en el procesamiento, se estudien nuevas alternativas que sean económicas y permitan optimizar su elaboración. 27 4. Materiales y métodos 4.1. Localización del proyecto La identificación molecular de las BAL aisladas de ensilados de piña se realizó en las instalaciones del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM); las pruebas de antagonismo y de adhesión a cultivos celulares se realizaron en las instalaciones del Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales (CIET). Los análisis físicoquímicos y preparación de leche agria se realizaron en las instalaciones de la planta piloto del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CITA). Finalmente, la determinación de la susceptibilidad a antibióticos y el estudio del efecto bioprotector de L. casei en contra de la población de L. monocytogenes en leche agria se realizó en el Laboratorio de Microbiología de Alimentos y Aguas de la Facultad de Microbiología. Todos en la Universidad de Costa Rica. 4.2. Aislamientos bacterianos Se trabajó con 12 cepas de BAL aisladas por colaboradores del Centro de Investigaciones Agronómicas (CIA) a partir de ensilados elaborados con subproductos del procesamiento industrial de la piña (cáscaras y coronas), provenientes de la empresa Florida Products S.A. 4.3. Identificación de BAL con marcadores moleculares 4.3.1. Extracción de material genético Las cepas de BAL aisladas de los ensilados, se crecieron en medio DeMan- Rogosa- Sharpe (MRS) (Oxoid, Reino Unido) líquido por 24 ± 2 h a 35,0 ± 0,5 °C. La extracción de los ácidos nucleicos totales (ANt) se realizó siguiendo el protocolo de extracción de ADN de plásmido Miniprep por método convencional con fenol (Birnboim & Doly, 1979) para el cual se tomó 1 mL del cultivo bacteriano y se centrifugó a 13 000 rpm por 2 min en una microcentrífuga. El botón obtenido se resuspendió en 100 µL de solución I (25mM Tris-HCL pH 8.0; 10 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 50 mM D-Glucosa) y se incubó a temperatura ambiente por 5 min; posteriormente se adicionó 200 µL de Solución II (0,2N de hidróxido de sodio (NaOH) y 1% de dodecilsulfato sódico (SDS)); se mezcló por inversión 28 y se incubó por 5 min a 4 °C. Finalmente, se adicionaron 150 µL de solución III (3M acetato de potasio y 2 M de ácido acético pH: 4,8) y se le aplicó un incubación final de 5 min a 4 °C. Finalizado este periodo, se centrifugó a 13 000 rpm por 10 min y se transfirieron 450 µL del sobrenadante a un tubo limpio y se adicionaron 450 µL de fenol/cloroformo (1:1 V/V). La mezcla se agitó y se centrifugó. La fase acuosa se transfirió a un tubo limpio y se adicionó 800 µL de isopropanol; se mezcló por inversión. Finalmente, se centrifugó por 10 min a 12 000 rpm y se descartó el sobrenadante. El botón obtenido se lavó con 500 µL de etanol al 70% y se resuspendió en 50 µL de agua libre de nucleasas. 4.3.2. Amplificación por PCR Se amplificó el gen de la subunidad alfa de la fenilalanina ARNt ligasa (pheS), en una reacción que contiene un volumen final de 25 µl de un master mix iProof High-Fidelity DNA Polymerase (BioRad, Estados Unidos), 0.2 µM de cada iniciador (cuadro IV) y 50 ng de ADN. El programa de amplificación consistió en una desnaturalización inicial a 95 °C por 5 min, seguido por 3 ciclos de 95 °C por 2 min, 15 s; 46 °C a 1 min y 72 °C por 15 s; seguido de, 30 ciclos de 95 °C por 35 s, 46 °C por 1 min 15 s y 72 °C por 15 s. Finalmente, una elongación a 72 °C por 7 min. Los productos de PCR se corrieron en geles de agarosa al 1 % utilizando azul de carga y gel-red (Biotium, Estados Unidos) como tintura de los ácidos nucleicos, y un marcador de 100 pb, a 100 V por al menos 30 min. Las muestras se enviaron a la empresa Macrogen Inc. (Corea) para su secuenciación. Cuadro IV. Iniciadores seleccionados para la identificación de las cepas de Lactobacillus sp. Primer Secuencia 5´-3 pheS 21F CAYCCNGCHCGYGAYATGC pheS 22R CCWARVCCRAARGCAAARCC pheS 23R GGRTGRACCATVCCNGCHCC 4.3.3. Análisis de secuencias Las secuencias obtenidas se ensamblaron utilizando el programa Standen (Bonfield et al. 1995) y se alinearon utilizando el programa MUSCLE (Tamura et al., 2013). Utilizando la 29 aplicación BlastN, se realizó una comparación con secuencias de referencia disponibles en bases de datos del GenBank. Las secuencias depuradas fueron depositadas en el GenBank (www.ncbi.com) y se les asignó un código. Para el análisis filogenético, se utilizaron un total de 31 secuencias de BAL (12 aislamientos del estudio y 19 secuencias de referencias obtenidas del GenBank). Los fragmentos analizados consisten en 420 nt para el gen pheS. Se construyó un árbol filogenético utilizando inferencia, sawwun modelo de 10 millones de generaciones y ocho cadenas, con un muestreo de 2000 generaciones (Huelsenbeck et al. , 2001; Ronquist & Huelsenbeck, 2003). 4.4. Determinación de la capacidad antagónica in vitro contra Salmonella sp. y Listeria monocytogenes 4.4.1. Evaluación de efecto antagónico determinado en placa. Se realizó la evaluación de efecto antagónico de las BAL contra cepas de L. monocytogenes y Salmonella sp. Para lo anterior, se utilizó el método de sobrecapas con ciertas modificaciones (Booth et al., 1977; Hütt et al., 2006; Soleimani et al, 2010). Las BAL se rayaron sobre agar MRS (Oxoid, Reino Unido) en forma de una línea recta gruesa de aproximadamente 7 cm de largo, dejando una distancia de 0.5 cm del borde del plato; las placas se incubaron en condiciones de capnofilia a 35,0 ±0,5 °C por 24 ± 2 h. Una vez finalizado este periodo, se procedió a aplicar una sobrecapa de 5 mL de agar infusión cerebro corazón (AICC) (Oxoid, Reino Unido). El patógeno se inoculó sobre el AICC sólido y se realizó el hisopado utilizando un coctel de cinco cepas de cada bacteria patógena; El mismo se preparó a partir de un cultivo que se creció por 18 h para cada bacteria (Cuadro V). Se trabajó con dos cocteles, uno para Salmonella sp. y uno de L. monocytogenes. Las placas se incubaron por 24 ± 2 h y el efecto antagónico se determinó, por la medición, en milímetros, de las zonas claras donde no hubo crecimiento del patógeno. El poder antagónico se determinó siguiendo el criterio de que todos aquellos halos con un diámetro superior a los 6 mm eran considerados como un efecto inhibitorio importante (Hütt et al., 2006; Pan et al., 2009). http://www.ncbi.com/ 30 Cuadro V. Bacterias utilizadas en la selección del método de inoculación del patógeno óptimo. Cepa Número de identificación* Origen Listeria monocytogenes 11.1 Aislamiento de embutidos 5.3 Aislamiento de embutidos 13.6 Aislamiento de embutidos 14.1 Aislamiento de embutidos 19116 ATCC Salmonella sp. 750 Salmonella DA36 Salmonella Typhi 612 Aislamientos clínicos Salmonella Typhimurium 93 Salmonella 3SB *Según el Centro de investigación en Enfermedades Tropicales (CIET) 4.4.2. Ensayos de actividad inhibitoria del sobrenadante. La determinación de la capacidad antagónica del sobrenadante sobre los patógenos, se realizó con un método modificado del protocolo presentado por Lourenço y Pinto (2011). La cepa que mostró resultados más promisorios en la prueba anterior de antagonismo (L. casei_6714) se creció en caldo MRS (Oxoid, Reino Unido) a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 h. El caldo con el crecimiento se centrifugó a 1500 rpm por 15 min, el sobrenadante se decantó y filtró utilizando un filtro de 0.2 µm. Para eliminar la interferencia por ácido láctico (AL), el sobrenadante fue neutralizado con NaOH 0,1M (Thermofisher Scientific, Estados Unidos) y se utilizó de inmediato. Los patógenos se crecieron en agar tripticasa soya (ATS) durante la noche, y se prepararon estándares de McFarland 0.5 utilizando una colonia resuspendida en agua 31 peptonada estéril (APE). Estas suspensiones fueron empleadas para la preparación del coctel de trabajo para cada patógeno. El microplato de 96-pocillos se llenó con 50 µL de caldo tripticasa soya estéril (CTS) (Oxoid), 50 µL de la solución del patógeno y volúmenes variables (50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 y 15 µL), del sobrenadante neutralizado. Se incluyeron controles positivos y negativos. El control positivo se preparó utilizando 50 µL de CTS estéril, 50 µL del patógeno y 50 µL caldo MRS estéril. Los controles negativos no contenían el patógeno y se ajustaron usando APE. Los microplatos se incubaron en condiciones aerobias a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 h en alta humedad. Finalizada esta incubación, se procedió a medir la absorbancia a 620 nm en un lector de microplatos (Biotek Instruments, Estados Unidos) y los resultados se ajustaron utilizando el control negativo. Los ensayos se efectuaron por triplicado. Para analizar el efecto inhibitorio del sobrenadante, se procedió a realizar un análisis de varianza (ANDEVA) de dos vías considerando un α= 0.05; seguido por una comparación múltiple de medias de Tukey usando el programa JMP versión 11 (SAS Institute, Estados Unidos) 4.4.3. Evaluación de la capacidad antagónica de L. casei _6714 a nivel de cultivo celular contra cepas entero-invasivas de Salmonella Typhimurium. 4.4.3.1. Cultivo de líneas celulares Las líneas celulares fueron provistas por el CIET. Las monocapas de células HeLA se crecieron en caldo esencial mínimo de Eagle (EMEM, por sus siglas en inglés; Thermo Fisher Scientific) suplementado con 10 % se suero fetal bovino, 20 µmoles de glutamina, 50 unidades de penicilina G y 50 µg/mL de estreptomicina; se mantuvieron en una incubadora con una atmósfera de 5 % de CO2 y 95 % O2. Para la preparación de los platos, se añadió tripsina a las células para separar el tejido de las paredes de la botella; las células separadas se emplearon para preparar monocapas en placas de 12 pocillos estériles, sembradas con 106 células e incubadas por 48 h. 32 4.4.3.2. Evaluación de la capacidad de adhesividad de L. casei_ 6714 El ensayo para la evaluación de la capacidad de adherencia de L. casei en las células HeLA se realizó utilizando el método descrito por Gopal et al. (2001) y Tsai et al. (2005). Se inoculó L. casei_6714 a una concentración de aproximadamente 107 UFC/mL en caldo EMEM sobre una monocapa de células HeLA previamente cultivada en un portaobjetos de vidrio incubado dentro de una microplaca de 12 pocillos. La microplaca se incubó en atmosfera de 95% CO2 por 2 h a 35 ± 0.5 ° C. Finalizada la incubación, las células se lavaron dos veces con buffer de fosfatos (PBS) (Sigma-Aldrich); se fijaron con paraformaldehído al 10% durante 10 min y se lavaron dos veces con PBS (Sigma-Aldrich). Finalizado los lavados, se tiñeron los portaobjetos con cristal violeta durante 5 min. Los portaobjetos teñidos se lavaron con PBS para eliminar el exceso de colorante y se observaron al microscopio. La adhesión de las BAL se evaluó contabilizando el número promedio de células bacterianas unidas a la monocapa de células HeLa dentro de 5 campos microscópicos seleccionados al azar. Los recuentos de L. casei se determinaron para un promedio de 26 células epiteliales. Se incluyó, además, un control con L. fermentum_6702 (cepa de baja capacidad de adhesión) para fines de comparación. 4.4.3.3. Evaluación del efecto antagónico contra patógenos invasivos Los ensayos se realizaron basados en el protocolo de Giannella et al. (1973) con algunas modificaciones. Para el ensayo de protección, en el cual se simula el efecto del consumo del probiótico durante una infección en el individuo, se creció la cepa de Salmonella serovar Thypimurium en CTS a 35 ± 0,5 ° C durante 24 ± 2 h. El cultivo se diluyó en EMEM (Thermo Fisher Scientific) libre de antibióticos para obtener una concentración de aproximadamente 107 UFC/ml. Del mismo modo, L. casei_6714 se creció en MRS en las mismas condiciones indicadas en las secciones anteriores y se diluyó del mismo modo descrito para Salmonella. Se añadió un volumen de 1 ml de cada suspensión de bacteria a las monocapas celulares crecidas en una microplaca de 12 pocillos; seguido, se procedió a centrifugar a 1600 rpm durante 5 min y luego se incubó en las mismas condiciones descritas para el mantenimiento y preparación de las células. Las microplacas se incubaron durante 0, 3 y 24 h. Finalizada la incubación, los pocillos se lavaron dos veces con PBS y luego se mantuvieron durante 1 h en medio EMEM (Thermo Fisher Scientific) con 100 µg/mL de gentamicina. Una vez finalizada 33 la exposición al antibiótico, cada pocillo se lavó con PBS (Sigma-Aldrich) dos veces y luego se procedió a lisar las células con agua ultrapura durante 10 min. El lisado obtenido, se diluyó serialmente en APE para hacer un cultivo bacteriano en ATS y agar Xilosa-Lisina- Deoxicolato (XLD) (Oxoid). Las placas se incubaron a 35 ± 0,5 ° C durante toda la noche. Los recuentos bacterianos se utilizaron para calcular la tasa de invasividad. Se incluyó un control positivo de Salmonella sp sin tratamiento y todos los experimentos se realizaron por triplicado. Para realizar el ensayo de prevención, el cual simula de forma in vitro lo que ocurriría en un individuo que consume de forma mantenida dosis del probiótico antes de una infección, se siguió el mismo protocolo descrito para el ensayo de tratamiento con la diferencia de que cada monocapa celular se expuso previamente a L. casei_6714 durante 3h y 24 h antes de la infección con Salmonella. 4.4.3.4. Análisis de resultados El recuento de bacterias adheridas a la superficie de la célula y el recuento de Salmonella Typhimurium después de la lisis celular se analizaron con un ANDEVA (α= 0.05) y se aplicó una prueba de comparación múltiple de medias HSD-Tukey. Todos los análisis se realizaron por medio del programa estadístico JMP 11. 4.5. Evaluación de susceptibilidad a antibióticos de L. casei_6714 La susceptibilidad a los antibióticos se evaluó mediante el método de difusión con agar utilizando discos de antibiótico (Hudzicki, 2013). El cultivo de L. casei_6714 se realizó en caldo MRS (Oxoid) incubado a 35 ± 0,5 °C durante 24 ± 2 h. La suspensión de la cepa se frotó en agar Müller-Hinton (Oxoid) usando un hisopo de algodón estéril; posteriormente se colocaron discos con concentraciones de antibióticos estandarizados según lo indicado por los protocolos establecidos para este tipo de pruebas (Cuadro VI) en la superficie del agar. Las placas se incubaron a 35 ± 0,5 °C durante 24 ± 2 en condiciones de capnofília. Los ensayos experimentales se realizaron por triplicado. Después de la incubación, se midió el diámetro de las zonas de inhibición y se comparó con los estándares establecidos por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (Sharma et al., 2016; Wolupeck et al., 2017) 34 Cuadro VI. Antibióticos que se evaluaron durante la prueba de susceptibilidad de las BAL. Antibiótico Concentración Ciprofloxacina 5 µg Vancomicina 30 µg Penicilina 10 UI Amoxicilina con ácido clavulánico 30 µg Eritromicina 15 µg Amikacina 30 µg Estreptomicina 10 µg Tetraciclina 30 µg Cloranfenicol 30 µg 4.6. Efecto de L. casei_6714 sobre crecimiento de L. monocytogenes y la fermentación en leche agria artesanal. 4.6.1. Cultivos iniciadores Se trabajaron dos cultivos de bacterias lácticas. El primero consistió en un control utilizando la cepa comercial R-704 (Chr Hansen Inc, Dinamarca) que se adicionó a la leche según las recomendaciones del proveedor. El segundo control consistió en el inoculo de la cepa L. casei_ 6714, el cual se preparó creciendo la bacteria durante 24 horas en agar MRS, bajo condiciones de capnofilia a 35 ± 0,5 ° C. A partir de dicha placa, se picó una colonia para preparar un estándar de McFarland 0.5 en APE. Esta solución se utilizó para inocular las leches a evaluar. L. monocytogenes se adicionó en forma de un cóctel de cinco cepas (Cuadro V) elaborado a partir de pre-cultivos de la bacteria en CTS, incubados a 35 ± 0,5 ° C por 18 h. Para la preparación de este se emplearon volúmenes iguales de cada cepa. Los inóculos de cultivo iniciador (CI), BAL y L. monocytogenes se adicionaron según el esquema de tratamientos descrito en el Cuadro VII. 35 Cuadro VII. Designación de tratamientos para las pruebas de efecto bioprotector de las BAL en leche agria. Tratamiento Composición Categoría T1 Cultivo iniciador R704 (Hansen, Dinamarca) Control negativo T2 Cultivo iniciador R704 (Hansen, Dinamarca) + BAL seleccionada Control positivo T3 BAL + L. monocytogenes Experimento T4 Cultivo iniciador R704 + L. monocytogenes Experimento T5 Cultivo iniciador + BAL + L. monocytogenes. Experimento 4.6.2. Preparación de la matriz La leche agria se preparó utilizando leche cruda y siguiendo el proceso que se muestra en la Figura 1. Previo a este paso, la materia prima fue caracterizada utilizando el EKOMILK ® para determinar su densidad, contenido de proteínas, grasa, sólidos no grasos y agua. Leche cruda Pasteurización 65 °C, 30 min Inoculación 37 °C, agitación Inóculo BAL (R-704; L. casei_6714) Inóculo L. monocytogenes Fermentación 24 h, temperatura ambiente Figura 1. Diagrama de flujo para la preparación de las muestras de leche agria a ensayar. Los inóculos se adicionaron según la distribución de tratamientos a evaluar (Cuadro VI). 36 4.6.3. Evaluación del efecto bioprotector. El ensayo propuesto se basó en el estudio de Espinoza-Mora (2018). Se inocularon 400 mL de leche pasteurizada según los tratamientos indicados en el Cuadro VI con una carga de 108 UFC/mL de L. casei_ 6714, cultivo iniciador o una mezcla de los dos anteriores y de 105 UFC/mL de L. monocytogenes. Las muestras inoculadas se almacenaron a temperatura ambiente por un período de 24 h y se realizaron muestreos a las 0, 3, 6, 8 y 24 h, en donde se midió el pH, recuento de BAL por el método de esparcimiento en agar MRS (Splittstoesser et al., 2001) y recuento de L. monocytogenes por el método de vaciado utilizando agar Oxford (FDA, 2016; Splittstoesser et al., 2001; Vanderzant & Splittstoesser, 1992). Este ensayo se realizó por duplicado considerando lotes independientes de leche agria y réplicas biológicas (inóculos independientes). Nótese que por motivos de fuerza mayor no se realizaron las tres repeticiones recomendables para dar mayor sensibilidad al ensayo; es importante considerar para futuras pruebas, realizar los ensayos con al menos tres repeticiones. 4.6.4. Análisis estadístico Todos los análisis se efectuaron usando el programa JMP 13 (SAS Institute, Estados unidos). 4.6.4.1. Curva de crecimiento de BAL en las leches inoculadas. Los resultados del crecimiento exponencial de BAL en las cinco muestras de leche agria a través del tiempo se analizaron utilizando un modelo logístico de tres parámetros con el objetivo de estimar un modelo que se ajustara óptimamente al comportamiento de los datos. Para esto se utilizó la ecuación 1 para determinar los valores de los factores: tasa de crecimiento (a), punto de inflexión (b) y asíntota de crecimiento (c) (Micha & Corradini, 2011; Pla et al., 2015). log(𝑝𝑜𝑏𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛) = 𝑐 1 + 𝑒−𝑎 (𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜−𝑏) (1) 37 Se determinó el promedio y la desviación estándar (SD, por sus siglas en inglés) de cada parámetro por tratamiento y se analizaron con un ANDEVA (α= 0.05) para determinar si existían valores con diferencias significativas entre los parámetros a y c. Posteriormente se realizó una comparación múltiple de medias Tukey para determinar cuáles muestras mostraban diferencias significativas. 4.6.4.2. Curva de crecimiento de acidificación de la leche inoculada. Los resultados de los valores de pH de las cinco muestras de leche agria a través del tiempo se analizaron utilizando un modelo exponencial de tres parámetros con el objetivo de estimar un modelo que se ajustara a la disminución del pH de la matriz hasta alcanzar un valor límite de 4.5. Para esto, se utilizó la Ecuación 2 con lo que se determinaron los valores de los factores: asíntota (a), escalar (b) y tasa de crecimiento (c) (Micha & Corradini, 2011; Tjørve & Tjørve, 2017) 𝑝𝐻 = 𝑎 + 𝑏 ∗ exp(𝑐 ∗ 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜) (2) Se determinó el promedio y la SD de cada parámetro por tratamiento y se analizó con un ANDEVA (α= 0.05) para determinar la existencia de valores con diferencias significativas entre los parámetros a, b y c. Posteriormente, se realizó una comparación múltiple de medias de Tukey para determinar cuáles muestras mostraban diferencias significativas. 4.6.4.3. Curva de crecimiento de L. monocytogenes en las leches inoculadas. Los resultados del decrecimiento poblacional de L. monocytogenes en las cinco muestras de leche agria a través del tiempo se analizaron utilizando un modelo de regresión lineal en donde se determinó la recta de mejor ajuste (Ecuación 3). A partir de estas rectas, se realizó un ANDEVA (α= 0.05), donde se compararon los valores obtenidos para las pendientes y se determinó si existían diferencias significativas. Pata evaluar cuáles medias eran significativamente distintas, se procedió a realizar una comparación múltiple de medias de Tukey. log(𝑝𝑜𝑏𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛) = 𝑎 + 𝑏 ∗ 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 (3) 38 5. Resultados y discusión 5.1. Identificación de BAL con marcadores moleculares Se identificaron doce morfotipos bacterianos a partir de los aislamientos obtenidos de los ensilados de piña. La mayoría de las BAL identificadas corresponden al género Lactobacillus sp. con un total de once cepas, y Weissella sp. con una cepa. Al realizar la comparación de las secuencias con los datos obtenidos en el GenBank, se identificaron un total de cuatro especies distintas, tal y como se muestra en la Figura 2. Las cepas de Lactobacillus sp. fueron representantes del genero más común, según los resultados obtenidos, y esto era de esperarse, ya que, de acuerdo con la literatura, son el grupo con mayor abundancia de especies dentro del grupo BAL (Narvhus & Axelsson, 2003); se encuentran presentes en una gran diversidad de matrices, sobre todo en vegetales como plantas y flores (Góngora et al., 2012), y productos vegetales frescos y fermentados (Sáez et al., 2018; Yi et al., 2013), entre los que se incluyen los desechos orgánicos (Arshad et al., 2018; Góngora et al., 2012) tales como la piña (Mardalena & Erina, 2016). Dentro de este grupo, se identificaron en total tres especies: L. casei (7), L. fermentum (2) y L. parafarraginis (2). W. ghanensis fue también identificada en este trabajo. El género Weissella sp., era conocido como Leuconostoc sp.; sin embargo, fue reclasificado por Collins et al. (1993). El género Weissella sp abarca hasta el momento un total de 22 especies que pueden ser identificadas en una gran variedad de hábitats que incluyen alimentos fermentados (De Bruyne et al., 2010; Li et al., 2020); sin embargo, algunos autores también han asociado a algunos de sus miembros al deterioro de alimentos (Fusco et al., 2015; Sáez et al., 2018). W. ghanensis se caracteriza por ser una bacteria Gram positiva, catalasa negativa, no esporulada con un forma cocoidal o bacilar, perteneciente a la familia Leuconostocaceae (Collins et al., 1993). Es un organismo anaerobio facultativo, quimioorganoheterotrofo con un metabolismo estrictamente fermentativo ya que carece de citocromos, por lo que deben metabolizar la glucosa por medio de una ruta heterofermentativa. Para lo anterior, utilizanlas vías hexosa- monofosfato y la fosfocetolasa; esto implica que sus productos finales estan constituidos por una mezcla de AL, CO2 y etanol o acetato (Collins et al., 1993; Fusco et al., 2015). 41 Figura 2. Árbol filogenético que se realizó utilizando las secuencias del gen fenil alanil-ARNt sintasa (pheS) (420 nt). En negrita se muestran las secuencias de este trabajo. Se utilizó L. delbrueckii subsp. lactis KTCT 3034 como grupo externo. 42 5.2. Determinación de la capacidad antagónica in vitro contra Salmonella sp. y Listeria monocytogenes Cuando se realizaron las pruebas de antagonismo contra Salmonella sp. y L. monocytogenes, se encontró que, en general, todas las cepas mostraron una actividad importante frente al crecimiento de los dos patógenos, especialmente contra Salmonella sp (Cuadro VIII). Este efecto antagónico se vio físicamente como la aparición de un halo o área de no crecimiento por parte del patógeno (Anexo 1, Figura 6). Cabe destacar que los dos patógenos utilizados representaban a una especie Gram negativa y otra Gram positiva, respectivamente. Esto es importante debido a las diferencias de estructura y composición de las células, que pueden activar distintas rutas metabólicas para generar patogenicidad. Las bacterias Gram negativas presentan una membrana celular de tres capas compuestas de fosfolípidos y lipopolisacáridos (LPS), tienen una permeabilidad regulada, mientras que las bacterias Gram positivas presentan una capa gruesa de peptidoglicano. La presencia de la capa de peptidoglicano confiere a la bacteria una barrera de exposición ante los agentes antimicrobianos, y por lo general, van a hacer de estos organismo un poco más resistentes (Reygaert, 2018). En este estudio, se determinó que la cepa L. casei_6714 fue la que presentó la mayor actividad inhibitoria contra Salmonella sp. y L. monocytogenes. 43 Cuadro VIII. Halos de inhibición observados contra Salmonella sp. y L. monocytogenes en los ensayos de antagonismo contra las bacterias ácido lácticas (BAL). Cepa Halo de inhibición (mm) Salmonella Listeria L. casei_6709 ++ + L. casei_6710 ++ ++ L. casei_6711 ++ + L. casei_6712 +++ ++ L. casei_6713 ++ ++ L. casei_6714 +++ +++ L. casei_6715 + + L. fermentum_6702 ++ + L. fermentum_6704 + + L. parafarraginis_6717 ++ ++ L. parafarraginis_6719 ++ + W. ghanensis_6706 +++ ++ +: Zona de inhibición 0-3 mm de diámetro (débil) ++: Zona de inhibición 3 - 6 mm de diámetro (buena) +++: Zona de inhibición mayor a 6 mm de diámetro (fuerte) El ensayo de actividad antimicrobiana del sobrenadante para L. casei_6714 (Cuadro IX) muestra resultados inhibitorios significativos ante Salmonella sp. cuando se utilizó un volumen de 20 µL, mientras que para L. monocytogenes, se requirió de un volumen mayor (50 µL) para obtener un efecto inhibitorio equivalente. Esto se podría explicar por distintos factores. 44 Cuadro IX. Valores de absorbancia a 620 nm obtenidos en la determinación de la actividad antimicrobiana del sobrenadante de L. casei _6714 contra Salmonella sp. y L. monocytogenes (promedio ± desviación estándar, n = 3) Volumen del sobrenadante (µL) Absorbancia a 620 nm Salmonella L. monocytogenes 50 0.062 ± 0.007CD 0.043 ± 0.05BC 45 0.09 ± 0.04CD 0.13 ± 0.02A 40 0.055 ± 0.008D 0.128 ± 0.004A 35 0.08 ± 0.03CD 0.14 ± 0.01A 30 0.15 ± 0.06BCD 0.11± 0.05AB 25 0.16 ± 0.03BCD 0.113 ± 0.004AB 20 0.19 ± 0.03BC 0.129 ± 0.003A 15 0.24 ± 0.01AB 0.13 ± 0.01A Control positivo 0.34 ± 0.08A 0.151 ± 0.007A En una misma columna, entre valores que no comparten la misma letra existe diferencias significativas (p < 0.005). Las BAL son productoras de diversos metabolitos que pueden tener un efecto antimicrobiano importante. Los antimicrobianos producidos por las BAL varían en cuanto a naturaleza y peso molecular lo cual puede afectar la magnitud de impacto que tienen sobre los organismos patógenos (Çon & Gökalp, 2000; Pinar & Yalçin, 2015). Al trabajar con un sobrenadante previamente neutralizado, se está eliminando el efecto ocasionado por la presencia de iones hidronio en la matriz, por lo que se podría suponer que existe la presencia de otras sustancias metabólicas presentes, tales como las bacteriocinas. Las diferencias entre los resultados obtenidos al comparar el efecto por sobrecapa vrs del sobrenadante neutralizado y la inhibición contra L. monocytogenes, podrían explicarse debido a que este patógeno no presenta una buena tolerancia a la acidez, por lo que su crecimiento se ve limitado a pH menores de 4.5 (Koutsoumanis et al., 2003). Además, el efecto del sobrenadante fue mucho más significativo sobre Salmonella sp. Este fenómeno 45 puede ser explicado por la naturaleza estructural de los patógenos como se mencionó con anterioridad. 5.2.1. Evaluación de la capacidad antagónica de L. casei _6714 a nivel de cultivo celular contra cepas entero-invasivas de Salmonella Typhimurium. El ensayo de evaluación de la adhesividad de la cepa se realizó para verificar la capacidad de la BAL seleccionada de asentarse en el epitelio intestinal, lo cual es un factor relevante durante el proceso de colonización intestinal (Janković et al., 2012). Los resultados del conteo celular de L. casei_6714 que se adhiere