UNIVERSIDAD DE COSTA RICA FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS ESCUELA DE ZOOTECNIA Evaluación de dos protocolos para sincronización de la ovulación e inseminación artificial a tiempo fijo con y sin el uso de estradiol en novillas María Carolina Guillén Alvarado Tesis para optar por el título en el grado académico de Licenciatura en Ingeniería Agronómica con énfasis en Zootecnia Ciudad Universitaria Rodrigo Facio 2019 ii TRIBUNAL EVALUADOR Esta tesis fue aprobada por la Comisión de Trabajos Finales de Graduación de la Escuela de Zootecnia de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar por el grado de Licenciatura. _______________________________ Ing. Roger Eduardo Molina Coto. M.Sc. Director de Tesis. _______________________________ Ing. José Ramón Molina Villalobos. Ph.D. Miembro del Tribunal. ________________________________ Dr. Josué Varela Mora. Lic. Miembro del Tribunal. ________________________________ Ing. Rodolfo WingChing Jones. M.Sc. Miembro del Tribunal. ________________________________ Ing. Carlos Arroyo Oquendo. M.Sc. Director de Escuela de Zootecnia. ________________________________ Ing. María Carolina Guillén Alvarado. Bach. Sustentante. iii DEDICATORIA En especial a Dios, que está presente en todo momento y nos motiva a superarnos día con día, brindándonos sabiduría, fortaleza y humildad en todo lo que realizamos. A mi madre Vilma María Alvarado Miranda, por estar presente en toda mi educación brindándome apoyo a pesar de a veces no tener la confianza en mí misma, ella es el pilar fundamental que hace que me supere día con día. A mi padre Jorge Enrique Guillén Bustos, por brindarme el apoyo necesario en mis estudios. A mis hermanos: Carmen Alicia Guillén Alvarado, Jorge Enrique Guillén Alvarado y Laura Cristina Guillén Alvarado, por ser siempre un apoyo en todas las etapas de mi vida. iv AGRADECIMIENTO A Dios por darme fuerza y sabiduría en cada uno de los caminos que emprendo. A Roger Eduardo Molina Coto por la confianza brindada, paciencia y perseverancia para el desarrollo de esta tesis. A la empresa Cargill por brindar el 50% del alimento balanceado del programa Nova de Aguilar & Solís. A la empresa DSM por aportar los minerales de la marca Tortuga para este estudio. Al Centro de Inseminación Artificial de la Dirección de Salud Reproductiva del SENASA en Ochomogo, por donar el semen para la inseminación de las novillas. A Augusto Rojas Bourrillón, director del CINA, por brindar los análisis de las muestras del pasto King grass, cáscara de banano maduro y banano verde entero. A Shirley Rojas Salazar por realizar el análisis estadístico de los datos obtenidos. A los muchachos que laboran en la Unidad de Reproducción Animal (URA) de la UCR, por estar siempre anuentes a colaborar con este proyecto, haciendo de este tiempo una experiencia grata y llena de aprendizaje. A las amistades (Andrés Cavanillas, Erick Arce, María José Hernández, Oscar González, Alejandro Rodríguez) y profesores (Carlos Arroyo, Juan Ignacio Herrera, Max Porras) que me brindaron su apoyo para realizar las distintas actividades de dicha tesis. A los revisores, por su colaboración y dedicación de su tiempo al leer y brindarme una guía y apoyo, para mejorar mi tesis. v ÍNDICE GENERAL CONTENIDO PÁGINA TRIBUNAL EVALUADOR ............................................................................................ ii DEDICATORIA ........................................................................................................... iii AGRADECIMIENTO ................................................................................................... iv ÍNDICE GENERAL ...................................................................................................... v ÍNDICE DE CUADROS ............................................................................................. vii ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................. viii LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... xi RESUMEN ................................................................................................................ xiii 1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 1 2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 3 2.1 General: ....................................................................................................................... 3 2.2 Específicos: ................................................................................................................. 3 3. REVISION DE LITERATURA ...................................................................................... 4 3.1 Generalidades anatómicas del aparato reproductor en hembras bovinas .................. 4 3.1.1 Vulva ............................................................................................................................ 4 3.1.2 Vagina ......................................................................................................................... 4 3.1.3 Cérvix o cuello del útero .............................................................................................. 4 3.1.4 Útero ............................................................................................................................ 4 3.1.5 Oviducto ...................................................................................................................... 5 3.1.6 Ovarios ........................................................................................................................ 5 3.2 Pubertad en hembras bovinas ..................................................................................... 5 3.2.1 Desarrollo del aparato reproductivo en hembras ........................................................ 6 3.2.2 Evaluación del desarrollo reproductivo ........................................................................ 6 3.2.3 Correlaciones de índices productivos con respecto a la pubertad .............................. 8 3.2.4 Factores que afectan el momento en que se alcanza la pubertad .............................. 8 3.3 Fisiología del aparato reproductor en hembras bovinas ............................................. 9 3.3.1 Ciclo estral en la hembra bovina ................................................................................. 9 3.3.2 Control hormonal del ciclo estral ............................................................................... 10 3.3.3 Dinámica folicular en la hembra bovina ..................................................................... 10 3.3.4 Diferencias fisiológicas reproductivas del Bos indicus y Bos taurus. ........................ 11 3.3.5 Factores que afectan la detección de celo y preñez. ................................................ 13 3.4 Inseminación artificial ................................................................................................ 14 3.5 Inseminación artificial a tiempo fijo. ........................................................................... 15 3.5.1 Protocolos de sincronización de la ovulación e IATF ................................................ 16 3.5.2 Función de las hormonas en los protocolos aplicados .............................................. 19 3.6 Restricciones en el uso de productos hormonales en producción bovina ................. 20 4. PROCEDIMIENTO Y METODOLOGIA ..................................................................... 22 4.1 Generalidades de manejo ......................................................................................... 23 4.2 Evaluaciones con ultrasonido .................................................................................... 25 4.3 Evaluación de concentraciones de progesterona en sangre ..................................... 25 4.4 Protocolos o tratamientos .......................................................................................... 26 4.5 Variables medidas ..................................................................................................... 26 vi CONTENIDO PÁGINA 4.6 Unidad experimental .................................................................................................. 28 4.7 Análisis estadístico .................................................................................................... 28 5. RESULTADOS Y DISCUSION .................................................................................. 31 5.1 Crecimiento ............................................................................................................... 31 5.1.1 Pesaje mensual ......................................................................................................... 31 5.1.2 Ganancia diaria de peso ............................................................................................ 33 5.1.3 Ganancia de peso total .............................................................................................. 34 5.1.4 Condición corporal ..................................................................................................... 36 5.1.5 Espesor de la grasa dorsal ........................................................................................ 36 5.2 Desarrollo del tracto reproductivo .............................................................................. 37 5.2.1 Diámetro del cérvix .................................................................................................... 37 5.2.2 Diámetro del cuerno derecho .................................................................................... 38 5.2.3 Diámetro del ovario derecho y diámetro del ovario izquierdo ................................... 40 5.2.4 Cantidad y tamaño de folículos ................................................................................. 42 5.2.5 Diámetro del cuerpo lúteo total .................................................................................. 43 5.2.6 Diámetro del cuerpo lúteo neto ................................................................................. 44 5.2.7 Ciclicidad ................................................................................................................... 45 5.2.8 Textura del útero ....................................................................................................... 46 5.2.9 Posición del tracto reproductivo ................................................................................ 47 5.2.10 Clasificación del tracto reproductivo .......................................................................... 47 5.3 Respuesta ovárica respecto a los protocolos ............................................................ 48 5.3.1 Cantidad y tamaño de folículos ................................................................................. 49 5.3.2 Tamaño del folículo pre ovulatorio ............................................................................ 49 5.3.3 Progesterona al día 7 post inseminación .................................................................. 50 5.3.4 Relación de concentraciones de P4 con respecto al diagnóstico de preñez ............. 51 5.3.5 Correlación DCLT y DCLN ........................................................................................ 51 5.3.6 Temperatura rectal .................................................................................................... 51 5.4 Diagnóstico de preñez ............................................................................................... 52 5.5 Relación beneficio-costo ........................................................................................... 57 6. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 59 7. RECOMENDACIONES ............................................................................................. 61 8. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 62 9. ANEXO ...................................................................................................................... 74 vii ÍNDICE DE CUADROS CUADRO TÍTULO PÁGINA 1 Clasificación del grado de desarrollo reproductivo de las hembras ................. 7 2 Diferencias en la fisiología reproductiva de las distintas subespecies ............ 12 3 Diferencias en la fisiología reproductiva entre vacas lactantes y novillas. ............................................................................................................ 13 4 Cantidades diarias de los componentes de la dieta brindada a las novillas ............................................................................................................. 24 5 Clasificación promediada de la textura del útero para los grupos raciales Brahman y Simbrah F1. ..................................................................... 47 6 Posición del tracto reproductivo para los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 ...................................................................................................... 47 7 Costo de las hormonas utilizadas en los protocolos ....................................... 57 8 Datos para obtener la relación beneficio-costo para los distintos ensayos según los protocolos ......................................................................... 58 viii ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA TÍTULO PÁGINA 1 Posición del tracto reproductivo con respecto a la cavidad pélvica .................... 8 2 Temperatura ambiental mensual y promedio durante el tiempo en que se realizó el ensayo. Meses de junio, julio y agosto 2017 sin datos. ...................... 22 3 Humedad relativa mensual y promedio durante el tiempo en que se realizó el ensayo. Meses de junio, julio y agosto 2017 sin datos. ...................... 23 4 Precipitación mensual y promedio durante el tiempo en que se realizó el ensayo. Meses de junio, julio y agosto 2017 sin datos. ..................................... 23 5 Protocolos utilizados en el experimento, P1 y P2 respectivamente. .................. 26 6 Curva mensual global de crecimiento de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 ......................................................................................................... 31 7 Curva mensual de crecimiento de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 (mínimos cuadrados promedio ± error estándar) ........................... 32 8 Ganancia diaria de peso promedio mensual de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1. ..................................................................................... 33 9 Ganancia diaria de peso de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 .......... 34 10 Ganancia de peso total mensual de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 ......................................................................................................... 35 11 Ganancia de peso total mensual de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 ......................................................................................................... 35 12 Condición corporal de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 ................... 36 13 Espesor de la grasa dorsal de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 ....................................................................................................................... 37 14 Variación del espesor de la grasa dorsal de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 ...................................................................................................... 37 15 Promedio del diámetro del cérvix de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 (mínimos cuadrados promedio ± error estándar) ........................... 38 16 Diámetro del cuerno derecho de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 (mínimos cuadrados promedio ± error estándar) .......................................... 39 17 Diámetro del cuerno derecho de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 ....................................................................................................................... 39 ix FIGURA TÍTULO PÁGINA 18 Diámetro global del ovario derecho e izquierdo de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 (mínimos cuadrados promedio ± error estándar). ........ 41 19 Cantidad de folículos totales categorizados en clases de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 desde los 12 hasta 19 meses de edad (TF1: ≥ 10 mm, TF2: 6 - 9 mm y TF3: ≤ 5 mm). ................................................. 43 20 Diámetro del cuerpo lúteo total para los grupos raciales Brahman y Simbrah F1. ........................................................................................................ 44 21 Diámetro del cuerpo lúteo neto para los grupos raciales Brahman y Simbrah F1. ........................................................................................................ 45 22 Porcentaje de hembras ciclicando en cada evaluación mensual de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 ............................................................. 45 23 Porcentaje de ciclicidad total de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 a los 19 meses de edad y porcentaje global de ciclicidad. ........................... 46 24 Clasificación del tracto reproductivo de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1. RTS 1: Prepuberal (estructuras no palpables), RTS 2: Prepuberal (folículos de 8 mm), RTS 3: Peripuberal (folículos 8 - 10 mm), RTS 4: Puberal (folículos > 10 mm, posible CL) y RTS 5: Puberal (folículos > 10 mm, con CL presente) ................................................................ 48 25 Resultado global del porcentaje de preñez para los distintos diagnósticos de gestación. DP1: diagnóstico de preñez a primer servicio, DP2: diagnóstico de preñez al segundo servicio, DPA: diagnóstico de preñez acumulada. ......................................................................................................... 53 26 Novillas preñadas y vacías de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 en cada diagnóstico de preñez. DP1: diagnóstico de preñez a primer servicio, DP2: diagnóstico de preñez al segundo servicio, DPA: diagnóstico de preñez acumulada ..................................................................... 53 27 Novillas preñadas para los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 en cada diagnóstico de preñez. P1: protocolo con GnRH, P2: protocolo con E2, DP1: diagnóstico de preñez a primer servicio, DP2: diagnóstico de preñez al segundo servicio, DPA: diagnóstico de preñez acumulada ............... 54 28 Total de novillas preñadas por protocolo para cada diagnóstico de preñez. P1: protocolo con GnRH, P2: protocolo con E2, DP1: diagnóstico de preñez a primer servicio, DP2: diagnóstico de preñez al segundo x FIGURA TÍTULO PÁGINA servicio, DPA: diagnóstico de preñez acumulada .............................................. 55 xi LISTA DE ABREVIATURAS ABREVIATURA SIGNIFICADO CL Cuerpo lúteo. CC Condición corporal. DC Diámetro del cérvix. DCD Diámetro del cuerno derecho. DCLT Diámetro del cuerpo lúteo total. DCLN Diámetro del cuerpo lúteo neto. DP1 Diagnóstico de preñez al primer servicio. DP2 Diagnóstico de preñez al segundo servicio. DPA Diagnóstico de preñez acumulada. E2 Estrógenos. EB Benzoato de estradiol. eCG Gonadotropina coriónica equina. ECP Cipionato de estradiol. FD Folículo dominante. FSH Hormona folículo estimulante. GDP Ganancia diaria de peso. GnRH Hormona liberadora de gonadotropinas. GPT Ganancia de peso total. IA Inseminación artificial. IATF Inseminación artificial a tiempo fijo. LH Hormona luteinizante. P1 Protocolo 1 (Protocolo con GnRH). P2 Protocolo 2 (Protocolo con E2). P4 Progesterona. PV Peso vivo. PGF2α Prostaglandina F2α. RT Tracto reproductivo. xii ABREVIATURA SIGNIFICADO RTS Clasificación del tracto reproductivo. SPS1 Tracto reproductivo completo está dentro de la cavidad pélvica. SPS2 Tracto reproductivo específicamente el cérvix está dentro de la cavidad pélvica, pero los cuernos uterinos están fuera de la cavidad. SPS3 Tracto reproductivo donde el cuello uterino como los cuernos están fuera de la cavidad pélvica. TFPO Tamaño del folículo pre ovulatorio. TU Textura del útero. TF1 Total folículos clase 1 (≥ 10 mm). TF2 Total folículos clase 2 (6 – 9 mm). TF3 Total folículos clase 3 (≤ 5 mm). TR Temperatura rectal. xiii RESUMEN Se realizó una investigación comparativa de dos protocolos de inseminación artificial a tiempo fijo (IATF), con y sin el uso de estradiol, mediante la valoración de su respuesta ovárica por medio de ultrasonidos y niveles de progesterona en sangre. Dicha investigación se llevó a cabo de marzo 2017 a julio 2018, en la Finca de Producción Animal de la Escuela de Zootecnia, de la Universidad de Costa Rica, ubicada en Guápiles, Pococí, Limón. El estudio incluyó 60 animales, 30 pertenecientes a la raza Brahman y 30 al grupo racial Simbrah F1, con una edad promedio de 8 meses y un peso promedio de 220 kg (203 kg para Brahman y 238 kg para Simbrah F1). Dichos animales se estabularon en 10 corrales, distribuidos 6 individuos por corral, según grupo racial y estratos de peso. Todos permanecieron bajo las mismas condiciones de manejo y alimentación. Se realizaron pesajes mensuales desde la llegada de los animales hasta los 19 meses de edad, donde se obtuvo un mayor peso para los animales Simbrah F1 (p=0,0026), por ende una superioridad aproximada de 50 kg en promedio en ganancia de peso total (GPT) con respecto a los Brahman. Se evaluaron las reservas corporales mediante una escala de 1 a 5, aumentaron respecto al tiempo, además, se midió la grasa dorsal mediante ultrasonido, obteniendo un promedio de 6,5 mm con un rango de 4,3 a 10,2 mm. Se realizaron ultrasonidos trans rectales a partir de los 12 meses de edad, para evaluar el desarrollo del tracto reproductivo, se obtuvo un incremento de las mismas conforme aumentaba la edad para todas las variables (diámetro del cérvix (DC), diámetro del cuerno derecho (DCD), diámetro del ovario derecho (DOD), diámetro del ovario izquierdo (DOI), cantidad de folículos clasificados en categorías según su tamaño (TF1, TF2, TF3), diámetro del cuerpo lúteo total (DCLT) y diámetro del cuerpo lúteo neto (DCLN) en ambos grupos raciales. Además, el grupo racial tuvo influencia sobre el diámetro del cérvix (DC) (p=0,028), diámetro del cuerno derecho (DCD) (p=0,0037) y diámetro del cuerpo lúteo neto (DCLN) (p=0,0303); mientras que no se encontró diferencia para el diámetro del ovario derecho (DOD) (p=0,1101), diámetro del ovario izquierdo (DOI) (p=0,3399), diámetro del cuerpo lúteo total (DCLT) (p=0,9978), ni la cantidad de folículos (TF1, TF2 y TF3) (p=0,6941), (p=0,0967) y (p=0,5595) respectivamente. Cuando el 67% de los animales estuvieron ciclando y tenía un mínimo de 70% del peso vivo (PV) adulto, se distribuyeron en los 2 protocolos para IATF, se tomó en cuenta la xiv ciclicidad, grado de desarrollo reproductivo y peso. Se realizaron ultrasonografías los días de aplicación de hormonales y 7 días post inseminación artificial (IA) para conocer la dinámica folicular como respuesta a los tratamientos; así mismo, se tomaron muestras de sangre para evaluar las concentraciones de P4 en sangre, obteniéndose una influencia por parte del tratamiento sobre el total de folículos clase 3 (TF3) (p=0,0413), lo que indica que los animales tratados con estrógenos (E2) presentaron más cantidad de folículos de clase 3 que los tratados con GnRH, también el tratamiento tuvo influencia sobre el total de folículos clase 1 (TF1) (p=0,0295), lo que quiere decir que los animales tratados con el P2 (protocolo con E2) presentaron menos folículos de clase 1 que los tratados con el P1 (protocolo con GnRH), además presentó diferencia en cuanto a niveles de progesterona (P4) (p=0,0307), lo que indica que a mayor cantidad de P4 se van a presentar menos folículos de clase 1. El tratamiento, grupo racial y tamaño del folículo pre ovulatorio (TFPO) no tuvo influencia sobre las concentraciones de P4 (p=0,9737), (p=0,8857) y (p=0,8505) respectivamente. También el TFPO no tuvo influencia respecto a la ciclicidad (p=0,0896) ni sobre los diagnósticos de preñez (DP1, DP2, DPA) (p=0,2618), (p=0,2996), (p=0.9789) respectivamente. El tratamiento (p=0,3483) y el grupo racial (p=0,7834) no influyó sobre los niveles de P4, mientras que el diámetro del cuerpo lúteo total (DCLT) (p=0,0028) y el diámetro del cuerpo lúteo neto (DCLN) (p=0,0113) si presentaron diferencia en cuanto a los niveles de P4. Tampoco hubo diferencias para ninguno de los diagnósticos de preñez (DP1, DP2 y DPA), (p=0,2345), (p=0,238), (p=0,1009) respectivamente, ni para tratamiento (p=0,7058), (p=0,8735) y (p=0,9337) ni grupo racial (p=0,6577), (p=0,5086) y (p=0,4462). El diagnóstico de preñez se realizó a los 35 días post inseminación, donde las novillas vacías se resincronizaron con el mismo protocolo utilizado en cada animal al primer servicio. Para el DP1 solo se preñaron animales pertenecientes al grupo racial Simbrah F1, el DP2, no fue afectado por el grupo racial (p=0,1697), ni tratamiento (p=0,2983) y el DPA fue afectado por el grupo racial (p=0,0169), las novillas Brahman tienen 86,46% menos de probabilidad de quedar preñadas que las Simbrah F1, sin embargo el DPA no fue afectado por el tratamiento (p=0.3965). Este estudio evidenció el mejor desempeño a nivel de crecimiento y desarrollo de estructuras reproductivas de las novillas del cruce Simbrah F1 comparado con las novilllas Brahman puras. Además, de los protocolos analizados, tanto el protocolo a base de GnRH como el de E2, tuvieron igual desempeño a nivel de actividad ovárica, de igual manera, el desempeño en la tasa de preñez de ambos fue similar, constituyendo ambos alternativas para el manejo reproductivo en novillas para carne. 1 1. INTRODUCCIÓN En Costa Rica, el 47,1% del territorio nacional es dedicado a las actividades agropecuarias, donde el uso del suelo para producción de ganado vacuno representa el 28,5% (INEC 2014). Lo que implica una actividad socioeconómica importante para el país, al generar trabajo y alimentos para la población (Holmann et al. 2007). Sin embargo, los parámetros productivos y reproductivos son bajos, pesos al destete de 178,1 kg/animal (107 - 283 kg), edad a primer parto de 31 meses (22 - 62 meses), intervalo entre partos de 454,6 días (294 - 1111 días) y periodo abierto de 176,8 días (20 - 828 días) (WingChing-Jones 2017). La situación económica actual requiere de explotaciones eficientes, donde el manejo reproductivo es fundamental en los hatos bovinos lecheros y cárnicos. La reproducción eficiente busca preñar los animales lo más rápido posible, posterior al periodo de espera voluntario después del parto, para reducir el intervalo entre partos y obtener el ideal del ternero al año. Esto implica que la vaca se debe preñar como máximo a los 82 días post parto, considerando 283 días de gestación (Cutaia 2005). No obstante, esto muchas veces no ocurre, debido a múltiples factores, entre ellos, ineficiente detección de celo, deficiencias nutricionales, disminución de fertilidad de las vacas por alta producción y estrés calórico en las regiones tropicales o subtropicales (Huanca 2001, Cutaia y Bó 2002). La detección de celo es una limitante en la tasa de servicio y por tanto, de la eficiencia reproductiva, por lo que se implementan múltiples estrategias para mejorar la detección, entre estas: aumento de observaciones visuales, uso de pintura en la grupa, toros desviados, chinball, hembras androgenizadas marcadoras, palpación rectal, parches, podómetros, collares, kits de progesterona en leche y monitores de actividad. Sin embargo, a pesar de las ayudas existentes, la detección de celo sigue siendo un problema en las explotaciones ganaderas (Catalano y Callejas 2001, Cutaia y Bó 2002, Bertin 2008). La inseminación artificial (IA) tiene como objetivo principal la mejora genética, ya que difunde rápidamente genes de alto valor dentro de la población, siendo una tecnología de bajo costo y exitosa (Vishwanath 2003, Giraldo 2007). Sin embargo, esta depende de la detección de celo, por lo que surge la inseminación artificial a tiempo fijo (IATF), la cual, en principio, no requiere de la detección de celos, lo que implica un aumento en la tasa de servicio y preñez (Cutaia 2005, Bó et al. 2008). Además, existen otras biotecnologías que 2 han tomado importancia en las últimas décadas, como la transferencia de embriones in vivo e in vitro, que propician un rápido mejoramiento genético (Carballo 2012). En la actualidad, existen muchos tratamientos disponibles para sincronización de la ovulación e IATF en novillas, vacas secas o vacas con cría, tanto para ganado de leche como de carne. Algunos utilizan un dispositivo intravaginal con progesterona (P4), además del uso de hormonas de aplicación intramuscular como prostaglandina (PGF2α), benzoato de estradiol (EB), cipionato de estradiol (ECP), valerato de estradiol (EV), hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) y gonadotropina coriónica equina (eCG) principalmente; esto para controlar el momento de la ovulación, obteniéndose alrededor del 50% de preñez (Cutaia 2006). A pesar de las bondades del estradiol para la sincronización de estro, su uso se convirtió en un tema controversial, debido a que le atribuyen cierto riesgo para la salud pública, por lo tanto, en Estados Unidos y el continente europeo está prohibido el uso de protocolos para sincronización de la ovulación con estradiol (Romero y Romero 2012). Por ejemplo, se ha asociado el consumo de productos de origen animal como las carnes, leche y sus derivados con la incidencia de cáncer de seno, útero y ovario, lo cual, es asociado con los remanentes hormonales sean endógenos o exógenos que dichos alimentos contengan (Ganmaa y Sato 2005). Con la idea de minimizar los riesgos para la salud humana por el uso de ciertos esteroides, la Unión Europea, desde 1981 eliminó el uso de compuestos estrogénicos utilizados como promotores de crecimiento en ganado de carne, posteriormente, a partir de octubre del 2006, restringió por completo el uso de 17-β-estradiol y sus derivados en protocolos de sincronización de la ovulación en ganado de carne o leche (Lane et al. 2008). En regiones como Centro y Sur América se sigue haciendo uso de estos esteroides como reguladores del ciclo estral (Prieto et al. 2016); sin embargo, existen en el mercado muchas alternativas para sincronización del estro que no utilizan estrógenos o sus derivados (DCRC 2017). En Costa Rica, el uso de protocolos con estradiol no es restringido, sin embargo, es probable que, en un futuro se limite su uso, ya sea por razones comerciales o de salud pública. En ese caso, sería necesario trabajar únicamente con protocolos libres de estradiol, en esta investigación se evaluará el desempeño de ambos tipos de protocolos bajo las condiciones de un sistema estabulado con novillas, con el objetivo de generar información para que los ganaderos dispongan de alternativas para el manejo reproductivo de sus hatos. 3 2. OBJETIVOS 2.1 General: Evaluar el desempeño de dos protocolos de sincronización de la ovulación para inseminación artificial a tiempo fijo con y sin el uso de estradiol, para generar información objetiva sobre las alternativas que existen para el manejo reproductivo en ganado de carne en el trópico. 2.2 Específicos: 2.2.1 Evaluar el desarrollo de las novillas bajo las mismas condiciones ambientales para asignarlas a los protocolos de sincronización e inseminación artificial a tiempo fijo. 2.2.2 Evaluar, por medio de ultrasonografía y niveles de progesterona en sangre, la respuesta ovárica de las novillas ante la sincronización con y sin el uso de estradiol. 2.2.3 Valorar el efecto de los diferentes protocolos de sincronización sobre la preñez a primer y segundo servicio en las novillas. 2.2.4 Estimar la relación beneficio-costo por tratamiento y vaca preñada a primer servicio 4 3. REVISION DE LITERATURA 3.1 Generalidades anatómicas del aparato reproductor en hembras bovinas Los órganos del aparato reproductor de la hembra incluyen la vulva, vagina, cérvix, útero, oviductos y ovarios, los cuales se describirán a continuación deforma caudal a craneal. 3.1.1 Vulva Es la parte posterior del aparato genital, la cual comprende el vestíbulo vaginal y los labios vulvares (Brito 2009), su principal función es la protección de las estructuras internas del sistema reproductor (Rivera 2009). 3.1.2 Vagina Se extiende desde el cuello del útero o cérvix hasta el vestíbulo, siendo el órgano copulatorio en el cual se deposita el semen durante condiciones de monta natural (Hafez y Hafez 2002, Brito 2009). 3.1.3 Cérvix o cuello del útero Es un esfínter fibroso formado por tejido conectivo y muscular liso, situado entre el útero y la vagina, presenta forma cilíndrica, con paredes gruesas y prominencias transversas conocidas como anillos cervicales (Brito 2009). Esta estructura varia en tamaño, según la edad, etapa productiva y número de partos; en novillas tiene una longitud de 8 - 10 cm y de 1,2 - 2 cm de ancho, en vacas varia de 10 - 15 cm de longitud y de 3 - 5 cm de ancho; sin embargo, las vacas Cebú y sus mestizas desarrollan un mayor grosor del cérvix, por hipertrofia del tejido colágeno (Brito 2009). Entre sus funciones se pueden mencionar: facilitar el transporte de espermatozoides hacia el útero por medio del moco cervical, actuar como depósito de espermatozoides, selección de espermatozoides viables y evitar la entrada de agentes externos al útero para evitar contaminaciones; durante la preñez se forma un tapón de moco para aislar el feto del medio exterior (Hafez y Hafez 2002, Rivera 2009). 3.1.4 Útero Consta de dos cuernos uterinos y un cuerpo. En vacas, el útero es bicornual, donde los cuernos son separados por un tabique y un cuerpo uterino que varía entre 3 - 4 cm de longitud (Hafez y Hafez 2002, Orellana y Peralta 2007). 5 El útero tiene varias funciones como el transporte de espermatozoides hasta el oviducto donde se da la fecundación, regulación del funcionamiento del cuerpo lúteo (CL) e inicio de la implantación, preñez y parto (Hafez y Hafez 2002). 3.1.5 Oviducto Son dos tubos flexuosos, formados por cuatro segmentos: fimbria que es el encargado de capturar el óvulo una vez que se dé la ovulación, el infundíbulo que tiene forma de embudo, la ampolla e istmo. Tienen una longitud de 20 - 30 cm que van desde las extremidades de los cuernos hasta los ovarios y se encargan de la captación del óvulo y su conducción hasta el útero (Hafez y Hafez 2002, Brito 2009). 3.1.6 Ovarios Los ovarios en las vacas muestran forma ovalada, miden entre 3,5 - 4 cm de longitud, 2,5 cm de ancho, con un peso de 15 - 20 g, sin embargo, el tamaño es influenciado por las estructuras presentes, principalmente por la presencia o no de CL y su tamaño (Orellana y Peralta 2007). Poseen funciones como la liberación de óvulos y producción de hormonas; además, están constituidos por corteza (capa externa) y médula (región interna). La médula consiste en un tejido conectivo fibroelástico y amplios sistemas de vascularización y nervios; mientras que la corteza presenta estructuras como los folículos y cuerpos lúteos en distintas etapas de desarrollo (Hafez y Hafez 2002, Brito 2009). 3.2 Pubertad en hembras bovinas El inicio del ciclo estral ocurre cuando se llega a la pubertad, la cual se define como el momento en que el animal es capaz de reproducirse fisiológicamente, por lo tanto, ocurre cuando se da la primera manifestación de celo, acompañada por la ovulación y posterior desarrollo de un CL (Ballent et al. 2003). Por otra parte, la madurez sexual es una definición zootécnica, ocurre cuando el animal puede llevar a cabo una concepción factible, tanto física como fisiológicamente (Araujo 2004). Sin embargo, existen los celos no puberales donde las novillas manifiestan el celo, pero no es seguido de una ovulación y posterior formación del CL (Bastidas-Mendoza 1999). Así mismo, se da la ovulación silenciosa (sin expresión de celo) la cual es común entre los 7 - 10 días antes del primer estro ovulatorio post parto (Atkins et al. 2013). 6 3.2.1 Desarrollo del aparato reproductivo en hembras Conforme se avanza en la edad de la hembra, se va generando un desarrollo corporal y del aparato reproductivo, en el cual hay ciertos periodos donde se da un mayor incremento de distintos órganos, siendo así, el útero aumenta de 9 - 14 mm desde la segunda semana de vida hasta los 2,5 meses, luego su crecimiento es más lento, a los 6 meses tiene un diámetro aproximado de 16 mm y aumenta nuevamente entre los 8 y 15 meses de edad presentando un diámetro de 21 mm, este crecimiento tiene una correlación con la secreción de estrógenos (E2) de los folículos de mayor tamaño generando el crecimiento y desarrollo del útero (Honaramooz et al. 2004). La longitud y el peso del útero también aumentan del nacimiento a los 12 meses de edad (desde 7,7 cm y 6 g a 24,3 cm y 150 g respectivamente) (Atkins et al. 2013). También se da un aumento en el peso ovárico durante los primeros 5 meses de vida y luego de los 8 a 12 meses de edad (Atkins et al. 2013), la longitud y diámetro del ovario aumenta desde la segunda semana de vida hasta los 3,5 meses, aumentando la longitud nuevamente de los 8,5 - 15 meses y el diámetro de los 7,5 - 11 meses de edad (Honaramooz et al. 2004). Además, entre los 1,5 - 3,5 meses de edad se da un aumento en el número de folículos ≥ 3 mm, así mismo, el tamaño de los folículos y el número de folículos antrales aumentan mientras la novilla madura, lo que comprende un periodo de 1,5 - 15 meses de edad (Honaramooz et al. 2004). 3.2.2 Evaluación del desarrollo reproductivo La palpación rectal es una técnica utilizada para diagnosticar preñez, además, ayuda a descartar hembras con anomalías reproductivas, también es empleada para determinar y clasificar el grado de desarrollo reproductivo, con el fin de establecer si la novilla entra o no a servicio, eliminar animales con algún problema reproductivo que no quedarían preñados, o descartar hembras que van a ser incorporadas en programas de IATF (Butler et al. 2015). Por medio de la palpación surge la clasificación del tracto reproductivo (RTS), el cual determina el estado del tracto reproductivo de las novillas antes de la temporada de reproducción. También es utilizado como indicador de las necesidades nutricionales y como herramienta de selección para edad a pubertad (Holm 2013). El RTS se basa en la determinación del diámetro y tono uterino, además del tamaño y presencia de estructuras ováricas, mediante una escala del 1 al 5 (Cuadro 1) (Robson et al. 2007). 7 Cuadro 1. Clasificación del grado de desarrollo reproductivo de las hembras Categoría Clasificación Cuernos uterinos Ovarios Largo (mm) Alto (mm) Ancho (mm) Estructuras ováricas 1 Prepuberal Inmaduro < 20 mm de diámetro, sin tono 15 10 8 Estructuras no palpables 2 Prepuberal 20 - 25 mm de diámetro, sin tono 18 12 10 Folículos de 8 mm 3 Peripuberal 25 - 30 mm de diámetro, ligero tono 22 15 10 Folículos 8 - 10 mm 4 Puberal 30 mm de diámetro, buen tono 30 16 12 Folículos > 10 mm, posible CL 5 Puberal > 30 mm de diámetro, buen tono y firme >32 20 15 Folículos > 10 mm, con CL presente Fuente: Adaptado de Holm et al. (2009), Atkins et al. (2013), Kasimanickam et al. (2016). De igual forma, se puede dar una puntuación según la posición del tracto reproductivo con respecto a la cavidad pélvica (Figura 1), donde SPS1 significa que el tracto reproductivo completo está dentro de la cavidad pélvica, SPS2 indica que el tracto reproductivo específicamente el cérvix está dentro de la cavidad pélvica, pero los cuernos uterinos están fuera de la cavidad y SPS3 expresa los tractos reproductivos donde tanto el cuello uterino como los cuernos están fuera de la cavidad pélvica y los números representan el tamaño del tracto reproductivo, siendo 1 pequeño y compacto, 2 intermedio y 3 grande. Además, se debe medir el diámetro de cada cuerno (2 cm más allá de la bifurcación) y del cérvix (en el centro) (Young et al. 2017). 8 C: cuello uterino, P: pelvis, RT: tracto reproductivo, PB: borde pélvico. Figura 1. Posición del tracto reproductivo con respecto a la cavidad pélvica. Fuente: Young et al. (2017). 3.2.3 Correlaciones de índices productivos con respecto a la pubertad La correlación de la ganancia diaria de peso (GDP) entre el nacimiento y destete, con respecto a la edad a pubertad es de -0,36, lo que indica que a mayor ganancia diaria de peso, menor será la edad al primer celo ovulatorio. Por cada 100 g de incremento en la ganancia diaria desde el nacimiento hasta el destete, implica de 15 - 20 días menos para manifestar el primer celo (pubertad). Así mismo, hay una correlación de 0,37 entre el peso al destete y el peso a pubertad, con una regresión que indica que por cada kilogramo más de peso al destete se obtendrá 0,8 kg más en peso a la pubertad (Bavera 2000). 3.2.4 Factores que afectan el momento en que se alcanza la pubertad Existen tres factores que afectan el momento en que un animal alcanza la pubertad, como: el peso y la edad, la genética y condiciones climáticas. El peso y la edad: Para estimar el peso ideal para reproducción, el animal debe alcanzar un 65 % del peso adulto; el peso va de la mano con la nutrición, ya que va a propiciar un correcto desarrollo del individuo tanto en crecimiento corporal como en los órganos reproductivos, el cual es lento en los primeros meses de vida (Araujo 2004). Las novillas Brahman alcanzan la pubertad a los 18 meses y deberían entrar a servicio con un peso de 320 - 340 kg, lo cual representa entre 60 - 70% del peso adulto (Bastidas- Mendoza 1999). Las razas pertenecientes a la subespecie Bos taurus llegan a pubertad entre los 6 - 12 meses de edad, con un peso aproximado de 200 - 250 kg (Forde et al. 2011). Además, existen otros indicadores que están asociados con el peso corporal, como lo es la condición corporal (CC) la cual debe estar entre 3 - 4 preferiblemente, aunque se acepta 9 superior a 2,5 en una escala de 1 - 5 (Rúgeles 2001, Faure y Morales 2003). El otro indicador es el RTS, el cual debe ser de 4 o superior (Faure y Morales 2003). Genética: Es otro factor importante, ya que los Bos taurus son más precoces que los Bos indicus, por lo tanto, los cruces entre razas de ambas subespecies, reducen el tiempo a pubertad con respecto al promedio de las razas progenitoras del Bos indicus, además, las razas de menor tamaño llegan a la pubertad antes que las de mayor tamaño. También el inicio de la pubertad se ve afectado por la correlación negativa entre la circunferencia escrotal del padre y sus hijas, mientras mayor sea la circunferencia escrotal del padre, la pubertad de las hijas se presenta a menor edad (Araujo 2004, Vásquez 2017). Condiciones climáticas: Las altas temperaturas retrasan el inicio de la pubertad, ya que se reduce la producción de E2 y del consumo de alimento, por lo tanto, un retraso en el crecimiento del animal (Araujo 2004, Vásquez 2017). 3.3 Fisiología del aparato reproductor en hembras bovinas 3.3.1 Ciclo estral en la hembra bovina El ciclo estral representa el patrón cíclico de la actividad ovárica comprendido entre la aparición del estro y el comienzo del siguiente, propiciando el período de receptividad sexual (celo o estro) por parte de las hembras (Carballo 2012). La vaca es un animal poliéstrico continuo (cicla durante todo el año); cada ciclo estral varía entre los 18 - 24 días, siendo 21 días el promedio (Forde et al. 2011). El celo tiene una duración de 6 a 18 horas con una ovulación alrededor de 24 - 32 horas de iniciado el estro (Sartori y Barros 2011). El ciclo estral se divide en 4 etapas: Proestro: Se determina por la desaparición del efecto de la progesterona producida por el CL, generando un inicio en la actividad folicular, esto debido al incremento de la hormona folículo estimulante (FSH) para estimular el crecimiento de folículos y aumentar la síntesis de estrógenos como fase preparatoria para el estro (Brito 2009, Urroz 2010). Estro: Se caracteriza por la manifestación de la libido y aceptación de la hembra a la monta, debido a elevados niveles de E2, durante esta etapa se produce la ovulación (10 - 12 horas después de terminado el estro) (Brito 2009) debido a la caída en los niveles de la hormona FSH y el incremento de la hormona luteinizante (LH) (Frandson et al. 2003). Metaestro: Se establece la transición de la fase estrogénica a la luteínica mediante la 10 formación del CL, por lo que los niveles de E2 disminuyen y los de P4 aumentan (Frandson et al. 2003) y si el animal fue fecundado se inicia el desarrollo de la gestación (Brito 2009). Diestro: Es una etapa de reposo sexual, donde prevalece la actividad progesterónica del CL (Brito 2009), sin embargo, si no hay fecundación el CL regresa por acción de la PGF2α liberado por el útero, dando inicio de nuevo al proestro (Urroz 2010). 3.3.2 Control hormonal del ciclo estral Este ciclo se encuentra regulado por el eje hipotálamo-hipófisis-ovario donde las hormonas actúan como mensajeros, que viajan a través de la sangre a los órganos blanco, para regular las fases del ciclo estral mediante sistemas de retroalimentación positiva y negativa (Callejas 2004, Forde et al. 2011). El hipotálamo, libera GnRH de manera pulsátil, la cual va a actuar sobre la adenohipófisis viajando por el sistema sanguíneo, para regular la secreción de los gonadótrofos (productores de LH y FSH), hormonas que propician el desarrollo y crecimiento de folículos en el ovario, induciendo la formación de un folículo dominante (FD) pre ovulatorio, el cual libera E2 que producen la conducta de celo y que tiene una retroalimentación positiva en el hipotálamo generando un pico de LH que induce la ovulación. Posterior a la ovulación se da la formación del cuerpo hemorrágico y formación del CL, lo que aumenta las concentraciones de P4 para el establecimiento y mantenimiento de la preñez. Si no se da la preñez, alrededor delos días 16 - 17 del ciclo, se da la liberación de PGF2α por parte del útero, la cual se encarga de la lisis del CL, esto reduce las concentraciones de P4 y aumenta la secreción de GnRH en el hipotálamo generando un nuevo ciclo (Forde et al. 2011,Lucio et al. 2016). 3.3.3 Dinámica folicular en la hembra bovina La dinámica folicular, se refiere al proceso de crecimiento, desarrollo, ovulación y atresia folicular e incluye el desarrollo del folículo dominante pre ovulatorio. Este desarrollo ocurre en forma de ondas (2 - 5 ondas durante el ciclo estral), sin embargo lo normal es que se presenten de 2 - 3 ondas foliculares (Forde et al. 2011). Este inicia con el reclutamiento de una cohorte de 5 - 20 folículos, de un tamaño mayor a 5 mm de diámetro, los cuales son estimulados por la FSH principalmente para su crecimiento, por lo que es una fase que se denomina FSH dependiente, después ocurre la selección de un folículo que se convierte en dominante, con un tamaño de 8,5 mm de diámetro aproximadamente y una diferencia de más de 1,5 mm con el folículo que le sigue en tamaño (Callejas 2004), durante la maduración del FD, se incrementan las 11 concentraciones de E2 e inhibina. Estas hormonas suprimen las concentraciones de FSH por medio de retroalimentación negativa, en esta fase, el FD es dependiente de LH. Las células de la granulosa del FD, adquieren receptores de LH, el E2 genera una retroalimentación positiva sobre el hipotálamo generando un aumento de LH para estimular su maduración final y ovulación. Por su parte, los folículos de menor tamaño son afectados por las bajas concentraciones de FSH, ya que las células de la granulosa de los folículos menores de 6 mm tienen receptores sólo de FSH, por tanto, sufren atresia. Aun así, el FD puede sufrir atresia si no se cuenta con las condiciones adecuadas para que se dé la ovulación, donde es necesario bajas concentración de P4 para que el folículo maduro ovule (Callejas 2004, Forde et al. 2011). 3.3.4 Diferencias fisiológicas reproductivas del Bos indicus y Bos taurus. Con el paso del tiempo, las razas pertenecientes a las subespecies Bos taurus y Bos indicus, se han desarrollado en ambientes diferentes y se han seleccionado para la producción de carne y leche. Debido a esta selección, el Bos taurus es eficiente para la ingesta de alimento y producción, pero no están adaptados al trópico, por lo que no expresan su máximo potencial; en contraste, el Bos indicus presenta una reducción menos severa en ingesta de alimento, tasas de crecimiento, producción de leche y función reproductiva en condiciones tropicales (Pegorer et al. 2007, Sartori et al. 2010). Estas diferencias reproductivas de ambas subespecies se aprecian en el Cuadro 2, donde el Bos Taurus alcanza la pubertad 8 meses antes, el estro dura 3,4 horas más y tienen más cantidad de folículos y son más grandes con respecto a las hembras Bos indicus. 12 Cuadro 2. Diferencias en la fisiología reproductiva de las distintas subespecies Característica Bos taurus Bos indicus Pubertad 16 - 18 meses 25 meses Ciclo estral 21 días Estro 16,3 h 21 días Estro 10,9 - 12,9 h Dinámica folicular 2 - 4 onda foliculares Menor cantidad folículos Selección de FD de 8 - 9 mm Folículo ovulatorio 14 - 18 mm Diámetro del CL 20 - 30 mm Mayores concentraciones séricas de E2 y P4 2 - 3 ondas foliculares Mayor cantidad folículos Selección de FD de 6 - 7 mm Folículo ovulatorio de 11 - 14 mm Diámetro del CL 17 - 21 mm Menores concentraciones séricas de E2 y P4 Estrés térmico Mas afectación en el área reproductiva Menos afectación en el área reproductiva Fuente: Modificado de Sartori et al. (2010), Sartori y Barros (2011). Debido a estas diferencias, en el trópico se implementan los cruces de estas subespecies, obteniendo una respuesta fisiológica intermedia con respecto a la de sus progenitores, mejorando la fertilidad, producción de leche, longevidad, tolerancia térmica y a parásitos, entre otros. No obstante, esto dependerá del porcentaje de sangre que se tenga de cada subespecie, para aprovechar la heterosis (Negussie et al. 1999, Nogueira 2004, Grajales et al. 2006). Además de estas diferencias reproductivas entre subespecies, también existen diferencias entre novillas y vacas (Cuadro 3). 13 Cuadro 3. Diferencias en la fisiología reproductiva entre vacas lactantes y novillas. Característica Vaca Lactante Novilla Duración del estro 7,3 h 11,3 h Duración del ciclo estral 22,9 d 20 d Índice concepción por IA 35% 70% Índice gemelar 10% 1% Gestaciones perdidas 20% 5% Índice de anovulación 20% Menor a 1 Ciclos con más de dos ondas foliculares 71% 50% Ovulaciones múltiples 25% 1% Concentración máxima de estradiol 7,1 pg/ml 9,4 pg/ml Fuente: Bach (2002). 3.3.5 Factores que afectan la detección de celo y preñez. Se debe tomar en cuenta que existen distintos factores que afectan la detección de celo y preñez como lo son: Clima: Los animales expuestos a altas temperaturas y porcentajes de humedad elevados, sufren de estrés calórico, esto provoca una disminución en la duración del celo de entre 5 - 6 horas (Catalano y Callejas 2001), además de una menor intensidad del estro, disminución de las tasas de fertilidad y aumento de pérdidas embrionarias (Lozano et al. 2005, Sartori et al. 2010). Componente racial: El ganado Cebú (Bos indicus) presenta un celo más corto y menor precocidad que las razas Europeas (Bos taurus) (Prada et al. 2013), además, en ambas subespecies, un tercio de las hembras empiezan y terminan el comportamiento de celo durante la noche (Pinheiro et al. 1998). Nutrición: Es un factor clave para la llegada de la pubertad y reproducción, ya que la actividad cíclica en la hembra no es prioridad debido a que otras funciones como mantenimiento, crecimiento y producción son prioritarias, como consecuencia, la ciclicidad se expresará cuando exista un balance positivo de cantidad y calidad de la dieta (Catalano y 14 Callejas 2001, Aban et al. 2008). Además, los animales que no consumen la energía (glucosa o precursores glucogénicos) metabolizable necesaria, generan un aumento en los niveles de cuerpos cetónicos (β- hidroxibutirato) y ácidos grasos no esterificados (por mayor movilización de grasas) que inhiben la producción de LH (Hess et al. 2005, Ahmadzadeh et al. 2011). Así mismo, al utilizar sus reservas corporales se genera una menor concentración de leptina, retrasando la ciclicidad, ya que no propician su efecto inductor en la secreción de LH (Ball y Peters 2004). La condición corporal es un indicador del estatus nutricional de los animales; se considera que dentro de una escala de 1 a 5, los animales deben estar en 2,5 ó 3, para obtener porcentajes de preñez cercanos a 52,3% y 57,7% respectivamente mediante IATF (Cutaia et al. 2003). Factor humano: Genera un alto impacto sobre la reproducción. Por ejemplo, la detección de celo visual se limita cuando el encargado de detectar celo no cuenta con el conocimiento necesario, no le dedica el suficiente tiempo (2 - 3 observaciones diarias como mínimo de 40 - 60 minutos cada observación), o si se tienen fallas en la identificación de los animales y carencia de registros (Catalano y Callejas 2001). A mayor detección de celos, mayor tasa de servicio y aumenta el número de preñeces en la finca. 3.4 Inseminación artificial La inseminación artificial es una biotecnología que difunde genes de alto valor genético, la cual consiste en la aplicación, por métodos artificiales, de semen fresco o congelado en el tracto genital de una hembra, en el momento adecuado para que se dé la fecundación (Giraldo 2007). Entre las ventajas que aporta la IA se encuentran: acelera la mejora genética mediante un incremento en la frecuencia del uso de sementales probados, mejora el uso del semental, ya que de un eyaculado se puede inseminar a varias hembras, evita la transferencia de enfermedades, evita tener un macho en el hato y su manutención, estimula el uso de registros y facilita la implementación de programas de sincronización y cruces. También presenta desventajas como la detección de celo, inversión y capacitación en esta biotecnología, el uso de termos y el correcto descongelamiento del semen (Giraldo 2007). Por lo tanto, la IA junto con la sincronización del estro y la ovulación resulta ser una biotecnología eficiente y rentable para propiciar el mejoramiento genético, para cualidades como peso al nacimiento, peso al destete, facilidad de parto, producción láctea y cárnica, 15 entre otros, además de que elimina el problema de la ineficiente detección de celo en fincas (Cutaia 2005). 3.5 Inseminación artificial a tiempo fijo. El ciclo estral se puede modificar mediante el uso de hormonas exógenas, esto permite controlar el momento de la ovulación, mediante los distintos protocolos de IATF, la cual permite inseminar un gran número de animales en un periodo corto de tiempo (Colazo 2014). La IATF permite: evadir la detección de celo, reduce el tiempo de inseminación y encierres (número de veces que los animales ingresan a la manga de manejo), acorta el periodo de anestro post parto, útil en animales con celos silenciosos, aumenta la proporción de vientres que se preñan temprano, aumenta los kilogramos de terneros destetados, mejora la atención de partos al concentrarse en un periodo, se puede hacer uso del destete precoz al obtener terneros más homogéneos y se puede mejorar la utilización del recurso forrajero (Cutaia 2005). Además, se podría tomar como desventaja el costo de las hormonas utilizadas en los protocolos. Según Cutaia (2005), se deben considerar cinco factores antes de implementar un programa de IATF, entre ellos: Estado fisiológico de los vientres: Las novillas deben tener por lo menos el 65% de su peso adulto, se debe determinar el grado de desarrollo del tracto reproductivo y deben estar ciclando. Las vacas con cría se deben inseminar después de 60 días post parto, permitiendo una adecuada involución uterina y tomando en cuenta el amamantamiento, ya que este compromete la ciclicidad, debido a que la percepción física, visual y olfatoria tiene un efecto en el sistema neuroendrocrino que se encuentra relacionado con la liberación de péptidos opioides endógenos como β-endorfina, prolactina y oxitocina que inhiben el eje hipotálamo- hipófisis-ovario, mediante la supresión de la liberación pulsátil de LH, fallas en ovulación y presencia de anestro post parto prolongados (Yavas y Walton 2000). Condición corporal: Es otro factor importante, por lo que se debe trabajar con animales con una CC entre 2,5 - 3,5 para obtener buenos resultados de preñez, ya que no se ve afectada la producción de hormonas que regulan el ciclo estral (López 2006). Instalaciones y el personal: Es uno de los factores primordiales, ya que el tratamiento es estricto en cuanto a tiempo de realización, además se debe generar el menor estrés posible para los animales (Cutaia 2005). Sanidad: Es importante, ya que del 40 - 50% de las fallas reproductivas se debe a 16 enfermedades transmisibles, por lo que antes de dichos tratamientos se debe verificar el estado sanitario de los vientres principalmente para enfermedades como Campylobacteriosis, Tricomoniasis, Brucelosis, Lesptospirosis, IBR, Neosporidiosis, Micoplasma, Clamidias, Ureoplasmas y Haemophilus (Cutaia 2005). Calidad seminal: El semen después de descongelado debería tener como mínimo un 40% de células motiles, una concentración de 5 - 10 millones de células por dosis y la morfología debe presentar un mínimo de 70% de espermatozoides normales, no más de 15 - 20% de defectos en cabezas y del 25% de defectos en cola y acrosoma (Cutaia 2005). 3.5.1 Protocolos de sincronización de la ovulación e IATF Existen diversos tratamientos para controlar el ciclo estral, estos protocolos utilizan diferentes compuestos con estradiol (EB, ECP o EV) y GnRH principalmente. En el caso de los primeros, los más efectivos son los que utilizan estrógenos y progesterona, mientras que con relación a los segundos, los que combinan GnRH con PGF2α (Cutaia 2005). Prostaglandinas: Su uso es común en la sincronización de la ovulación, sin embargo, presenta la limitante de que los animales deben estar ciclando y en un estadio apropiado del ciclo estral, por lo que se diseñaron distintos protocolos (Colazo et al. 2007): • Tratamiento con 2 dosis de PGF2α, con un intervalo de 10 u 11 días entre las dosis, también hay estudios que indican una concepción más alta con intervalos de 14 días, por la posible presencia de un folículo dominante (Folman et al. 1990), para este protocolo se recomienda inseminar los animales que presentan celos con la primera dosis y solo aplicar la segunda dosis a los animales que no presentaron celo, porque depende del momento de la etapa de diestro en que se encuentre, ya que es mayor la respuesta de celo y tasas de concepción en diestro avanzado que respecto al diestro temprano o medio (Diskin et al. 2002). • Otro método es detectar celo e inseminar los animales durante 5 días y tratar con PGF2α los animales que no entraron en celo y continuar con la detección de celo e IA por 5 - 6 días más. • Por último, se puede combinar la palpación rectal de las estructuras ováricas y el tratamiento con PGF2α en los animales que presentan un CL funcional, los cuales entrarían en celo de 2 a 3 días luego de aplicar la hormona. 17 Otro uso de la prostaglandina es combinándola con estradiol y gonadotropina coriónica humana (hCG), sin embargo, los animales deben tener un CL, a continuación se describen algunos de estos tratamientos: • Una dosis de PGF2α, posterior a las 12 horas se le aplica 250 UI de hCG además de 1 mg de EB y se insemina a las 48 horas después de la prostaglandina obteniendo preñeces de 57,8% (Lopez-Gatius 2000) • Dos dosis de prostaglandina, una dosis de PGF2α al día 0 y otra al día 14, en el día 7 se le aplica 1,5 mg de 17β-estradiol y 50 mg de P4, se observan por 3 días y se inseminan las que entren en celo y las que no entran en celo se les aplica GnRH el día 18 y se inseminan, obteniendo porcentajes de preñez de 60% en la primera inseminación y una preñez general de 49% (Colazo et al. 2007). Así mismo, las prostaglandinas son utilizadas como parte de protocolos de pre sincronización, ya que presenta varios beneficios: si el animal ovula con el uso de GnRH se da un período de dominancia más corto, lo que genera un ovocito de mejor calidad (más joven) (Astiz y Fargas 2013). Además, si el CL es inducido por protocolos con pre sincronización se genera mayor cantidad de P4 durante el crecimiento del folículo, lo que propicia un ovocito de buena calidad mejorando la fertilidad (Bisinotto et al. 2010, Santos et al. 2010). Progestágenos: Estas suprimen el estro y evita la ovulación, ya que la P4 reduce la frecuencia de los pulsos de LH, lo que suprime el crecimiento del FD, sin embargo, la P4 no suprime la secreción de FSH por lo que las ondas foliculares se siguen generando si hay un CL funcional (Savio et al. 1993, Bleach et al. 2004). Es importante recalcar que los progestágenos son menos eficientes para controlar el ciclo estral que la progesterona endógena (producida por un CL) mediante la supresión de la secreción de LH, lo que genera el desarrollo de folículos persistentes, es decir, ovocitos envejecidos que afectan la fertilidad (Savio et al. 1993). El dispositivo intravaginal es una opción para reducir el problema de los folículos persistentes, donde este debe permanecer en la vagina durante cierto tiempo (varía según el protocolo a usar), además, se aplica PGF2α 24 horas antes de retirar el dispositivo y la detección de celo inicia 48 horas post retiro del dispositivo (Colazo et al. 2007). Progesterona y estradiol: Antes de la aparición de la PGF2α, el estradiol se utilizaba para 18 propiciar la liberación endógena de PGF2α y la luteólisis, por lo que se reduce la probabilidad de generar un folículo persistente (Odde 1990). Otra ventaja del uso de estradiol de acción corta (17β-estradiol) con progestágenos es la regresión folicular, generándose así una nueva onda folicular a los 3 - 5 días posteriores, independientemente del estadio del ciclo estral en que se encuentre el animal al momento del tratamiento (Bo et al. 1995). Así mismo se ha estudiado el uso de otros ésteres de estradiol como el ECP y EV en dosis de 0,5 - 1 mg combinados con progestágenos, los cuales son utilizados eficientemente en protocolos de IATF en novillas de carne y leche (Colazo et al. 2005) GnRH: Esta hormona sintética se utilizó como tratamiento para quistes foliculares a partir de 1970, como sustituto de la hCG, ya que su valor era alto (Drost y Thatcher 1992). En bovinos con folículos mayores a 10 mm de diámetro, el uso de esta hormona induce su ovulación, con el posterior desarrollo de una nueva onda folicular 2 días después del tratamiento, a los 6 ó 7 días después se aplica PGF2α que propicia la ovulación del nuevo FD de esa nueva onda y se hace más eficiente si se administra una segunda dosis de GnRH 36 - 48 horas después de la PGF2α (Thatcher et al. 1993, Pursley et al. 1995). El protocolo base con el uso de GnRH es el Ovsynch, el cual consiste en la aplicación de una inyección de GnRH el día 0, seguida de una dosis de PGF2α al día 7 y una segunda dosis de GnRH al día 9 y se insemina 16 a 22 horas después de aplicar la segunda dosis de GnRH (Stevenson et al. 2004, Bó et al. 2008). Este protocolo es más eficiente en vacas lecheras en lactancia que en novillas, ya que después de primera inyección de GnRH ovula el 85% de las vacas, pero solo el 54% de las novillas (Colazo et al. 2007). Además, el 20% de las novillas presentaron celo antes de la inyección de PGF2α lo que reduce la fertilidad a la IATF (Colazo et al. 2007). De igual forma, en otro estudio realizado por Martínez et al. (1999) corroboraron que el uso de GnRH provoca la ovulación del FD sólo en el 56% de las novillas, por lo que no promueve de manera uniforme el inicio de una nueva onda folicular, lo que genera bajas tasas de preñez en novillas. Otro factor que influencia la tasa de preñez en este protocolo es el estadio del ciclo estral a la hora de aplicar el protocolo, donde entre los días 1 y 4 ó 13 y 17 del ciclo se obtienen tasas muy bajas con respecto a otros iniciados en otros momentos, con valores de 20 vs 50% respectivamente (Colazo et al. 2007); esto debido a que durante el metaestro el FD puede no responder a la dosis inicial de GnRH y se genere la atresia cerca del momento de aplicación de la PGF2α. En los días 13 a 17, el FD de la segunda onda puede que no ovule debido a la primera dosis de GnRH, por lo que la PGF2α endógena podría causar luteólisis y la ovulación temprana del FD (respecto a la IATF) 19 causando infertilidad (Colazo et al. 2007). A partir del protocolo Ovsynch se desarrollaron otros tratamientos con ciertas variantes, como es el caso del Cosynch con la diferencia de que se insemina en el mismo momento de la aplicación de la segunda dosis de GnRH (Bó et al. 2008). Otra variante es el Ovsynch + dispositivo intravaginal, Cosynch + dispositivo intravaginal, Heatsynch + dispositivo intravaginal los cuales hacen uso del dispositivo intravaginal entre la primera inyección de GnRH y la inyección de PGF2α (Bó et al. 2008), la adición de este dispositivo mejora las tasas de preñez en novillas de 39% (Ovsynch) a 68% (Ovsynch + dispositivo intravaginal) (Martinez et al. 2002). Además, del uso combinado con sales de estradiol como es el caso del Heatsynch, el cual consiste en la aplicación de una inyección de GnRH el día 0, seguida de una dosis de PGF2α al día 7 y una dosis de ECP al día 8 y se insemina 42 a 50 horas después de aplicar ECP (Stevenson et al. 2004). Con respecto a las variantes en el momento de inseminación, diferentes estudios concuerdan que se obtienen porcentajes de preñez aceptables, inseminando entre un mínimo de 48 horas y un máximo de 62 horas post retiro del dispositivo (Fernandes et al. 2001, Ayres et al. 2008, Madero et al. 2012). Sin embargo, al utilizar ECP algunos animales puede que ovulen antes, lo que puede afectar la preñez (Colazo et al. 2003). Un estudio realizado por Bó y Cutaia (2014) corrobora lo mencionado anteriormente, ya que evaluaron el efecto del momento de IATF (48 o 54 h post retiro del dispositivo intravaginal) con respecto a la tasa preñez, donde no se encontraron diferencias significativas (45,5% y 51,4% respectivamente), pero las diferencias numéricas favorecieron a las inseminadas 54 horas post retirado el dispositivo. 3.5.2 Función de las hormonas en los protocolos aplicados En la IATF la primera dosis de GnRH o E2 genera la ovulación de los folículos existentes con capacidad ovulatoria, impidiendo la formación de folículos persistentes durante el tiempo de acción del dispositivo intravaginal, mientras que la P4 proveniente del dispositivo intravaginal provoca la atresia de los folículos en crecimiento. A los 3 - 4 días de la aplicación de GnRH o E2, se da la ovulación y emergencia de una nueva onda folicular, lo que asegura la presencia de un folículo y un ovocito viable al momento del retiro del dispositivo. El dispositivo sincroniza el desarrollo folicular, ya que simula la función del CL, por lo que permanece de 7 - 8 días en el tracto reproductivo, cuando este es retirado se da una caída en los niveles de P4, lo que induce al aumento de los niveles de LH, lo que provoca el crecimiento y persistencia del FD, produciendo altas concentraciones de E2 que propicia la 20 manifestación de celo y un pico de LH que induce la ovulación y la PGF2α o su análogo, produce la regresión de algún CL existente provocando una rápida caída de P4. La segunda dosis de GnRH o E2 ocasiona las manifestaciones de celo e induce el pico de LH para que se dé la ovulación del folículo dominante (Bó et al. 2008, Uslenghi et al. 2010, Bó y Cutaia 2014). Además, los protocolos que utilizan dispositivo intravaginal permite sincronizar animales cíclicos e inducir desarrollo folicular y ovulación en animales en anestro, sin embargo, la reducción en las tasas de concepción se puede dar debido a que algunas vacas tienen una fase luteal posterior más reducida, lo que genera tasas de concepción menores que en las vacas cíclicas, por lo tanto, el uso del dispositivo mejora la tasa de preñez entre el 6 - 8% (Bó et al. 2008, Stevenson et al. 2006). El uso de protocolos de sincronización genera un gran número de encierres (por manejo animal) que pueden provocar estrés y por lo tanto una disminución de la fertilidad y como consecuencia un fracaso de la IATF. Para disminuir el número de encierres el uso del ECP (compuesto de estradiol que genera una respuesta biológica (ovulación) más lenta que el EB), al momento del retiro del dispositivo como reemplazo del EB a las 24 horas, es una alternativa para reducir el número de encierres y que no se vea afectada la preñez (Uslenghi et al. 2010, Bó y Cutaia 2014). 3.6 Restricciones en el uso de productos hormonales en producción bovina En la producción bovina, es común el uso de promotores de crecimiento; que incluyen desde el uso de hormonas sintetizadas por el organismo hasta sustancias sintéticas que aceleran el desarrollo de los animales y mejoran los rendimientos mediante la disminución del tiempo de crecimiento o aumentando la síntesis proteica, sin embargo, los residuos de dichas sustancias pueden quedar en los productos destinados para consumo, generando problemas de salud al ser humano (Fajardo-Zapata et al. 2011). Algunos productos anabólicos utilizados, contienen estradiol, progesterona o sus análogos, los cuales se administran por medio de implantes subcutáneos o inyectados, donde los niveles de la hormona aumentan considerablemente y por lo tanto, los residuos también, por lo que se debe respetar el tiempo de retiro según el tipo de sustancia y la legislación de cada país. En estudios in vivo, se ha demostrado rompimientos del ADN y daños oxidativos por el uso del 17-β-estradiol, dando como resultado la multiplicación de células que provocan cáncer de mamas (Fajardo-Zapata et al. 2011) 21 Como se mencionó, con la prohibición del uso estrógenos en países de la Unión Europea, Estados Unidos y Nueva Zelanda, debido a que representan un riesgo para la salud pública (Lane et al. 2008, Romero y Romero 2012), se puede llegar a prohibir en todo el mundo, lo que lleva a la problemática de la reducción de protocolos que se pueden utilizar para IATF, sin embargo, existen alternativas como lo son los protocolos a base de GnRH, además de que dicho uso podría generar oportunidad de mercado en cuanto a exportación a países que tienen dicha prohibición. 22 4. PROCEDIMIENTO Y METODOLOGIA El estudio se realizó en la Finca de Producción Animal de la Escuela de Zootecnia, de la Universidad de Costa Rica, la cual está ubicada en la Estación Experimental los Diamantes. Ésta finca, se desarrolla por el convenio de cooperación INTA - MAG - UCR, se ubica en la provincia de Limón, en el cantón de Pococí, distrito de Guápiles. La posición geográfica de la finca es 10°, 13’ latitud Norte y 86°, 46’ longitud Oeste, con una altitud de 249 msnm, una temperatura promedio de 24,5 °C, humedad relativa promedio de 82,3% y una precipitación promedio de 321,7 mm mensuales (no había registro de datos para los meses junio, julio y agosto del 2017, por lo que no se presentan en las figuras), esto durante el tiempo en que se realizó el ensayo (INTA 2018), lo cual se aprecia en las Figuras 2, 3 y 4. Figura 2. Temperatura ambiental mensual y promedio durante el tiempo en que se realizó el ensayo. Meses de junio, julio y agosto 2017 sin datos. Fuente: Estación meteorológica CORBANA, La Rita, Pococí, Limón. 20 21 22 23 24 25 26 Te m pe ra tu ra (º C ) Mes-año 23 Figura 3. Humedad relativa mensual y promedio durante el tiempo en que se realizó el ensayo. Meses de junio, julio y agosto 2017 sin datos. Fuente: Estación meteorológica CORBANA, La Rita, Pococí, Limón. Figura 4. Precipitación mensual y promedio durante el tiempo en que se realizó el ensayo. Meses de junio, julio y agosto 2017 sin datos. Fuente: Estación meteorológica CORBANA, La Rita, Pococí, Limón. 4.1 Generalidades de manejo La parte experimental del proyecto se llevó acabo de marzo del 2017 a julio del 2018. Se ejecutó con un total de 60 animales, 30 pertenecientes al grupo racial Brahman y 30 Simbrah F1 (50% Simmental y 50% Brahman), provenientes de la provincia de Guanacaste. Dichos animales se compraron con una edad de 8 meses y un peso promedio de 220 kg (203 kg para Brahman y 238 kg para Simbrah F1). Durante el experimento, se perdieron dos 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Hú m ed ad re la tiv a (% ) Mes-año 0 100 200 300 400 500 600 700 Pr ec ip ita ci ón (m m ) Mes-año 24 animales Simbrah F1, en un caso debido a una quebradura de pata y en el otro a problema de adaptación al establo. Durante el estudio, las terneras fueron estabuladas en 10 corrales, con un área de 35 m2 cada uno, techados en su totalidad, delimitados por tubos metálicos y piso de cemento. Cada corral poseía una canoa para alimentación, así como un salero y una pila para consumo de agua. La distribución fue de 6 animales por corral, la cual se hizo según el grupo racial y estratos de peso, para obtener grupos lo más homogéneos posibles. Su manejo consistió en una alimentación fraccionada en dos veces al día y un lavado diario de los corrales. Posterior al periodo de adaptación, el cual fue de 15 días, se realizaron pesajes mensuales hasta el momento de servicio, el cual fue a los 19 meses de edad; a partir de los 12 meses de edad se realizó mensualmente evaluaciones ultrasonográficas trans rectales. Con respecto a la alimentación, todos los animales recibieron la misma dieta, la cual estuvo conformada por pasto picado King Grass (Pennisetum purpureum) a los 60 días de edad, banano verde con cáscara, cáscara de banano maduro, alimento balanceado del (crecimiento y reproducción), urea y minerales. El alimento de crecimiento, contenía 16% PC, 3250 Kcal/kg ED, 1,10% Ca y 0,4% P, mientras que el de reproducción varió a 13% PC, 3225 Kcal/kg ED, 1% Ca y 0,4% P. En el Cuadro 4, se muestra la cantidad promedio diaria ofrecida de alimento a los animales, el alimento balanceado de crecimiento se utilizó desde el inicio del experimento hasta los12 meses de edad y a partir de ahí se utilizó el alimento de reproducción hasta servicio. Cuadro 4. Cantidades diarias de los componentes de la dieta brindada a las novillas Alimento Cantidad ofrecida de materia fresca (kg/día) Pasto King grass Libre consumo (5,72)* Banano verde Libre consumo Cáscara de banano maduro Libre consumo (37,21)* Concentrado de crecimiento / reproducción 2,5 Urea 0,107 (0,11)* Minerales Libre consumo (0,15)* *Consumos promedios aproximados por animal. 25 4.2 Evaluaciones con ultrasonido Se evaluó mediante ultrasonografía el momento en que las novillas llegaron a pubertad (presencia de CL), además de conocer el desarrollo del tracto reproductivo en términos de tamaño y textura de los cuernos uterinos, tamaño, presencia y medidas de las estructuras ováricas (lo cual es conocido como RTS); además de la posición del tracto reproductivo respecto a la cavidad pélvica. Posteriormente, cuando estuvieron listas para empadre (67% de los animales ciclando y mínimo 70% de peso vivo adulto) se utilizaron dos tratamientos, con y sin el uso de estradiol, donde los animales fueron distribuidos de la manera más balanceada posible entre los tratamientos, tomando en cuenta ciclicidad, RTS y peso. Así mismo, durante los días en que se aplicó hormonas y al día 7 post inseminación, en una sub muestra de los animales, se realizó ultrasonografía para conocer la dinámica ovárica como respuesta a los tratamientos. Al día 7 post inseminación también se realizó ecografía para medir la grasa dorsal. Al día 35 post inseminación (primer o segundo servicio) se realizó el diagnóstico de preñez por medio de ultrasonido a todas las novillas sometidas a los tratamientos; las novillas vacías se resincronizaron con el mismo protocolo utilizado en cada animal para el primer servicio. 4.3 Evaluación de concentraciones de progesterona en sangre El día de la aplicación de la prostaglandina, el día de inseminación y 7 días después de la inseminación se tomaron muestras de sangre para evaluar las concentraciones de progesterona en sangre como indicador de la respuesta a los protocolos. La sangre se obtuvo por medio de venopunción en la base de la cola, en la vena coccígea o en algunos casos de la vena yugular, mediante el uso de una funda o camisa, aguja para vacutainer (grado 20 de 1 ½ pulgadas) y el tubo vacutainer (siliconizado con activador de coágulo), las cuales se dejaron reposar por 10 - 15 minutos para favorecer la precipitación, posteriormente se centrifugaron durante 15 minutos a una velocidad de 3000 rpm a 60 Hz en una centrifuga modelo DSC-200T, esto para separar el suero, el cual se congeló a -20 °C hasta obtener todas las muestras y enviarlas al Laboratorio de Fisiología de la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional para su posterior análisis. En dicho laboratorio, las muestras se analizaron como se indica en un estudio de parámetros sanguíneos y perfil de hormonas reproductivas realizado por Herrera-Vargas et al. (2017); estas muestras se 26 cuantificaron utilizando un equipo automatizado, el cual realiza una detección hormonal por medio de un ensayo basado en la inmunoabsorción ligado a enzimas fluorescentes, las cuales contienen perlas magnetizadas impregnadas con anticuerpos para las hormonas y además, se utilizan enzimas marcadas con un antígeno de interés, (en este caso las hormonas) para realizar la detección y cuantificación, dicha cuantificación se realizó con la medición de la cantidad de enzima que se adhiere a las perlas, la cual es inversamente proporcional a la concentración de la hormona en la muestra. 4.4 Protocolos o tratamientos Se utilizaron los siguientes protocolos para novillas, debido a que son de duración corta y los días de manejo coinciden, lo que nos permite compararlos: Protocolo 1 (P1): El día 0 se colocó un dispositivo intravaginal para bovinos, el cual contiene 0,6 g de progesterona. Se aplicó una dosis de 2 ml (0,1 mg) de acetato de gonadorelina, al día 7 se retiró el dispositivo y se inyectó 2 ml (0,15 mg) de cloprostenol, el día 9 se inyectó 2 ml (0,1 mg) de acetato de gonadorelina y se inseminó entre las 51 - 53 horas de retirado el dispositivo. Protocolo 2 (P2): El día 0 se colocó un dispositivo intravaginal para bovinos, el cual contiene 0,6 g de progesterona y una dosis de 2 ml (2 mg) de benzoato de estradiol (EB), al día 7 se retiró el dispositivo intravaginal, se inyectó 2 ml (0,15 mg) de cloprostenol y una dosis de 1 ml (0,5 mg) de cipionato de estradiol (ECP) y el día 9 se inseminó entre las 51 - 53 horas de retirado el dispositivo. Dichos protocolos se aprecian en la Figura 5. Figura 5. Protocolos utilizados en el experimento, P1 y P2 respectivamente. Fuente: BRTF (2017), Uslenghi et al. (2010). 4.5 Variables medidas Los datos se obtuvieron de la siguiente manera: Peso vivo: Desde que llegaron los animales (8 meses de edad) hasta el servicio (19 meses de edad), se pesaron una vez al mes, mediante el uso de una báscula portátil equipada con PPGF2⍺ + ECP IAPEB P9 DP7 DP0 D PDispositivo intravaginal PPGF2⍺ GnRH + IAPGnRH P9 DP7 DP0 D PDispositivo intravaginal 27 barras de carga, esto para obtener ganancias diarias de peso y realizar curvas de crecimiento. Condición corporal: Se realizaron tres mediciones de CC, a los 12, 15 y 18 meses de edad, mediante un sistema de clasificación de reservas corporales en una escala de 1 a 5. Espesor de la grasa dorsal: También se midió el espesor de la grasa dorsal (EGD) en mm mediante ultrasonografía entre la 12ª y 13ª costilla sobre el músculo dorsal largo (longissimus dorsi), por medio de un escáner de ultrasonido con sonda lineal de 3,5 MHz. Desarrollo del tracto reproductivo: A partir de los 12 meses de edad de los animales, se realizaron ultrasonografías transrectales de forma mensual, por medio de un escáner de ultrasonido con sonda lineal transrectal de 7,5 MHz, en las cuales se tomaron medidas del diámetro del cérvix (DC) (aproximadamente a la mitad del cérvix), diámetro del cuerno derecho (DCD) (1 - 2 cm de la bifurcación), largo y ancho de ambos ovarios, obteniéndose un promedio de ambas medidas para generar el diámetro del ovario. Además, se determinó el tamaño de estructuras presentes en los ovarios (folículos y cuerpos lúteos), para los folículos se contó el número de estas estructuras en cada ovario y se les midió el diámetro con el caliper del equipo para clasificarlos en tres categorías: F1 (diámetro ≥ 10 mm), F2 (diámetro 9 - 6 mm) y F3 (diámetro ≤ 5 mm); para los cuerpos lúteos se tomaron medidas de largo y ancho y se midió su cavidad cuando la presentó, las medidas se reportan en diámetro promedio total y neto. Dichas medidas se reportaron en milímetros (mm). Así mismo, se midieron otros datos como la temperatura corporal rectal, mediante un termómetro digital, posición del tracto reproductor respecto a la cavidad pélvica y textura del útero por medio de palpación. La información fue recolectada mediante una ficha de campo diseñada para ese fin (Anexo 1). Respuesta ovárica: Se realizaron ultrasonidos los días en que se aplicaron hormonales, para conocer la dinámica ovárica, además del día 7 post inseminación para evaluar el desarrollo del cuerpo lúteo. También, el día de la aplicación de la prostaglandina, el día de inseminación y 7 días después de la inseminación se tomaron muestras de sangre para evaluar las concentraciones de progesterona en sangre. Los ultrasonidos se realizaron solo en 40 animales (20 Brahman y 20 Simbrah F1), mientras que los sangrados se realizaron a 24 animales (12 Brahman y 12 Simbrah F1), esto debido a la distribución por tratamiento, tiempo y por comportamiento del animal. 28 Diagnóstico de preñez: Se hizo por medio de ecografía a los 35 días después de la inseminación a primer y segundo servicio. Las novillas vacías, se resincronizaron con el mismo protocolo utilizado en cada animal para el primer servicio. Relación beneficio-costo: Se realizó la estimación beneficio-costo, por tratamiento y vaca preñada a primer servicio, para obtener los costos para cada protocolo se tomó en cuenta solo los hormonales utilizados, sin incluir la compra de semen, ni mano de obra del inseminador, ni alimentación, ni ningún tipo de mano de obra en general, además, se tomó en cuenta el porcentaje de preñez alcanzado en cada protocolo, para corregir el costo por animal, que pasa de ser servido a preñado; como ingresos (beneficio) se tomó en cuenta que la vaca preñada produce un ternero al destete de 220 kg, el cual se vende a ₡885 por kilogramo de peso vivo (precio promedio en subasta El Blanco S.A. al 18/02/2019, tipo de cambio $1 = ₡615,12) y se le resta el costo por preñez para obtener los ingresos netos. Y luego se obtiene la relación beneficio-costo mediante una division de los beneficios entre los costos para determinar la viabilidad del proyecto. Debido a los resultados de preñez obtenidos, se evaluó comparativamente con los resultados de otro experimento que utilizaba los mismos protocolos, donde se obtuvieron porcentajes de preñez esperados para la técnica. 4.6 Unidad experimental La unidad experimental corresponde a cada animal del total de animales utilizados en este ensayo, los cuales se encuentran divididos en 10 corrales, con seis unidades experimentales en cada uno. 4.7 Análisis estadístico Los datos se analizaron mediante el uso del programa SAS 9.4. 29 El modelo general es el siguiente: Y ijkl= µ + ri + cj + pk + eijkl Yijkl: Variable. µ: Media poblacional. ri: Efecto del grupo racial. cj: Efecto del corral. pk: Efecto del protocolo. eijk: Efecto del error. Adicional a esto, se analizaron las interacciones entre las variables para incluir aquellas que se determinen como fuente de variación. Para evaluar las diferencias significativas se utilizó la prueba de Tukey-Kramer. Las diferencias significativas se declararán con el valor P ≤ 0,05 y las tendencias entre 0,06 y 0,1. El crecimiento se analizó como modelo mixto de distribución normal (tomando en cuenta grupo racial y edad como efectos fijos), para las variables peso, GDP, ganancia de peso total (GPT) y CC, considerando el corral como un efecto aleatorio para controlar que las terneras no se asignaron aleatoriamente y que en cada corral hay un solo grupo racial. El desarrollo del tracto reproductivo se analizó como modelo mixto de distribución normal, (tomando en cuenta grupo racial y edad como efectos fijos), para las variables DC, DCD, diámetro del ovario derecho (DOD), diámetro del ovario izquierdo (DOI) y diámetro del cuerpo lúteo (DCL). Y como modelo mixto con distribución Poisson, para las variables total folículos clase 1 (TF1) (≥ 10 mm), total folículos clase 2 (TF2) (6 - 9 mm), total folículos clase 3 (TF3) (≤ 5 mm), considerando el corral como un efecto aleatorio. La respuesta ovárica al protocolo se analizó como modelo mixto de Poisson (tomando en cuenta tratamiento y grupo racial como efectos fijos), para las variables total folículos clase 1 (TF1) (≥ 10 mm), total folículos clase 2 (TF2) (6 - 9 mm), total folículos clase 3 (TF3) (≤ 5 mm). Además, como modelo mixto de distribución normal para el diámetro del cuerpo lúteo total (DCLT), diámetro del cuerpo lúteo neto (DCLN), progesterona (P4) y tamaño del folículo pre ovulatorio (TFPO) También como modelo mixto binario, para las variables diagnóstico de preñez a primer servicio (DP1), diagnostico de preñez a segundo servicio (DP2) y 30 diagnóstico de preñez acumulada (DPA) considerando el corral como un efecto aleatorio. El diagnóstico de preñez se analizó como variable binaria (tomando en cuenta tratamiento y grupo racial como efectos fijos), por medio de regresión logística. Así mismo, las variables analizadas que no se apegaron a una distribución normal, fueron convertidas (el modelo mixto de Poisson usa una transformación logarítmica, así mismo, la regresión logística utiliza una transformación logit). La significancia de los efectos sobre las variables se tomaron con los datos convertidos, sin embargo, para no perder la interpretabilidad de los resultados en los gráficos se presentan los datos crudos para las variables que presentaban diferencia estadística. En el caso de los datos no convertidos, se presentan como mínimos cuadrados promedio y error estándar. Para el segundo servicio no se realizó ninguna medición, puesto que una de las posibles causas de la baja preñez del primer servicio era el estrés extra por muestreo, así que solo se usaron los protocolos para resincronizar las novillas vacías y no se tomaron más mediciones excepto por la preñez al día 35. 31 5. RESULTADOS Y DISCUSION 5.1 Crecimiento La etapa de crecimiento incluye el análisis de los pesajes mensuales, que se realizaron desde la llegada de las terneras, con una edad aproximadamente de 8 meses hasta los 19 meses, con un periodo de adaptación de 15 días, por lo que los gráficos presentan los datos a partir de los 8,5 meses de edad de los animales; con estas mediciones se obtuvo las GDP y GPT. 5.1.1 Pesaje mensual El peso aumentó conforme avanzaba la edad de los animales para ambos grupos raciales (p<0,0001), además los animales Simbrah F1 presentaron un mayor peso respecto a los Brahman (p= 0,0026). En la Figura 6, se observa la curva de crecimiento global, con una tendencia lineal, además, se aprecia un aumento de peso conforme avanza la edad de los animales, aumentando 24,73 kg en promedio por mes. Figura 6. Curva mensual global de crecimiento de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 Con respecto a la curva de crecimiento global, la cual teóricamente es de forma sigmoidea, se aprecia un comportamiento idóneo, ya que al inicio de vida los animales tienen un elevado potencial de crecimiento, por lo que se aprecia un incremento de peso conforme 227246 279 310 338 358 383 407 434 447 469 493 y = 24,729x + 31,068 R² = 0,99189 0 100 200 300 400 500 600 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Pe so (k g) Edad (meses) 32 aumenta la edad, esto de forma lineal como lo indica Bavera et al. (2005). Además, cabe recalcar que la segunda parte de la curva que corresponde al punto de inflexión en adelante no se aprecia en el gráfico, debido a que dichos animales aún están en desarrollo, sin embargo, si se aprecia que conforme aumentan la edad de los animales las ganancias de peso son menores. En la Figura 7, se aprecia la curva de crecimiento comparativa entre los grupos raciales Brahman y Simbrah F1, donde se observa un aumento de peso conforme avanza la edad de los animales, además, presentan una tendencia lineal. También, se presenta un aumento mensual de peso de 22,46 kg en promedio para los animales Brahman y 26,46 kg para los Simbrah F1. Así mismo, los animales Simbrah F1 a lo largo del tiempo fueron 50 kg en promedio más pesado que los Brahman para una misma edad. Figura 7. Curva mensual de crecimiento de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 (mínimos cuadrados promedio ± error estándar). La diferencia estadística observada entre los grupos raciales es atribuido al distinto potencial genético que marca la heterosis, ya que las mayores ganancias de peso fueron en los animales cruzados (Simbrah F1) debido al aumento en el vigor de los animales (Sánchez 2010), lo que indica que el nivel de heterosis aumenta según se involucren diferentes genéticas a la de origen en el cruzamiento (Jiménez et al. 2013). 207 229 262 290 318 336 358 380 404 414 434 456 247 263 297 330 359 380 409 435 466 482 506 534 y = 22,457x + 194,68 R² = 0,99061 y = 26,459x + 220,29 R² = 0,99707 150 200 250 300 350 400 450 500 550 8,5 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Pe so (k g) Edad (meses) Brahman Simbrah F1 33 Riera et al. (2004), encontró que cruces de animales Brahman con razas pertenecientes a la subespecie Bos taurus (Angus, Simmental, Chianina y Romosinuano) presentaban mejores ganancias de peso respecto a los Brahman puros, lo que concuerda con lo obtenido en este estudio. 5.1.2 Ganancia diaria de peso Existió una interacción entre edad y grupo racial (p=0,0078), así como una interacción entre peso y edad (p=0,0007), lo cual permite inferir una diferencia en la GDP y en el peso entre cada uno de los grupos raciales a lo largo del tiempo. En la Figura 8, se observa las GDP promedio mensuales, en la cual se obtuvo una GDP promedio de 0,88 kg, un máximo de 1,05 kg y un mínimo de 0,47 kg, además se aprecia una caída en la GDP a los 13 meses de edad, esto debido probablemente al cambio de concentrado, así mismo a los 17 meses de edad se observa otra caída en la GDP, debido a la disminución en la cantidad de alimento balanceado brindado, ya que los animales podrían presentar un engrasamiento excesivo que afectaría de manera negativa el sistema reproductivo. Figura 8. Ganancia diaria de peso promedio mensual de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1. En la Figura 9, se aprecia la GDP entre grupos raciales, en la cual se observa una superioridad numérica por parte del grupo racial Simbrah F1, excepto a los 9 meses de edad, esto se debe probablemente al efecto del crecimiento compensatorio por parte de los animales Brahman, ya que presentaba pesos más bajos al ingreso a la finca, por lo que al consumir una dieta balanceado de acuerdo a sus requerimientos, se observa un aumento en -0,10 0,10 0,30 0,50 0,70 0,90 1,10 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Ga na nc ia d ia ria d e pe so ( kg ) Edad (meses) 34 la tasa de crecimiento debido a adecuados niveles de proteína y/o energía (Ojeda et al. SF, Olazabal y San Martín 2008). Así mismo, en la Figura 9 se observa que los valores promedio de GDP para el grupo racial Brahman oscilan entre 0,37 kg a 1,03 kg; mientras que los valores para los animales Simbrah F1 oscilan entre 0,57 kg a 1,08 kg. Por lo tanto, en ambos grupos raciales se encuentran animales con ganancias promedio de peso superiores a 0,5 kg, los cuales expresan su potencial genético y así mismo, hay animales que ganan poco peso, se mantienen o tienen hasta pérdidas de peso. Figura 9. Ganancia diaria de peso de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 5.1.3 Ganancia de peso total Existió una interacción entre edad y grupo racial (p=0,0065), así como una interacción entre peso y edad (p=0,0009), lo cual permite inferir una diferencia en la GPT y en el peso entre cada uno de los grupos raciales a lo largo del tiempo. Este comportamiento es similar a la GDP y el pesaje mensual, ya que todas son formas de evaluar el crecimientos de los animales. En la Figura 10, se observan las ganancias de peso total promedio de forma mensual, donde se percibe un promedio de GPT de 26 kg, un máximo de 33 kg y un mínimo de 13 kg. 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00 1,10 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Ga na nc ia d ia ria d e pe so (k g) Edad (meses) Brahman Simbrah F1 35 Figura 10. Ganancia de peso total mensual de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 En la Figura 11, se aprecia la GPT entre grupos raciales, en la cual se observa una superioridad numérica por parte del grupo racial Simbrah F1, excepto a los 9 meses de edad, debido probablemente al efecto de crecimiento compensatorio por parte de los animales Brahman. Además, se observa que los valores promedio de las GPT para el grupo racial Brahman oscilan entre 10 kg a 33 kg, mientras que los valores promedio para los animales Simbrah F1 oscilan entre 16 kg a 34 kg. Figura 11. Ganancia de peso total mensual de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 0 5 10 15 20 25 30 35 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Ga na nc ia d e pe so to ta l ( kg ) Edad (meses) 0 5 10 15 20 25 30 35 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Ga na nc ia d e pe so to ta l ( kg ) Edad (meses) Brahman Simbrah F1 36 5.1.4 Condición corporal La CC aumentó conforme aumentaba el peso de los animales (p=0,021), también aumentó con la edad de los animales (p=0.0485) En la Figura 12, se aprecia la CC de ambos grupos raciales, las cuales aumentan conforme incrementa el peso a lo largo del tiempo, además, se observa una mayor reserva corporal en los animales Simbrah F1. Figura 12. Condición corporal de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 5.1.5 Espesor de la grasa dorsal El EGD, se midió 7 días post inseminación, obteniéndose un promedio global de 8 mm. Para el grupo racial Brahman se obtuvo un promedio de 6,5 mm con un rango de 4,3 - 10,2 mm, mientras que para el grupo racial Simbrah F1 se obtuvo un promedio de 6,6 con un rango de 4,3 - 10,6 mm, los valores máximos y mínimos se aprecian en la Figura 13, en la Figura 14 se presentan los valores individuales, lo cual permite apreciar la dispersión de los datos. Debido a que esta es otra forma de medir las reservas corporales, éstas se iban a relacionar con los datos de preñez, sin embargo, no se realizó debido a los resultados de preñez obtenidos. 3,50 3,75 4,00 3,25 3,50 3,75 3,00 3,25 3,50 3,75 4,00 4,25 12 15 18 Co nd ic ió n Co rp or al Edad (meses) Simbrah F1 Brahman 37 Figura 13. Espesor de la grasa dorsal de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1 Figura 14. Variación del espesor de la grasa dorsal de los grupos raciales Brahman y Simbrah F1. 5.2 Desarrollo del tracto reproductivo El desarrollo del tract