UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO DETERMINACIÓN DEL EFECTO DEL PROCESAMIENTO SOBRE EL CONTENIDO DE COMPUESTOS BIOACTIVOS, CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (ORAC) Y EL PERFIL DE COMPUESTOS POLIFENÓLICOS DEL JUGO DE HUISCOYOL (BACTRIS GUINEENSIS) Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Ciencia de Alimentos para optar al grado y título de Maestría Académica en Ciencia de Alimentos CAROLINA CORTÉS HERRERA Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2019 ii Dedicatoria …. a Emma Sandí Cortés, Porque lo mejor de mi vida eres tú… iii Agradecimientos A Dios, Todopoderoso, le agradezco cada una de las bendiciones que me ha brindado, por ser Él mi guía en cada momento de mi vida. Gracias a mi familia: Jorge A. Cortés H., Adriana Herrera R., José A. Cortés H., personas excepcionales, trabajadoras, luchadoras y amorosas que cada día se esfuerzan por ser mejores y que me enseñan que el sacrificio trae consigo muchas satisfacciones. A Allan Sandí P., por el apoyo en este caminar juntos, en cual vamos cosechando nuevos éxitos y, por el amor, el cual es el motor que nos impulsa a seguir y a vivir cada momento de la caótica y hermosa aventura de ver crecer a Emma. Durante este reto hay quienes con su carisma como personas, profesionales y amigos siguen dejado una huella muy profunda en mi corazón, y son el gran regalo del cielo, Graciela Artavia, Fabio Granados y Carlos Arias. Por últimos agradezco a las personas que me mostraron su apoyo durante el desarrollo de este trabajo, Dra. Ana Mercedes Pérez, Guy Lamoureux (Ph.D.), Alice Pérez (Ph.D.), Juan José Araya (Ph.D.), Dr. Fabrice Vaillant, mis compañeros del CITA, Eduardo, Deysilia, Randall, Silvia y Lizeth, así como a las asistentes de investigación Vanessa, Ana Irene y Aracelly, muchísimas gracias. v Contenido Dedicatoria .......................................................................................................................................... ii Agradecimientos..................................................................................................................................iii Hoja de aprobación ............................................................................................................................. iv Contenido ............................................................................................................................................ v Resumen ............................................................................................................................................ viii Lista de cuadros ................................................................................................................................... ix Lista de figuras ......................................................................................................................................x Lista de abreviaturas .......................................................................................................................... xii 1 JUSTIFICACIÓN .......................................................................................................................... 1 2 OBJETIVOS ................................................................................................................................. 5 2.1 Objetivo general ........................................................................................................................ 5 2.2 Objetivos específicos ................................................................................................................. 5 3 MARCO TEÓRICO ....................................................................................................................... 6 3.1 Compuestos polifenólicos ......................................................................................................... 6 3.1.1 Clasificación de los compuestos polifenólicos .......................................................................... 7 3.1.2 Métodos de determinación de polifenoles en matrices de alimentos ................................... 14 3.2 Importancia biológica de los polifenoles ................................................................................ 17 3.2.1 Actividad frente al cáncer ....................................................................................................... 18 3.2.2 Actividad cardioprotectora ..................................................................................................... 20 3.2.3 Actividad antioxidante ............................................................................................................ 21 3.3 Efecto del procesamiento en los compuestos polifenólicos ................................................... 26 3.4 Bactris guineensis: el huiscoyol, un fruto no tradicional ........................................................ 28 4 METODOLOGÍA ....................................................................................................................... 31 4.1 Localización del proyecto ........................................................................................................ 31 4.2 Materia prima ......................................................................................................................... 31 4.3 Determinación del perfil nutricional, composición de compuestos bioactivos y la capacidad antioxidante por el método ORAC de la fruta fresca de huiscoyol ......................................... 31 4.3.1 Diseño experimental y tratamiento estadístico ...................................................................... 32 4.4 Efecto del procesamiento del jugo de huiscoyol sobre el contenido de compuestos bioactivos y la capacidad antioxidante por el método ORAC ................................................................... 32 vi 4.4.1 Procesamiento de la fruta fresca de huiscoyol para la obtención de jugo a escala laboratorio mediante cuatro diferentes tratamientos ............................................................................... 33 4.4.2 Diseño experimental y análisis estadístico.............................................................................. 36 4.5 Determinación del perfil nutricional, la composición de compuestos bioactivos y la capacidad antioxidante por el método ORAC del jugo prensado de huiscoyol ...................... 36 4.5.1 Diseño experimental y análisis estadístico.............................................................................. 37 4.6 Identificación de los compuestos polifenólicos mayoritarios de la fruta de huiscoyol y sus cambios producidos luego del procesamiento. ...................................................................... 37 4.6.1 Diseño experimental y análisis estadístico.............................................................................. 38 4.7 Métodos de análisis químicos aplicados en la fruta fresca y en los jugos obtenidos de huiscoyol ................................................................................................................................. 38 4.7.1 Reactivos ................................................................................................................................. 39 4.7.2 Métodos de análisis ................................................................................................................ 39 5 Discusión de resultados .......................................................................................................... 43 5.1 Determinación del perfil nutricional, la composición de compuestos bioactivos y la capacidad antioxidante por el método ORAC de la fruta fresca de huiscoyol para determinar su valor como alimento funcional ........................................................................................... 43 5.1.1 Características físicoquímicas del fruto de huiscoyol.............................................................. 43 5.1.2 Metabolitos primarios y secundarios analizados en la fruta fresca ........................................ 47 5.1.3 Compuestos polifenólicos presentes en el fruto de huiscoyol ............................................... 51 5.1.4 Capacidad antioxidante por el método ORAC......................................................................... 61 5.2 Efecto del procesamiento del jugo de huiscoyol sobre el contenido de compuestos bioactivos y la capacidad antioxidante por el método ORAC ................................................................... 62 5.2.1 Generalidades del procesamiento del huiscoyol: rendimientos y características fisicoquímicas del jugo.................................................................................................................................... 62 5.2.2 Efecto de operaciones unitarias del procesamiento de huiscoyol en el contenido de compuestos bioactivos ............................................................................................................ 70 5.2.3 Contenido de polifenoles totales ............................................................................................ 71 5.2.4 Contenido de antocianinas totales ......................................................................................... 72 5.2.5 Vitamina C total....................................................................................................................... 74 5.2.6 Efecto de operaciones unitarias en el procesamiento de huiscoyol en la actividad antioxidante determinada por el método ORAC .................................................................... 74 5.3 Determinación del perfil nutricional, la composición de compuestos bioactivos (polifenoles totales, antocianinas totales, vitamina C) y la capacidad antioxidante por el método ORAC vii del jugo prensado de huiscoyol para evaluar su valor como materia prima en la elaboración de productos funcionales ........................................................................................................ 76 5.4 Determinación mediante la técnica de separación HPLC, los cambios a nivel semi- cuantitativo (aumento, disminución, aparición o desaparición) de las señales de algunos de los compuestos fenólicos mayoritarios presentes en el fruto de huiscoyol y en los jugos obtenidos, con el fin de evaluar la estabilidad de estos biomarcadores ................................ 79 Valor p ............................................................................................................................................... 84 6 Conclusiones ........................................................................................................................... 86 7 Recomendaciones ................................................................................................................... 89 8 Referencias .............................................................................................................................. 90 9 Anexos ................................................................................................................................... 102 9.1 Anexo 1. Determinación de las medidas físicas del fruto ..................................................... 102 viii Resumen El presente trabajo se enfocó primeramente en la caracterización físicoquímica de un fruto no tradicional costarricense, el huiscoyol, cuyo nombre científico es Bactris guineensis. Este cultivo se localiza en la zona de Guanacaste, cerca de pantanos, ríos o playas de forma silvestre, y es consumido de foma directa, como fruta fresca. Se ha estudiado, de manera muy preliminar en trabajos previos, su contenido y tipo de antocianinas, el efecto de la temperatura sobre el contenido de polifenoles para realizar una infusión de esta fruta, y las actividades citotóxicas y pro-apoptóticas sobre células tumorales que posee el extracto de polifenoles del huiscoyol; pero se conoce muy poco sobre el contenido nutricional de este fruto. Además, no existen reportes del efecto del procesamiento para la obtención de jugo, sobre su contenido en compuestos bioactivos y la capacidad antioxidante. Se caracterizó, por tanto, el fruto de huiscoyol en lo que respecta a su composición física, como tamaño del fruto, porcentaje de pulpa y color, así como composición química-nutricional. Se determinó el contenido de humedad, cenizas, minerales, proteína, acidez, fibra dietética, carbohidratos totales y diponibles, presentes en seis lotes diferentes de huiscoyol cosechados en los años 2007, 2011, 2014 y 2015 de la zona de Palo Verde y Cañas. También se determinaron metabolitos primarios y secundarios, como el perfil de azúcares, perfil de ácidos orgánicos y compuestos bioactivos como vitamina C, polifenoles totales y antocianinas totales. Con base en lo anterior, se observó que el contenido nutricional es similar a frutas tradicionales de Costa Rica como cas, piña, guayaba, entre otros, pero, según el Reglamento Técnico Centroamerticano RTCA 67.01.60:10 de etiquetado nutricional, se puede considerar el huiscoyol como una buena fuente de fibra dietética (7,3 ± 2,5 g/100 g). Cabe destacar que es un fruto cuya composición depende mucho de la zona en la cual se cultiva, así como de la época de cosecha; esto se vio reflejado en el contenido de vitamina C total, ya que en ciertos lotes la cantidad de esta vitamina fue no detectable, mientras que en otros lotes se obtuvo valores de 35-48 mg/100 g. Con respecto al contenido de polifenoles totales (300-900 mg equivalentes de ácido gálico/100 g), antocianinas totales (30-50 mg equivalentes de cianidina-3-O-glucósido cianidina-3- O-glucósido /100 g) y capacidad antioxidante por el método ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) (700 -17 500 µmol equivalentes de Trolox / 100 g), estos son comparables con los reportados en frutos con alto contenido de polifenoles como las bayas, entre las que se encuentran los arándanos, las moras, las fresas y las frambruesas. Se observó que el fruto de huiscoyol cultivado en Costa Rica presenta como componentes polifenólicos tentativos taninos hidrolizables y condensados, como procianidinas, derivados de catequinas y galocatequinas, además de derivados mono- y diglicosidados de kaemferol, así como antocianinas, siendo la mayoritaria la cianidin-3-O- rutinósido. El perfil de compuestos polifenólicos se mantiene en el jugo prensado de huiscoyol, dichos compuestos son estables durante la aplicación de operaciones unitarias como la maceración enzimática y el tratamiento térmico. Se evidenció que el contenido de antocianinas y polifenoles no cambia significativamente con el tratamiento enzimático, y que esta maceración favorece la obtención de una mayor cantidad de jugo (52,8 %), comparado únicamente con la pulpa prensada sin tratar (48,6 %). Por otro lado, al aplicar un proceso térmico, se observó que no hay cambios significativos en el contenido de estos compuestos bioactivos, tanto de manera global como individual. Se genera, por lo tanto, un valor agregado al procesar el jugo de huiscoyol, el cual mantiene el valor de la fruta como alimento funcional, con una vida útil esperada que sea aceptable para el consumidor. ix Lista de cuadros Cuadro 1. Condiciones de análisis por cromatografía líquida para la determinación de compuestos polifenólicos en diferentes matrices de alimentos. ........................................................................................... 16 Cuadro 2. Parámetros de peso y dimensiones del fruto (n= 10) y el color L*, a* y b* de la pulpa y cáscara (n= 6) de la fruta fresca de Bactris guineensis. ....................................................................................................... 43 Cuadro 3. Parámetros nutricionales determinados en la parte comestible (pulpa y cáscara) de la fruta de Bactris guineensis (n= 6) en base fresca. .......................................................................................................... 45 Cuadro 4. Metabolitos primarios y secundarios identificados en la parte comestible (pulpa y cáscara) de la fruta de Bactris guineensis (n=6) en base fresca. ............................................................................................. 47 Cuadro 5. Principales señales de posibles compuestos polifenólicos presentes en un extracto acuoso de la fruta fresca huiscoyol analizados mediante UPLC-MS, ión molecular y su patrón de fraccionamiento tanto en modo negativo como positivo. ......................................................................................................................... 54 Cuadro 6. Rendimiento de despulpado de la fruta de huiscoyol a escala piloto. .............................................. 64 Cuadro 7. Características fisicoquímicas generales (humedad, pH, grados Brix y acidez) de jugo prensado (A), jugo tratado enzimáticamente (B), jugo tratado térmicamente (C) y jugo con maceración enzimática, prensado y tratado térmicamente (D) según el lote de producción con su respectivo valor p del análisis de varianza a 95% y resultado de la prueba de comparación de medias de Tukey, con un valor n= 3 para cada muestra y jugo .................................................................................................................................................. 68 Cuadro 8. Contenido de azúcares totales y ácidos orgánicos presentes en el jugo prensado (A), jugo tratado enzimáticamente (B), jugo tratado térmicamente (C) y jugo con maceración enzimática, prensado y tratado térmicamente (D), con su respectivo valor p del análisis de varianza a 95% con un valor n= 3 para cada jugo. .......................................................................................................................................................................... 70 Cuadro 9. Contenido de polifenoles totales, antocianinas totales y vitamina C presentes en el jugo prensado (A), jugo tratado enzimáticamente (B), jugo tratado térmicamente (C) y jugo con maceración enzimática, prensado y tratado térmicamente (D), en base fresca con su respectivo valor p del análisis de varianza a 95% con un valor n= 3 para cada jugo . ................................................................................................................... 71 Cuadro 10. Capacidad antioxidante del jugo prensado (A), jugo enzimado (B), jugo tratado térmicamente (C) y jugo enzimado y tratado térmicamente (D) en base fresca y base seca, con su respectivo valor p del análisis de varianza a 95% con un valor n= 3 para cada jugo ....................................................................................... 75 Cuadro 11. Composición química y nutricional del jugo prensado de huiscoyol. ............................................. 77 Cuadro 12. Composición química y nutricional de diversos jugos de frutas. .................................................... 79 Cuadro 13. Porcentaje relativo de cada compuesto polifenólico identificado por HPLC-MS en modo positivo presente en cada uno de los jugos de huiscoyol obtenidos con su respectivo valor p del análisis de varianza a 95% con un valor n= 3 para cada jugo.............................................................................................................. 80 Cuadro 14. Porcentaje relativo de cada compuesto polifenólico identificado por HPLC-DAD positivo presente en un extracto de fruta fresca. ......................................................................................................................... 82 Cuadro 15. Porcentaje relativo de cada compuesto polifenólico identificado por HPLC-DAD positivo presente cada uno de los jugos de huiscoyol con su respectivo valor p del análisis de varianza a 95% para un n = 3 para cada jugo. ......................................................................................................................................................... 84 x Lista de figuras Figura 1. Estructuras de algunos de los ácidos fenólicos. ................................................................................... 8 Figura 2. Estructura base de los flavonoides y sus respectivas familias. ............................................................ 9 Figura 3. Estructuras de algunos compuestos pertenecientes a la familia de las flavonas, flavanonas, flavanonoles y flavonoles. ................................................................................................................................ 11 Figura 4. Estructuras de algunos flavanoles. .................................................................................................... 12 Figura 5. Estructuras de algunas antocianinas. ................................................................................................ 13 Figura 6. Estructura del resveratrol. ................................................................................................................. 13 Figura 7. Estructura del secoisolariciresinol. .................................................................................................... 14 Figura 8. Efectos y actividades biológicas asociadas a los polifenoles. ............................................................ 18 Figura 9. Actividad frente al cáncer de algunos tipos de polifenoles. ............................................................... 19 Figura 10. Clasificación de los antioxidantes según su actividad. .................................................................... 22 Figura 11. Palmera, racimo y fruto de Bactris guineensis. ............................................................................... 29 Figura 12. Flujo de proceso para la obtención de cuatro diferentes tipos de jugo de huiscoyol a escala piloto. .......................................................................................................................................................................... 33 Figura 13 . Frutos de huiscoyol según su estado de maduración a) verde, b) intermedio y c) maduro. Fuente: https://www.palmpedia.net/wiki/Bactris_guineensis ..................................................................................... 44 Figura 14. Cromatograma de separación de a) ácido cítrico, b) ácido málico y c) ácido succínico en una muestra de huiscoyol fresco (Lote 2014) por HPLC-DAD a 210 nm, 0,6 mL/min, 60 °C, H2SO4 2,25 mM. ........ 48 Figura 15. Especies activas de la vitamina C y su equilibrio óxidoreductivo. .................................................... 49 Figura 16. Cromatograma de identificación y cuantificación de vitamina C en a) un extracto de huiscoyol, b) extracto de huiscoyol reducido y c) estándar de AA. Analizado por HPLC-DAD a 254 nm, 0,8 ml/min, 30 °C, H2SO4 18mM. .................................................................................................................................................... 50 Figura 17 Cromatograma del estándar de cianidina-3-O-glucósido 10 ppm (rojo) y un extracto de huiscoyol (azul) analizado por HPLC-DAD a 512 nm, C18, 0,3 mL/min 35 °C, Fase A: HOCOOH 2%, Fase B ACN:H2O 80:20 .......................................................................................................................................................................... 52 Figura 18. Perfil de compuestos polifenólicos presentes en un extracto de fruta fresca de huiscoyol separados por UPLC-MS A) en modo positivo y B) modo negativo. ................................................................................... 53 Figura 19 . Estructura de un derivado de kaemferol cuyos R1, R2 o R3 son las posiciones que pueden ser glicosidada. ....................................................................................................................................................... 56 Figura 20 Patrón de fragmentación de la señal 1 del perfil de compuestos polifenòlicos del extracto de huiscoyol por UPLC-MS en modo positivo. ........................................................................................................ 56 Figura 21 Estructuras de procianidinas A) diméricas, B) triméricas y C) tetraméricas con sus posibles iones en modo negativo ................................................................................................................................................. 58 Figura 22 Patrón de fragmentación de la señal 12 del perfil de compuestos polifenólicos del extracto de huiscoyol por UPLC-MS en modo positivo. ........................................................................................................ 59 Figura 23. Espectro de masas y patrón de fraccionamiento del pico correspondiente a la antocianina presente en el extracto de huiscoyol. .............................................................................................................................. 59 Figura 24 Patrón de fragmentación de la señal 6 del perfil de compuestos polifenólicos del extracto de huiscoyol por UPLC-MS en modo negativo ....................................................................................................... 60 Figura 25 Patrón de fragmentación de la señal 8 del perfil de compuestos polifenólicos del extracto de huiscoyol por UPLC-MS en modo positivo ......................................................................................................... 61 Figura 26 a) Pulpa y b) residuo del despulpado de huiscoyol. .......................................................................... 64 Figura 27. Prensado de la pulpa de huiscoyol y obtención del jugo. ................................................................ 65 Figura 28. Masa de pulpa de fruta antes (A) y después (B) de la maceración enzimática. .............................. 66 Figura 29. Esterilización comercial de los jugos de huiscoyol a escala laboratorio. ......................................... 67 xi Figura 30. Valores promedio de a) humedad b) grados Brix, c) pH y d) acidez de los diferentes jugos de huiscoyol obtenidos a escala piloto, Jugo prensado (A), jugo tratado enzimáticamente (B), jugo tratado térmicamente (C) y jugo con maceración enzimática, prensado y tratado térmicamente (D), n=3. ................ 69 Figura 31. Variación del contenido de compuestos bioactivos (polifenoles totales, antocianinas totales, vitamina C total) y la capacidad antioxidante ORAC de los diferentes jugos de huiscoyol obtenidos a escala piloto, Jugo prensado (A), jugo tratado enzimáticamente (B), jugo tratado térmicamente (C) y jugo con maceración enzimática, prensado y tratado térmicamente (D), n=3. .............................................................. 75 Figura 32. Cromatograma del perfil de compuestos polifenólicos determinados por HPLC-DAD en un extracto de fruta fresca. ................................................................................................................................................. 82 Figura 33. Comparación de cromatogramas del perfil de compuestos polifenólicos determinados por HPLC- DAD en a) un jugo prensado de huiscoyol y b) un extracto de fruta fresca. ..................................................... 83 xii Lista de abreviaturas °C Grados centígrados Å Angstrom AA Ácido ascórbico AAPH Cihidrocloruro de 2,2’-azobis-2-amidinopropano ABTS Ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin) -6-sulfónico ADN Acido desoxirribonucleico AOAC Association of Official Analytical Chemists BHA Hidroxibutilanisol BHT Hidroxibutiltolueno BSA Solución de seroalbúmina bovina CAT Catalasa CIPRONA Centro de Investigación en Productos Naturales CITA Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos cm Centímetros Da Dalton DAD Detector de arreglo de diodos DPPH Difenil-(2,4,6-trinitrofenil)iminoazanio EPR Espectroscopia paramagnética de resonancia ERYCA Erythrocyte Cellular Antioxidant Activity ESI-Q-TOF/MS Electrospray Ionization Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura FDA Food and Drug Administration g Gramos GAE Equivalentes de ácido gálico GPx Glutatión peroxidasa GST Glutatión sulfhidril transferasa h Hora ha Hectárea HDL Lipoproteínas de alta densidad H-ORAC Hydrophilic Oxygen Radical Absorbance Capacity HPLC High Performance Liquid Chromatography kg Kilogramos L Litro LDL Lipoproteínas de baja densidad m Metros mg Miligramos min Minuto mL Mililitro mm Milimetros mM Milimolar MPA Ácido metafosfórico MS Espectrometría de masas msnm Metros sobre el nivel del mar mV Milivoltios NADPH Nicotinamida-Adenina-Dinucleótido-Fosfato xiii nm Nanómetros OMS Organización Mundial de la Salud ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity ppm Partes por millón REDOX Reacciones de reducción-oxidación RMN Resonancia magnética nuclear RNS Reactive Nitrogen Species ROS Reactive Oxygen Species RTCA Reglamento técnico centroamericano s Segundo SD Desviación estándar SOD Superóxido dismutasa SST Sólidos solubles totales TE Equivalentes de Trolox TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity Trolox Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico μg Microgramos μm Micrómetros μmol Micromoles UCR Universidad de Costa Rica UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography UV Ultravioleta VIS Visible VRN Valor de referencia de nutrientes x ̅ Media 1 1 JUSTIFICACIÓN Las propiedades antioxidantes que pueden aportar fuentes naturales han sido uno de los principales focos de estudio en los últimos años; un compuesto químico puede servir como agente antioxidante si posee la capacidad de secuestrar radicales libres tales como las especies reactivas de oxígeno (ROS, Reactive Oxygen Species), inhibiendo la iniciación o propagación en sus reacciones de oxidación; estas especies pueden causar un enorme daño a nivel del ADN mitocondrial, lípidos, proteínas y a nivel genético de la célula (Naczk & Shahidi, 2003). Dentro de la industria alimentaria existen dos categorías de antioxidantes. Por una parte, se tienen aquellos que son de origen sintético, tales como hidroxibutilanisol (BHA) e hidroxibutiltolueno (BHT), los cuales han sido utilizados desde los inicios del siglo XX, pero que poseen un efecto carcinógeno (Maestro & Borja, 1993). Por otra parte, se encuentran los antioxidantes de origen natural, tales como tocoferoles, ácidos fenólicos, alcaloides, los derivados de clorofila, aminoácidos, carotenoides, ácido ascórbico y polifenoles (Naczk & Shahidi, 2003). Estos últimos compuestos están presentes en cáscaras, pulpas, y semillas, así como en productos derivados de frutas y vegetales, tales como bebidas, jugos, mermeladas, yogurt, helados y cereales, entre otros (Muñoz & Ramos, 2007). Existe una gran variedad de investigaciones sobre las actividades biológicas que pueden tener los compuestos polifenólicos, tanto a nivel de las plantas como en los animales. Desde el punto de vista de la estructura química, los polifenoles tienen la capacidad de capturar radicales libres generados como respuesta al aumento del estrés oxidativo, por lo que una ingesta diaria de frutas, verduras y granos enteros (que son ricos en polifenoles) podría generar una disminución en el riesgo de sufrir ciertos tipos de cáncer, enfermedades cardiovasculares e inflamación crónica, así como enfermedades degenerativas, las cuales están relacionadas con el aumento del estrés oxidativo en la células (Tsao, 2010; Barberán, 2003; Nichenametla et al., 2006; Zern & Fernández, 2005; Kondratyuk & Pezzuto, 2004; Wang et al., 2011; Álvarez & Orallo, 2012). Es por ello que los polifenoles, al estar presentes en productos de la dieta diaria como las frutas y vegetales, han generado una serie de investigaciones acerca de su estructura, aislamiento, metabolismo y biodisponibilidad; esta última propiedad, en el caso de los polifenoles naturales, es 2 muy variable, ya que depende del tipo de metabolito y de los procesos tecnológicos para la producción de los alimentos y de los hábitos alimentarios (Manach et al., 2004). Diferentes investigaciones hacen referencia a la importancia del consumo de frutas y hortalizas que contengan una alta cantidad de compuestos con actividad antioxidante, ya que esta ha sido asociada en distintos estudios epidemiológicos con una disminución de síntomas provenientes de enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas o, inclusive podría, tener alguna incidencia sobre el desarrollo de cáncer (Dembitsky et al., 2011; Collins, 2005). Los países tropicales producen una gran variedad de frutas y es factible pensar que algunas de ellas presenten una actividad antioxidante alta; por este motivo se han llevado a cabo distintos estudios para su determinación en frutas como mango, papaya, guayaba, mamón, carambola, piña, tamarindo, naranjilla, uvas, fresas y banano, entre otras (Proteggente et al., 2002; Wu et al., 2004a; Wu et al., 2004b; Wang et al., 1996; Wang et al., 1997; Patthamakanokporn et al. 2008; Mahattanatawee et al., 2006). Wu y sus colaboradores (2004a, 2004b) desarrollaron una base de datos con las capacidades antioxidantes de componentes tanto lipofílicos como hidrofílicos, determinando también la cantidad de polifenoles totales en una serie de frutas y hortalizas como banano, piña, fresa, melón, kiwi, sandía, manzanas, uvas, arándanos, calabazas, así como sus valores por porción. A este trabajo se le une otra gran variedad de investigaciones que han evaluado dicha capacidad antioxidante utilizando los métodos de ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity), ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3- etilbenzotiazolin-6-sulphonico), TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) y DPPH (difenil-(2,4,6- trinitrofenil)iminoazanio), además de la determinación de polifenoles totales y de ácido ascórbico (Patthamakanokporn et al., 2008; Mahattanatawee et al., 2006). Esta información sirve para conocer y ampliar la gama de alimentos que pueden tener propiedades funcionales y que aporten beneficios a la salud del ser humano. En Costa Rica también se ha impulsado la investigación de la actividad antioxidante de algunas frutas tropicales no tradicionales; tal es el caso de la pitahaya (Vaillant et al., 2005) y de naranjilla (Acosta et al., 2009). En el 2012 se realizó un estudio de la capacidad antioxidante determinada por H-ORAC (Hydrophilic Oxygen Radical Absorbance Capacity) y su correlación con la capacidad antioxidante a nivel celular empleando eritrocitos mediante el método ERYCA (Erythrocyte Cellular Antioxidant Activity) (González et al., 2012). 3 Uno de los frutos no tradicionales que podría ser objeto de estudio en nuestro país es el huiscoyol. Su nombre científico es Bactris guineensis, pertenece a la familia Arecaceae y entre sus nombres comunes están huiscoyol, viscoyol, güiscoyol y uvita de monte. La palma de donde se obtiene posee una altura de aproximadamente 3,5 m, sus hojas son de 0,2-0,5 m de largo con 20-42 piñas a ambos lados (Chízmar Fernández, 2009). Se puede encontrar desde Nicaragua hasta el norte de Colombia y Venezuela. En Costa Rica, el cultivo de este fruto se ubica solo en la vertiente del Pacífico, en bosques secos o de transición, desde el norte hasta cerca de Barranca y Tivives, a una altitud desde 0 msnm hasta los 500-600 msnm al oeste de la Cordillera Volcánica en el Área de Conservación de Guanacaste. Es fácil encontrar arbustos en los márgenes de los caminos hacia Playa Blanca en el sector de Murciélago y hacia Playa Potrero Grande en la zona de Santa Elena (Masís et al., 1998). Algunos estudios atribuyen el color particular del huiscoyol a la presencia de compuestos polifenólicos pertenecientes a la familia de las antocianinas, las cuales, de acuerdo con Osorio y colaboradores (2010), fueron aisladas e identificadas por cromatografía de contracorriente y HPLC (High Performance Liquid Chromatography); dichos investigadores señalaron la cianidina-3- rutinósido y cianidina-3-glucósido como los componentes principales, además de otros pigmentos en pequeñas cantidades como la peonidina-3-rutinósido. Ese mismo grupo de investigadores en el 2011 realizó un estudio por medio de espectroscopía paramétrica de resonancia (EPR) para analizar la actividad captadora de radicales libres mediante los métodos ABTS y DPPH; estos autores observaron que un extracto rico en antocinaninas provenientes del fruto presenta una mayor actividad liberadora de radicales con el método DPPH que con el método ABTS. A raíz de que solamente existen hasta ahora muy pocos estudios sobre la caracterización parcial del fruto Bactris guineensis y la estabilidad de los compuestos polifenólicos presentes, y considerando el potencial comercial de este cultivo, se ha planteado la presente investigación con el objetivo de determinar su valor como alimento funcional, tanto en la fruta fresca como en un jugo. Lo anterior con el fin de visualizar su uso como materia prima para la elaboración de productos de interés comercial. En este trabajo, una primera etapa correspondió a la caracterización nutricional completa del fruto fresco, mediante la determinación del aporte energético, contenido de fibra dietética, minerales, vitaminas, azúcares simplesy ácidos orgánicos; además, se generó un perfil de los compuestos polifenólicos presentes y su actividad antioxidante. Seguidamente, se evaluó el efecto de diversos tipos de procesamiento de la fruta a escala piloto sobre los cambios a nivel de 4 compuestos bioactivos (compuestos polifenólicos, vitamina C), así como en su capacidad antioxidante. Finalmente, se desarrolló un flujo de proceso para poder obtener un producto con un alto contenido de compuestos bioactivos, que podría constituir una opción innovadora y alternativa de alimento funcional, para su elaboración a nivel nacional, logrando de esta manera agregar valor a frutos de nuestra biodiversidad que actualmente son sub-utilizados. 5 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo general Determinar el impacto del procesamiento de la fruta de huiscoyol (Bactris guineensis) para la obtención de jugo, sobre el contenido de compuestos bioactivos (polifenoles totales, antocianinas totales, vitamina C total), la capacidad antioxidante por el método ORAC y el perfil de compuestos polifenólicos. 2.2 Objetivos específicos 1. Determinar el perfil nutricional, la composición de compuestos bioactivos (polifenoles totales, antocianinas totales, vitamina C) y la capacidad antioxidante por el método ORAC de la fruta fresca de huiscoyol para determinar su valor como alimento funcional. 2. Analizar el efecto del procesamiento del jugo de huiscoyol sobre el contenido de compuestos bioactivos (polifenoles totales, antocianinas totales, vitamina C) y la capacidad antioxidante por el método ORAC, con el fin de definir un flujo de proceso para una aplicación a escala industrial. 3. Determinar el perfil nutricional, la composición de compuestos bioactivos (polifenoles totales, antocianinas totales, vitamina C) y la capacidad antioxidante por el método ORAC del jugo prensado de huiscoyol para evaluar su valor como materia prima en la elaboración de productos funcionales. 4. Determinar mediante la técnica de separación HPLC-DAD los cambios a nivel semi-cuantitativo (aumento, disminución, aparición o desaparición) de las señales de algunos de los compuestos fenólicos mayoritarios presentes en el fruto de huiscoyol y en los jugos obtenidos, con el fin de evaluar la estabilidad de estos biomarcadores durante el procesamiento de la fruta. 6 3 MARCO TEÓRICO 3.1 Compuestos polifenólicos Los polifenoles corresponden a una de las familias de compuestos que están presentes mayoritariamente en frutas, vegetales y algunos productos derivados tales como jugos, mermeladas y pulpas. Estos compuestos son los principales metabolitos secundarios de las plantas y su presencia en los animales y el ser humano se debe a su ingestión (Barberán, 2003). Son sintetizados por las plantas y regulados cualitativa y cuantitativamente por factores genéticos, así como ambientales. Se han identificados más de 8 000 de estos compuestos en varias plantas y se le ha atribuido propiedades importantes a nivel de salud (Kondratyuk & Pezzuto, 2004). Participan en la fase dependiente de la luz en la fotosíntesis, durante la cual catalizan el transporte de electrones. Sus precursores son aminoácidos aromáticos tales como la fenilalanina y tirosina, así como unidades de acetato, los cuales pueden seguir la ruta metabólica del ácido shikímico y del fenilpropanoide (Martínez et al., 2002; Kondratyuk & Pezzuto, 2004). Los compuestos fenólicos y polifenólicos son parte esencial de diversas funciones fisiológicas de las plantas tales como pigmentación, polinización y resistencia contra depredadores. Algunos son fitoalexinas, cuya función es defender la planta de posibles ataques fúngicos o bacterianos, otros sirven como medio de protección contra radiaciones ultravioleta (UV), estrés fotosintético y especies reactivas de oxígeno; algunos flavonoides controlan los niveles de auxinas reguladoras del crecimiento y diferenciación de las plantas (Martínez et al., 2002; Kondratyuk & Pezzuto, 2004). La mayoría de las propiedades sensoriales como color, olor y sabor de algunas frutas y vegetales son atribuidas a derivados de compuestos polifenólicos. Las antocianinas contribuyen a la pigmentación de muchas partes de la planta y son las responsables de los colores rojo, anaranjado, azul, púrpura o violeta que encontramos en las cáscaras de varias frutas, vegetales e inclusive en la mayoría de las flores (Robards et al., 1999). Los sabores particulares de amargor y astringencia son asociados a la presencia de compuestos fenólicos, siendo estos los responsables de brindarle una impalatabilidad a algunas plantas. Compuestos volátiles como la vainillina y el eugenol poseen una capacidad odorante muy fuerte (Cheynier, 2005). 7 Por otro lado, cuando los compuestos fenólicos sufren reacciones de oxidación dan lugar a productos conocidos como quinonas, las cuales son responsables de un color pardo que muchas veces es indeseable en frutas (Robards et al., 1999). En 1998 producto de los trabajos de Theodore White, Edgar Charles Bate-Smith, Tony Swain y Edwin Haslam se estipula la siguiente definición de polifenoles: “son compuestos solubles en agua, que tienen una masa molecular comprendida entre 500 y 4 000 Da, que poseen de 12 a 16 grupos hidroxilos fenólicos sobre 5 o 7 anillos aromáticos por cada 1 000 Da de masa molecular”. Se caracterizan por dar positiva la reacción de fenoles y precipitar alcaloides, así como gelatina y otras proteínas en solución (Quideau et al., 2011). Con base en esta definición, existirían tres clases de polifenoles: las proantocianidinas conocidas como taninos condensados, los galotaninos y elagitaninos, considerados como taninos hidrolizables, y los florotaninos que se encuentran en las algas pardas. Pero existen compuestos más o menos complejos a los que se les adjudica el nombre de “polifenoles”, tales como las antocianinas, flavonoides, ácidos hidroxicinámicos, entre otros. Es por ello que Quideau et al. (2011) proponen que es más adecuado utilizar el término de polifenoles para referirse a aquellos compuestos que son metabolitos secundarios de las vías metabólicas del ácido shikímico y del fenilpropanoide y que posean más de un anillo fenólico. A continuación, se describirá la clasificación de los compuestos polifenólicos más conocida con algunos ejemplos de cada una de las familias, así como las fuentes más representativas de los mismos. 3.1.1 Clasificación de los compuestos polifenólicos Existe una gran diversidad de compuestos que se encuentran ubicados en la familia de los polifenoles, desde las moléculas simples, como los ácidos fenólicos, hasta moléculas complejas, tales como oligómeros de estilbenos, lignanos, galotaninos, elagitaninos. Los polifenoles se pueden encontrar en forma libre y en forma conjugada o ligada, asociados a uno o más azúcares simples mediante los grupos hidroxilos; dichos azúcares pueden ser monosacáridos, disacáridos e inclusive oligasacáridos (Cheynier, 2005; Álvarez & Orallo, 2012). También es posible encontrar polifenoles ligados de forma covalente a componentes estructurales de la pared celular, como celulosa, hemicelulosa, lignanos, pectina; estos se vuelven un poco más insolubles, lo que puede afectar su forma de absorción en el organismo (Acosta-Estrada et al., 2014). 8 Ácidos fenólicos Los ácidos fenólicos son compuestos polifenólicos no flavonoides que se pueden dividir en dos grandes grupos según su estructura base (Manach et al., 2004). Se encuentran los ácidos hidroxibenzoicos, tales como el ácido gálico, el ácido vanílico, ácido protocatecútico, así como los ácidos hidroxicinámicos, tales como el ácido caféico, el ácido clorogénico, el ácido p-coumárico y el ácido ferúlico (Tsao, 2010). Dichos compuestos representan una tercera parte de la familia de los polifenólicos presentes en la dieta; uno de los más frecuentes es el ácido cafeico, el cual se puede encontrar en manzanas, tomates y uvas (Robards et al., 1999). Dichos compuestos pueden actuar como antioxidantes ya que funcionan como secuestradores de radicales (Kondratyuk & Pezzuto, 2004). Figura 1. Estructuras de algunos de los ácidos fenólicos. Flavonoides Los flavonoides son compuestos de bajo peso molecular, corresponden a los polifenoles más abundantes y se encuentran en plantas vasculares, principalmente en las hojas y parte exterior de la planta (Martínez et al., 2002). Todos estos compuestos poseen una unidad estructural base correspondiente a dos anillos aromáticos (A y B) separados de un heterociclo oxigenado, como se puede observar en la Figura 2, que se conoce como fenilbenzo-γ-pirona. El anillo A proviene del 9 metabolismo de resorcinol, mientras que el anillo B se deriva de la ruta del shikimato (Kondratyuk & Pezzuto, 2004). A partir de diversos grados de saturación, así como de sustitución en el anillo C, es posible tener varias clases de flavonoides, entre estos flavonas, flavonoles, flavanonas, flavanonoles, flavanoles y antocianinas, tal y como se puede observar en el Figura 2 (Álvarez & Orallo, 2012; Maestro & Borja, 1993). Dichas estructuras base son conocidas como agliconas, pero en las plantas existen como glicósidos (Tsao, 2010; Robards et al., 1999). Figura 2. Estructura base de los flavonoides y sus respectivas familias. Las flavonas no se encuentran frecuentemente en frutas, pero sí en cereales y en plantas herbáceas. El perejil y otras hierbas aromáticas como el romero y el tomillo contienen apigenina, 10 que junto con la luteolina (Robards et al., 1999), son las flavonas más comunes; es posible encontrar glicósidos de flavonas en verduras y hortalizas, y en altas concentraciones pueden contribuir a la coloración de las plantas o ser responsables del sabor amargo, como la nobiletina y tageretina (Rivas & García, 2002; Tsao, 2010; Maestro & Borja, 1993). Los flavonoles se encuentran ampliamente distribuidos en las frutas con patrones de sustitución comúnmente encontradas en los anillos A y B con grupos hidroxilos en las posiciones 5 y 7 así como o 3´y 4´. Ejemplos de estos compuestos son quercetina, un compuesto amarillo verdoso presente en las cebollas, manzanas, brócoli, cerezas, uvas y repollo rojo, así como el kaempferol que se encuentra en puerros, brócoli, rábanos y remolacha roja (Martinez et al., 2002; Tsao, 2010; Maestro & Borja, 1993). Las flavanonas, también llamadas dihidroflavonas, poseen propiedades ópticas provenientes de la estereoquímica presente en el carbono 2 (Maestro & Borja, 1993). Corresponden a un grupo muy reducido de flavonoides que aparecen en alimentos, la mayoría se encuentra en alimentos cítricos, tal es el caso de la hesperidina que se localiza en la naranja y el limón, así como la naringina, la cual provee el sabor amargo de la toronja y a la naranja agria (Robards et al., 1999; Tsao, 2010; Maestro & Borja, 1993). 11 Figura 3. Estructuras de algunos compuestos pertenecientes a la familia de las flavonas, flavanonas, flavanonoles y flavonoles. Los flavanoles presentan estructuras derivadas de tres esqueletos básicos: flavan-3-ol, flavan- 4-ol y flavan-3,4-diol, con diversos sustituyentes en el anillo B (Maestro & Borja, 1993). Son importantes constituyentes de frutas en sus formas oligoméricas y poliméricas como las procianidinas, también conocidas como taninos condensados (Figura 4). Pueden además presentar residuos acilo, siendo el ácido gálico el sustituyente más frecuente. Los monómeros de flavan-3-ol son genéricamente conocidos como catequinas y se diferencian entre sí según el grado de sustitución del anillo B, así como también de la esteroquímica presente en el carbono 3 (Figura 4) (Rivas & García, 2002; Robards et al., 1999; Tsao, 2010). 12 Figura 4. Estructuras de algunos flavanoles. Las antocianinas son el segundo grupo más abundante de los flavonoides. Son responsables de dar las coloraciones rojas, violetas y azuladas (Martínez et al., 2002). Las más comunes son las cianidina, delfinidina, peronidina, pelargonidina, petunidina y malvidina (Figura 5). Es posible que se encuentren enlazadas con azúcares en la posición 3 con glucosa, arabinosa, y galactosa, así como restos de ácido cumárico, caféico, ferúlico o malónico, enlazados a la posición 6 del azúcar (Robards et al., 1999; Tsao, 2010). Son solubles en agua, etanol y metanol, e insolubles en disolventes lipídicos. En medio ácido se encuentran en forma de cationes que se estabilizan por deslocalización de electrones en sus anillos. Poseen una alta reactividad en diferentes condiciones de pH, temperatura, presencia de oxígeno, dióxido de azufre, metales, entre otros, por lo que no son muy estables y es posible que se modifiquen sus propiedades químicas, físicas y biológicas (Rivas & García, 2002). Estos compuestos son parte importante de la pigmentación de los vegetales y frutas, es posible encontrarlos en bayas como arándanos, cerezas, ciruelas, fresas, en hortalizas como cebolla y rábano, así como en verduras como repollo y remolacha (Cheynier, 2005). 13 Figura 5. Estructuras de algunas antocianinas. Estilbenos Son compuestos que poseen dos subestructuras fenólicas conectados por un puente de metileno. Actúan como antifúngicos y fitoalexinas en las plantas y son sintetizados por las mismas en respuesta a infecciones o por daños estructurales. El resveratrol (Figura 6) es el estilbeno más conocido y estudiado, está presente mayoritariamente en la cáscara de las uvas. Ha mostrado cierta actividad anticancerígena, antiinflamatoria, antifúngica y antimicrobiana (Kondratyuk & Pezzuto, 2004; Maestro & Borja, 1993). Figura 6. Estructura del resveratrol. Lignanos Son compuestos difenólicos que contienen 2,3-dibenzilbutano, los cuales son formados por la dimerización de dos residuos de ácido cinámico y son ampliamente distribuidos en la naturaleza. El secoisolariciresinol es considerado un fitoestrógeno, cuando éste es ingerido por el ser humano las bacterias del intestino lo convierten en otros dos lignanos, enterolactona y el enterodiol, los cuales poseen un efecto estrógenico. Entre los estudios realizados se ha observado que es posible utilizar 14 este tipo de compuestos en terapias contra el cáncer, así como antioxidantes (Kondratyuk & Pezzuto, 2004; Manach et al., 2004). Figura 7. Estructura del secoisolariciresinol. 3.1.2 Métodos de determinación de polifenoles en matrices de alimentos Para conocer el contenido y perfil de polifenoles presentes en alimentos (frutos, pulpas, jugos, jaleas, cereales, entre otros) es importante realizar una extracción de estos compuestos; para ello primero se escoge un disolvente adecuado que, en la mayoría de los casos, es una mezcla acuosa neutra de metanol, etanol o acetona, o mezclas ácidas de estos mismos solventes, dependiendo de las necesidades de los análisis posteriores y de la clase de polifenoles que se encuentren en la matriz. Luego, es importante considerar la temperatura de extracción, la cual puede llevarse a cabo a temperatura ambiente (25 °C) o a una temperatura no superior a los 40 °C, para evitar descomposición. Se emplean técnicas de extracciones múltiples, usando agitador orbital o bien un baño ultrasónico, que permita un buen contacto entre el material y el disolvente. Posteriormente, se realiza un proceso de filtración y se obtiene el extracto adecuado para los análisis correspondientes (Ameer et al., 2017; Ajila et al., 2011). Para determinar de manera cualitativa la presencia de polifenoles en una matriz o bien su cuantificación e identificación, se puede utilizar metodologías de análisis que involucran reacciones específicas, según los grupos funcionales presentes en los polifenoles; por ejemplo, reacciones de reducción-oxidación (REDOX), precipitación de las proteínas y absorción de luz, entre otras. Valiéndose de que los compuestos fenólicos pueden ser partícipes de reacciones REDOX, existen los métodos conocidos como Folin-Ciocalteu y Price-Butler. En el primero, el ion fenolato es 15 oxidado (en medio alcalino) mientras que el reactivo fosfotúngstico-molíbdico es reducido; en el segundo método, también el ion fenolato es oxidado mientras que el ion Fe3+ es reducido a Fe2+. En ambos métodos se genera un complejo azul que puede ser medido por espectroscopia UV-VIS y los resultados se expresan como equivalentes de ácido gálico o ácido tánico, dependiendo del compuesto con el cual se estandarice la medición (Singleton et al., 1999; Price et al., 1977). Para la determinación de los taninos se puede utilizar el método de Price-Butler, en el cual se utiliza la propiedad que poseen estos compuestos para precipitar proteínas. Este método se lleva a cabo en tres pasos: primero se determina la cantidad de fenoles totales, luego se remueven los taninos mediante precipitación con una solución de seroalbúmina bovina (BSA) y finalmente se determina en una alícuota del sobrenadante la concentración de fenoles. Se cuantifica los taninos como la diferencia entre los fenoles totales de la primera etapa y los que quedan en el sobrenadante; el contenido de taninos totales se expresa como equivalentes de ácido tánico o equivalentes de ácido gálico (Waterman & Mole, 1994). Para la cuantificación de flavan-3-ol se utiliza una solución metanólica de vainillina acidificada. El principio de este método es la reacción entre el aldehído aromático de la vainillina con el anillo A de los flavan-3-ol, lo que genera un aducto de color rojo y los resultados se expresan como equivalentes de catequina (Hagerman, 2002) En el caso de los flavonoides totales, los métodos existentes se basan en la formación de complejos coloreados entre los hidroxilos fenólicos y el grupo ceto de los flavonoides con el tricloruro de aluminio o el 2-aminoetil difenilborato (Ho et al., 2012). Todos los métodos anteriores son utilizados para conocer la cantidad de compuestos polifenólicos totales que hay presentes en la matriz. Pero, si lo que se requiere es conocer el perfil de compuestos, identificar cuáles son los mayoritarios y cuáles se ven afectados puntualmente según el tipo de procesamiento que se le aplique a la matriz, se cuenta con técnicas un poco más selectivas y específicas, como lo es HPLC o UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography). Dichas técnicas pueden utilizar detectores ultravioleta-visible (UV-VIS), en los cuales a una longitud de onda definida es posible observar una señal emitida por cada compuesto según su absorción de luz. Por ejemplo las antocianinas poseen una banda característica entre 510-520 nm que las diferencia de los otros compuestos fenólicos cuyas absorciones normalmente están en 260-280 nm. Con este tipo de detectores es necesario, para identificar y cuantificar cada compuesto, utilizar estándares 16 comerciales de polifenoles; el problema es el costo monetario que implica tener cada uno de ellos y además no existen estándares de todos los tipos de compuestos que se pueden elucidar. Es por ello que en los últimos años se han desarrollado nuevas metodologías (Cuadro 1) utilizando detectores más versátiles, como los detectores de masas, con los cuales se logra obtener a un tiempo de retención información específica como la masa del ion molecular, así como iones generados del fraccionamiento del compuesto. Con esta información se puede obtener la identidad tentativa de un compuesto utilizando una base de datos y, de ser necesario, se puede comparar con estándares comerciales para asegurar su identidad. Cuadro 1. Condiciones de análisis por cromatografía líquida para la determinación de compuestos polifenólicos en diferentes matrices de alimentos. Matrices Analitos a identificar Método de extracción Parámetros cromatograficos, equipo y columna Referencia Bayas Antocianinas, ácidos hidroxicinámicos flavonoles H2O, ultrafiltración de membrana LC preparativa: 250 × 20 mm Eurospher 100–5 C18 Identificación: HPLC/DAD/ESI±-MSn, 150 × 2,1 mm, 5 μm. λ 280, 325, 360 y 520 nm Kowalska et al., 2017 Cas (P. friedrichsthalium) Ácido elágico, miricetina, quercitrina, quercetina MeOH/H2O (70 mL/100 mL), pulpa deshidratada, dispersión mecánica LC-TOF-ESI± (m/z 100– 1000), Synergi Hydro RP 80A 250 × 4,6 mm, 4 μm Flores et al., 2013 Güísaro (P. guinnesis), jambolan, nance, lúcuma Taninos hidrolizables y condensados, flavonoles, flavanoles Acetona/H2O/HCOOH (70:29:1). Pulpa seca, extracción acelerada con solventes HPLC-DAD-ESI−-MSn, Aqua RP18 150 × 2,0 mm, 3 μm. Gordon et al., 2011 Perilla frutescents (L.) Britton Ácido rosmarínico scutelarein-7-O- glucurónido, ácido caféico, apigenin-7-O- diglucurónido, apigenin-7-O- glucurónido Etanol (EtOH)/H2O (75 mL/100 mL), extracción acelerada con solventes (N2 1200 psi 70 °C) UPLC-PDA-ESI−-TOF-MS, Kintex XB C18 column 150 × 2,1 mm, 1,7 μm Assefa et al., 2018 Solanum lycopersicum L. Hexósidos de ácido caféico, ácido homovaníllico y ácido dicafeoilquinico Metanol (MeOH)/H2O (80 mL/100 mL) HPLC-DAD-ESI−-MS/MS, Zorbax 300SB-C18 column (2,1 × 150 mm; 5 μm) Anton et al., 2017 Rubus fruticosus, Prunus spinos, Cornus mas ácido gálico, rutina HCOOH/MeOH/H2O (0.1/70/29.9) LC-FLD λex 280, 320, 322 nm λem 360 nm. Eclipse XDB C18 150 × 4,6 mm Radovanović et al., 2013 Diversos té (verde, herbales y frutales) Ácido gálico, ácido cafeico (+)-catequina, (– )-epicatequina, (–)- epigalocatequina, procianidina B1, procianidina B2 95 °C 10 min LC-PDA/FLD scan 260– 400 nm Zorbax Eclipse XDB-C18, 150 × 4,6 mm, 5 μm Veljković et al., 2013 Frutas secas y enlatadas Ácido vanílico, elágico, gálico, p-cumárico, clorogénico, caféico, ferúlico, rosmarínico, miricetina, quercetina, kaempferol, delfinidina, cianidina, pelargonidina MeOH/H2O (62.5 mL/100 mL), sonicación HPLC-DAD at 260, 280, 329, y 520 nm. Zorbax Eclipse Plus C18 column 150 × 4,6 mm, 3,5 µm Miletić et al., 2014 17 continuación del cuadro 1 Guayaba rosada Elagitaninos, flavones, flavonoles, flavanoles, proantocianidinas, dihidrochalconas, antocianidinas, estilbenos, acetofenonas, benzofenonas Pulpa liofilizada, MeOH/H2O (90:10), sonicación UHPLC-DAD-ESI+- MS/MS, BHE Shield RP18 150 × 2,1 mm, 1.7 μm Rojas-Garbanzo et al., 2017 Jugo de mora Elagitaninos antocianinas Jugo microfiltrado HPLC-DAD-ESI+-IT- MS/MS Lichrosrb ODS-2 250 × 4,6 mm, 5 µm Azofeifa et al., 2018 3.2 Importancia biológica de los polifenoles Existe una gran variedad de estudios sobre los efectos preventivos atribuidos a la ingesta de productos con alto contenido de polifenoles, ya que, desde el punto de vista de su actividad biológica muchos, de estos compuestos poseen la capacidad de captar radicales libres, lo que contribuye a disminuir el estrés oxidativo, que por diferentes factores pueden sufrir el metabolismo humano y el de las plantas. La ingesta diaria de frutas, verduras y granos enteros (que son ricos en polifenoles) genera una disminución en el riesgo de sufrir ciertos tipos de cáncer, enfermedades cardiovasculares, inflamación crónica, así como enfermedades degenerativas, las cuales están relacionadas con el aumento del estrés oxidativo en las células (Tsao, 2010; Barberán, 2003). Por otro lado, existen también compuestos que exhiben actividad estrogénica (fitoestrógenos), como las isoflavonas, los lignanos y el estilbeno resveratrol, mientras que otros, como los taninos, son capaces de fijar metales y proteínas (Rivas & García, 2002). Por dichos mecanismos de acción se ha generado una gran cantidad de investigaciones sobre los beneficios que los polifenoles ejercen en el ser humano. En la Figura 8 se resumen algunas de las actividades y efectos biológicos que se le ha atribuido a la ingesta de alimentos con un contenido importante de compuestos polifenólicos. 18 Figura 8. Efectos y actividades biológicas asociadas a los polifenoles. 3.2.1 Actividad frente al cáncer El proceso de carcinogénesis lleva alrededor de unos 10 años o más en desarrollarse; se ha caracterizado por poseer una variedad de etapas y ser microevolucionario. Generalmente la aparición de un tumor se deriva de la aparición de una célula anormal y a partir de la misma se desarrollan cuatro etapas: 1- la iniciación, en la cual se genera un daño a nivel del ADN; 2- luego le sigue la etapa de promoción, en la cual se ve involucrada la expansión de las células dañadas; este proceso es parcialmente reversible; 3- la formación de la masa tumoral es conocida como progresión, en la cual se da un una pérdida del control del crecimiento celular por una alteración del sistema defensivo, y 4- la última etapa conocida como metástasis o invasión (Kondratyuk & Pezzuto, 2004). Entre los posibles iniciadores del cáncer se encuentran las radiaciones o ciertos químicos que inducen la generación de radicales libres, los cuales dañan el ADN. Sumado a esto existen células del sistema inmune como neutrófílos y macrófagos que producen especies reactivas de oxígeno, a las cuales se les atribuye un efecto directo sobre las proteínas que reparan el ADN; si este último no es reparado, se pueden dar alteraciones que conllevan a mutaciones que al final derivan en un cáncer (Kondratyuk & Pezzuto, 2004; Álvarez & Orallo, 2012). Los efectos anticancerígenos de los polifenoles se han observado en tipos de cáncer de boca, el estómago, el duodeno, el colon, el hígado, el pulmón, la glándula mamaria o la piel. Se han probado muchos polifenoles, como proantocianidinas, flavonoides, resveratrol, taninos, epigalocatequina-3-galato, ácido gálico y antocianinas; todos mostraron efectos protectores en A ct iv id ad es Cardioprotectiva Antiinflamatoria Antioxidante Anticancerigena Ef ec to Antimicrobiano Neuro-protector Hepatoprotector Protector de función pulmonar 19 algunos modelos, aunque se encontró que sus mecanismos de acción eran diferentes (Johnson et al., 1994), como se puede observar en la Figura 9. Figura 9. Actividad frente al cáncer de algunos tipos de polifenoles. Los flavonoides pueden ser considerados inhibidores tumorales que tienen la capacidad de interferir en cualquier etapa del proceso mediante diversos mecanismos (Álvarez & Orallo, 2012; Wang et al., 2011). Pueden dificultar la absorción del promotor tumoral en el tubo digestivo, sin embargo, muchos de los efectos anticancerígenos podrían ser el resultado de la modulación de las enzimas de la fase I del metabolismo tales como el citocromo P450 (Fase I) o podrían generar una inducción de enzimas antioxidantes y destoxificadoras, lo que provocaría una inactivación de agentes carcinogénicos (Muñoz & Ramos, 2007; Álvarez & Orallo, 2012). Algunos otros mecanismos por los cuales los polifenoles tienen una importancia a nivel de tratamiento contra el cáncer es que interfieren en la metabolización de agentes mutagénicos o de sus precursores, interfiriendo en la actividad de las enzimas de la fase II del metabolismo (Álvarez & Orallo, 2012; Wang et al., 2011). El resveratrol podría inhibir cada etapa de la carcinogénesis, eliminar poblaciones incipientes de células de cáncer de próstata dependientes de andrógenos a través del antagonismo del receptor de andrógenos y eliminar poblaciones incipientes de células de cáncer de próstata andrógeno- independientes al cortocircuitar los bucles autocrinos dependientes del factor de crecimiento epidérmico en las células cancerosas (Stewart et al., 2003). Proantocianidinas •Inhiben la metástasis del cáncer de pecho Antocianinas •Reparan y/o protegen la integridad genómica del ADN •Retardan el crecimiento de vasos sanguíneos tumorales Epilocatequinas •Previenen la carcinogénesis de colon •Inhiben el daño en el ADN Resveratrol •Inhibe cada etapa de la carcinogénesis •Secuestra poblaciones incipientes de células de cáncer de próstata andrógeno-dependiente / independiente Elagitaninos •Induce apoptosis de líneas celulares de tumores orales 20 Entre los flavonoides que poseen la capacidad de desintoxicación se encuentran la crisina, baicaleína y la naringenina, las cuales inhiben la actividad de las aromatasasy disminuyen la biosíntesis de estrógeno, produciendo un efecto antiestrogénico, importante en el cáncer de próstata y mama. La genisteína, perteneciente a la familia de las isoflavonas, ha demostrado ser un inhibidor específico de la proteína cinasa de tirosina e inhibe además, la inducción estimulada por el factor de necrosis tumoral de las moléculas de adhesión celular derivada del endotelio vascular (Muñoz & Ramos, 2007, Álvarez & Orallo, 2012). 3.2.2 Actividad cardioprotectora Las flavonas e isoflavonas ejercen un efecto vasodilatador dependiente de la estructura del compuesto. Existe una variedad de mecanismos por los cuales pueden ejercer dicho efecto; uno de ellos se encuentra asociado a la inhibición de fosfocreatincinasa o a alguno de los procesos activados por ésta, aunque la inhibición de las cinasas de las fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos y el bloqueo de la entrada de calcio pueden contribuir a este efecto (Muñoz & Ramos, 2007). Los compuestos como el resveratrol, la quercetina, las catequinas y proantocianidinas inhiben la oxidación de lipoproteínas y el bloqueo directo a nivel celular de la toxicidad de la LDL oxidasa. Además inhiben la agregación plaquetaria por inhibición de la ciclooxigenasa (COX) o de la lipooxigenasa (LOX) o por impedimento en la formación de tromboxanos. Otros incrementan las concentraciones celulares del monofosfato de adenosina cíclico (AMPc). Los efectos protectores contra enfermedades cardiovasculares se deben a la disminución de la oxidación de lipoproteínas de baja densidad (LDL), el aumento en la concentración de lipoproteínas de alta densidad (HDL), la reducción de la liberación de mediadores a partir de mastocitos y la disminución de la inflamación vascular y la inhibición de la agregación plaquetaria y los daños vasculares de la formación de trombos y vasodilatación (Muñoz & Ramos, 2007; Barberán, 2003; Manach et al., 2005). La lipoperoxidación de las membranas celulares puede llevar a un aumento en la degeneración de la sinapsis, así como de algunas neuronas que pueden llevar a desórdenes neuronales tales como Alzheimer, Parkinson y Huntington (Kondratyuk & Pezzuto, 2004; Barberán, 2003). Diferentes estudios han demostrado que la ingesta de bayas, como las moras (Rubus), atenúan los procesos degenerativos del cerebro en roedores, ya que los metabolitos obtenidos 21 después de la ingesta de esta fruta, presentaron un efecto neuroprotector contra el ataque de radicales H2O2 (Tavares et al., 2012). 3.2.3 Actividad antioxidante La oxidación se puede definir como el proceso por el cual un compuesto pierde electrones y sufre cambios estructurales, ya sea por ganancia de oxígenos o pérdida de hidrógenos. La reducción es el proceso contrario, se da por una ganancia de electrones y se ganan hidrógenos o se pierde oxígeno en su estructura. Dichos procesos se llevan a cabo en nuestro organismo. Las estructuras de las macromoléculas tales como proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos y lípidos poseen pares de electrones libres que están disponibles para realizar reacciones REDOX y formar compuestos o aductos que en algunos casos pueden ser perjudiciales para el metabolismo celular (Quintanar & Calderón, 2009). El oxígeno es uno de los elementos necesarios para muchos procesos biológicos en la mayoría de los organismos vivos, pero también es el principal agente de deterioro de numerosos alimentos y materiales orgánicos que se encuentran expuestos al aire. De la misma forma, la luz es esencial para las plantas en la fijación de carbono por medio de los pigmentos fotosintéticos, pero está compuesta por longitudes de onda pequeñas (UV) que son perjudiciales a nivel celular. Estos dos factores son considerados iniciadores de reacciones radicalarias a nivel celular, las cuales constan de tres etapas: iniciación (1), propagación (2) y terminación (3) (Maestro & Borja, 1993). O2 → ·O-O· R-H → R· (1) R· + ·O-O·→ROO· ROO· + R-H → R· + ROOH (2) OO· + R· → ROOR ROO· + ROO· → ROOR + O2 (3) En la fase inicial se da la formación de radicales libres orgánicos R·, también conocida como autooxidación. En la fase de propagación se forman radicales peróxidos ROO· que posteriormente reaccionan con compuestos orgánicos generando más especies R·, las cuales continúan la reacción con oxígeno molecular. Finalmente, cuando todo el oxígeno o los compuestos orgánicos han 22 reaccionado, empieza la fase de terminación. En ésta, los radicales se combinan entre sí para dar productos inactivos (Maestro & Borja, 1993). En nuestro organismo se generan una gran cantidad de especies radicalarias muy reactivas como es el caso del O2 -, O2·, ·OH, ·OR, NO·, que se clasifican tanto como especies reactivas de oxígeno (ROS,por sus siglas en inglés) y especies reactivas de nitrógeno (RNS, por sus siglas en inglés), las cuales producen daños a los carbohidratos, al ADN, a las proteínas y a los lípidos (Quintanar & Calderón, 2009; Muñoz & Ramos, 2007). Los sistemas de defensa fisiológica frente al daño generado por estos radicales se conocen como agentes antioxidantes, los cuales son específicos, afines, numerosos y diversos, y se pueden clasificar según se detalla en la Figura 10 (Rivas & García, 2002). Figura 10. Clasificación de los antioxidantes según su actividad. . Los mecanismos antioxidantes que se llevan a cabo en el organismo para controlar el estrés oxidativo son diversos (Quintanar & Calderón 2009; Robards et al., 1999). Existen agentes endógenos tales como:  Proteínas que se acomplejan a las especies reactivas y evitan su acción, tales como transferrina y ceruloplasmina, que acumulan o transportan metales, así como la hemoglobina y la mioglobina que transportan oxígeno.  Enzimas antioxidantes con gran afinidad para catalizar con altas velocidades la reacción de reducción parcial de una especie reactiva, tales como la superóxido dismutasa (SOD) que cataliza la disminución de O2 a H2O2, la glutatión peroxidasa (GPx) que cataliza la reducción Antioxidantes Previenen la formación de radicales Captadores de radicales libres Inhiben la iniciación del proceso oxidativo Interfieren en el proceso de propagación Revierten el proceso oxidativo 23 del peróxido de hidrógeno o lipoperóxidos, la glutatión sulfhidril transferasa (GST) y la catalasa (CAT).  Co-sustratos antioxidantes, los cuales son empleados por enzimas para reducir parcialmente a los radicales como lo es el glutatión y el NADPH.  Enzimas que regeneran sustratos o co-sustratos antioxidantes como la vitamina E, el NADPH y el glutatión reductor. Los antioxidantes exógenos son aquellos que provienen de la dieta, como es el caso de los compuestos polifenólicos, los cuales son considerados fuertes antioxidantes, ya que debido a su estructura, pueden “neutralizar” los radicales libres donando un electrón o un átomo de hidrógeno. Poseen además un sistema altamente conjugado y ciertos patrones de hidroxilación que hacen posible suprimir la generación de radicales libres y por ende reducir la velocidad de oxidación de compuestos importantes a nivel celular. Además, su estructura les permite atrapar metales de transición, como Fe2+, lo que conlleva a una disminución de la reacción de Fenton (4), evitando así la oxidación causada por los radicales hidroxilo altamente reactivos (Quintanar & Calderón, 2009). Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + ·OH + OH- (4) Los flavonoides constituyen la familia de polifenoles a la cual se les ha adjudicado la mayor parte de la actividad antioxidante de ciertos alimentos, principalmente en frutos y vegetales. Poseen la cualidad de catalizar el transporte de electrones, así como de unirse a los polímeros biológicos, tales como enzimas, transportadores de hormonas y ADN (Martínez et al., 2002), esto por la presencia de ciertas características estructurales (Rivas & García, 2002; Robards et al., 1999), tales como:  Poseer grupos funcionales capaces de donar electrones e hidrógeno con potenciales de reducción apropiados (540-700 mV).  Presencia de un sistema altamente conjugado debido a los anillos aromáticos, por lo que es posible deslocalizar el radical formado.  Grupos hidroxilo y sus pares de electrones libres son considerados agentes quelatantes de metales de transición tales como Fe o Zn.  Algunos por su carácter lipofílico o hidrofílico, así como por su coeficiente de reparto, poseen una buena accesibilidad al lugar de acción. 24 Dichos compuestos retiran el oxígeno reactivo especialmente en forma de aniones superóxidos, radicales hidroxilos, peróxidos lipídicos o hidroperóxidos, de manera que se bloquea su acción sobre las células. Las procianidinas pueden ser absorbidas por las membranas celulares y protegerlas de la acción de estos radicales libres; esto debido a que poseen la ventaja de tener una naturaleza tanto lipofílica como hidrofílica, por lo que son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica y pueden proteger las células cerebrales, las cuales son muy sensibles al ataque de los radicales libres (Martínez et al., 2002). La quercitina es otro de los flavoniodes que posee un efecto inhibitorio en la producción de radicales por parte de las células. Es un potente inhibidor de la producción de neutrófilos y O2-, inhibe la fosforilación de proteínas neutrofílicas, así como suprime la peroxidación lipídica en muchos sistemas biológicos como mitocondrias, cloroplastos, eritrocitos y micromosomas (Robards et al., 1999). Diferentes estudios epidemiológicos hacen referencia a la importancia del consumo de antioxidantes para obtener beneficios en la salud. Dichos compuestos pueden ser compuestos polifenólicos, como flavonoides, que pueden encontrarse en frutas y hortalizas a las cuales se les ha analizado su capacidad antioxidante y se les ha atribuido la disminución de síntomas provenientes de enfermedades cardiovasculares, neudegenerativas, o inclusive, tener alguna incidencia sobre el desarrollo de ciertos tipos de cáncer (Dembitsky et al., 2011; Collins 2005). Wang et al. (1996) determinaron la actividad antioxidante de un total de 12 frutas y jugos de frutas comerciales, por medio del ensayo ORAC. En base seca, entre los frutos analizados la fresa tenía otra vez la actividad más alta, seguida por la ciruela, naranja, pomelo rosa, tomate, kiwi, uva roja, uva blanca, manzana, melón, pera y plátano. Se observó que la mayor parte de la capacidad antioxidante de estos frutos se encuentra en las fracciones de jugo. Además, se obtuvo que el jugo de uva posee la mayor actividad, seguido por el jugo de toronja, jugo de tomate, jugo de naranja y jugo de manzana. Posteriormente, Wang y colaboradores (1997) demostraron que las antocianinas presentan actividades antioxidantes altas; es por ello que al estar presentes en mayor proporción en frutas como fresas, arándanos y uvas, éstas poseen altos valores en su actividad antioxidante. 25 Además de las antocianinas, aquellos alimentos que son ricos en flavanonas, como la naranja y en flavonoles como la cebolla, el puerro, las espinacas y la col verde, presentan actividades antioxidantes elevadas (Proteggente et al., 2002). Vinson et al. en el 2001 realizaron un estudio sobre la cantidad de fenoles libres y ligados en 20 frutos que se consumen en la región de América, determinados por medio del método CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity), con el cual se observó que, en base seca, el arándano tenía los niveles más altos de fenoles totales seguido de la uva roja. Se observó que la vitamina C representaba una pequeña contribución a los antioxidantes en las frutas, con la excepción de melón, nectarina, naranja, uva blanca y fresa. En lo que respecta a frutas tropicales, Wu et al. en el 2004 empezaron a desarrollar una base de datos con las capacidades antioxidantes de componentes tanto lipofílicos como hidrofílicos en una serie de frutas como banano, piña, fresa, melón, kiwi y sandía, entre otros. A este trabajo se le unen otra gran variedad de investigaciones que evalúan dicha capacidad antioxidante, tanto con el método ORAC, como ABTS, TEAC, DPPH, además de la determinación de polifenoles totales y de ácido ascórbico (Patthamakanokporn et al., 2008; Almeida et al. 2011; Mahattanatawee et al. 2006). Esto con el fin de conocer y ampliar la gama de alimentos que pueden ser funcionales y que aporten beneficios a la salud del ser humano. En Costa Rica también se ha impulsado la investigación de la actividad antioxidante de algunas frutas tropicales no tradicionales; tal es el caso de la pitahaya que, según un estudio presentó un bajo contenido de vitamina C (116-171 μg/g) en su pulpa, pero es una fruta rica en betacianinas (0,32-0,41 mg/g) y compuestos polifenólicos (5,6-6,8 μmol ácido gálico/g), así como una alta actividad antioxidante según su valor de ORAC (8,8-11,3 μmol equivalentes de Trolox/g) (Vaillant et al., 2005). Otro fruto no tradicional es la naranjilla (Solanum quitoense Lam.), la cual presentó un valor de H-ORAC de 17 ± 1 μmol equivalentes de Trolox /g, el contenido de polifenoles totales fue 48 ± 3 mg equivalentes de ácido gálico /100 g y el contenido de ácido ascórbico fue 12,5 ± 0,1 mg/100 g (Acosta et al., 2009). En el 2012 se realizó un estudio de la capacidad antioxidante determinada por H-ORAC y su correlación con la capacidad antioxidante a nivel celular empleando eritrocitos ERYCA, reportándose que las bayas tropicales como arándano y mora presentan valores más altos en ambas metodologías y a pesar que su mecanismo de determinación es diferente, se puede 26 establecer una buena correlación entre los valores determinados por lo métodos ERYCA y ORAC (González et al., 2012). 3.3 Efecto del procesamiento en los compuestos polifenólicos Existe una gran cantidad de estudios que se enfocan en el impacto que ejerce el procesamiento de un alimento, en especial de las frutas, sobre su funcionalidad nutricional y cómo ésta puede llegar a incrementarse o, en la mayoría de los casos disminuirse, ya sea por fenómenos de degradación térmica, enzimática, oxidativa o polimerización, entre otros (Kalt, 2005). Gancel y colaboradores (2012) evaluaron el impacto de procesos industriales, tales como el escaldado y almacenamiento a diferentes temperaturas, sobre los compuestos polifenólicos y la capacidad antioxidante del jugo y pulpa de Rubus adenotrichos. Ellos encontraron que evidentemente los procesos térmicos ejercen una reducción de los compuestos fenólicos y del color del producto, así como una disminución de las antocianinas y degradación de los elagitaninos. Además, observaron que durante todo el procesamiento de la fruta, las antocianinas cianidina-3- glucósido y la cianidina-3-manolilglucósido se redujeron en 52 % y 64 % respectivamente, mientras que los elagitaninos disminuyeron por degradación a ácido elágico en un 80%. En lo que respecta a la capacidad antioxidante (H-ORAC), se observó una diminución de casi un 47 %. Durante el almacenamiento a diferentes temperaturas se reportó una diminución de las antocianinas y los elagitaninos después de 35 días, reducción que se ve aumentada a temperaturas altas (45 °C). Gil-Izquierdo y colaboradores (2002) evaluaron la cantidad de compuestos fenólicos, vitamina C y la capacidad antioxidante de jugos de naranja tratados con cinco procesos industriales, tales como prensado del fruto, diferentes niveles de pasteurización, concentración, y almacenamiento en congelación. Además, compararon el prensado manual con el industrial. Observaron que el prensado industrial extrae 22 % más de compuestos polifenólicos que el prensado manual. También se encontró un descenso en la cantidad de compuestos fenólicos durante el almacenamiento en congelación, mientras que el uso de concentración causa una pequeña precipitación de dichos compuestos (formación de turbidez). La pasteurización de la pulpa causa una degradación de algunos compuestos como el ácido cafeico y sus derivados, así como de vicenina y 27 narirutina de un 28-35 %. En lo que corresponde a la vitamina C, la extracción de jugo a nivel industrial presenta un 25 % más que el jugo extraído por medio de la técnica doméstica. De acuerdo con Alper et al. (2005), se ha observado que en tratamientos de clarificación el uso de coadyuvantes de filtración (polivinilpolipirrolidona, gelatina, bentonita y Kiselguhr) causa una mayor reducción en el contenido de polifenoles totales (21-32 %) con respecto al empleo de ultrafiltración (6,1 %). Por otro lado, estos autores observaron que un tratamiento térmico como la pasteurización junto a la clarificación también causa una disminución en el contenido de polifenoles totales. Los efectos del cultivo, tiempo de cosecha, pelado y almacenamiento también fueron evaluados en frutos como las manzanas y peras. Se observó que en condiciones de almacenamiento y frío prolongado (1 °C por 9 meses), la cantidad de polifenoles totales, la capacidad antioxidante y el contenido de vitamina C se ven disminuidos en aproximadamente un 35 %, 75 % y 80 %, respectivamente. Esto podría deberse a la generación de estrés oxidativo durante el almacenamiento, especialmente bajo atmósferas controladas, ya que éstas inducen cambios metabólicos significativos como el aumento en la actividad de la ascorbato peroxidasa y la glutatión reductasa. El pelado de dichas frutas disminuye en un 26 % el contenido de polifenoles totales, en un 48 % la concentración de vitamina C y en un 18 % la capacidad antioxidante, esto como resultado de que la mayoría de los compuestos antioxidantes se encuentra en la cáscara (Kevers et al., 2011). Según un estudio de Mullen y colaboradores (2002), las frambuesas rojas que crecen en Escocia son una fuente importante de vitamina C y compuestos fenólicos, sobre todo de antocianinas y elagitaninos. Este grupo de investigadores observó que la congelación no afecta la capacidad antioxidante de la fruta fresca, ni los niveles de vitamina C o de compuestos fenólicos. Un resultado similar se observó en frambuesas que se cultivan en España, la congelación del fruto por un corto tiempo afectó levemente los valores de ácido elágico extraído, el contenido total de polifenoles y la vitamina C. mientras que un almacenamiento en congelación a largo plazo (12 meses), no se observó ningún cambio significativo en el contenido de polifenoles totales, pero sí una disminución significativa en ácido elágico de 14-21 % y en vitamina C de 33-55 % (Begoña de Ancos et al., 2000). En el caso de los tratamientos enzimáticos, estos tienen como propósito aumentar la cantidad de jugo extraído de una fruta; en el caso de bayas como la aronia (chokeberry), se observó 28 que existe un aumento de un 63-75 % en la extracción de jugo si se aplica una maceración enzimática de la pulpa junto con un tratamiento térmico. La maceración enzimática permitió, en estas bayas, un aumento en su capacidad antioxidante, el contenido de antocianinas y el contenido de polifenoles totales (Borowska et al., 2009). Se ha observado también que el uso de enzimas proteolíticas en el tratamiento de una pulpa de manzana para la obtención de jugo mejora el contenido de polifenoles, especialmente procianidinas, ya que éstas se ven aumentadas luego del tratamiento; en lo que respecta a la actividad antioxidante, se observa un ligero aumento de la misma luego de que la pulpa es tratada enzimáticamente (Oszmianski et al., 2009). Las zarzamoras son una fuente rica en polifenoles, en particular de antocianinas, y, como la mayoría de las bayas, se consumen luego de ser congeladas o procesadas térmicamente después de un almacenamiento a largo plazo. Hager y sus colaboradores (2008 y 2010) evaluaron los efectos del procesamiento y de un período de 6 meses de almacenamiento sobre las antocianinas y la capacidad antioxidante de zarzamoras que fueron ultracongeladas individualmente, enlatadas en agua y almíbar, procesadas en puré y jugo (prensado y clarificado). Estos autores observaron que el procesamiento dio lugar a aumentos en el color de hasta 7 %, pérdidas en antocianinas monoméricas de hasta un 65 %, así como pérdidas en la capacidad antioxidante. El almacenamiento a 25 ° C de todos los productos procesados causó pérdidas dramáticas en las antocianinas monoméricas (75 %), mientras que el almacenamiento prolongado bajo condiciones de congelación a -20 °C no causó cambios en la capacidad antioxidante (Hager et al., 2008). 3.4 Bactris guineensis: el huiscoyol, un fruto no tradicional Uno de los frutos no tradicionales que podría ser un foco de estudio en nuestro país es el huiscoyol. Su nombre científico es Bactris guineensis, pertenece a la familia Arecaceae, es conocido como huiscoyol, viscoyol, güiscoyol y uvita de monte. Se puede encontrar desde Nicaragua hasta el norte de Colombia y Venezuela. Chízmar Fernández (2009) detalla que el tallo y las hojas laterales de la planta presentan una longitud de 50-60 cm de longitud, están cubiertas con espinas amarillentas delgadas con el ápice negro. La palma adulta puede alcanzar 2,0-3,5 m de altura y 2,6-3,0 cm de diámetro. La inflorescencia es un ramo de flores con una bráctea de color blanco cremoso (hoja modificada) cubierta con la espina dorsal en la parte superior que protege de los animales. Las flores son monoicas, lo que explica por qué las flores masculinas y femeninas se pueden observar en la misma planta. 29 Una planta puede producir varios tallos y de 10 a 15 racimos de fruta (equivalentes a 1,5 a 3,75 kg de fruta) en una temporada de cosecha. Considerando que la densidad puede llegar a 270- 400 plantas / ha, la producción potencial puede llegar a 675 a 1000 kg / ha en una temporada de cosecha y 1 350 a 2 000 kg / ha / año. Los frutos crecen en racimos (de 1 a 3 racimos por tallo) de diferentes tamaños con un peso que oscila entre 150-250 g (ver Figura 11). Los frutos poseen un tamaño 1,2-2,5 cm de largo, ovobados, de color púrpura rojizo a negro púrpura cuando están maduros, con una sola semilla, la cual se encuentra rodeada por una pulpa fibrosa de sabor ácido y una capa delgada de cáscara. Posee un diámetro alrededor de (1,5 ± 0,1) cm similar a la uva, lo que explica los nombres vernáculos "uvita" o "uvas pequeñas" que se le atribuyen en algunas partes de Centroamérica y Colombia (Henderson, 2000). El peso de cada fruta es relativamente homogéneo, alrededor de 3,6 ± 0,6 g. A diferencia de la uva, solo hay una semilla que tiene forma redonda y representa el 34 % de la fruta. La parte comestible de la fruta, que incluye la pulpa y la piel fina representa el 66 % del peso total del fruto, que son las partes más importantes que se consumen en forma directa o como materia prima. Este valor relativamente alto hace que esta fruta pueda potencialmente adaptarse a un procesamiento a nivel industrial de jugos, mermeladas o producción de bebidas alcohólicas (Galeano & Bernal, 2010). Fuente: http://www.palmpedia.net/wiki/Bactris_guineensis Figura 11. Palmera, racimo y fruto de Bactris guineensis. Algunos estudios atribuyen el color particular del huiscoyol a la presencia de compuestos polifenólicos pertenecientes a la familia de las antocianinas, las cuales de acuerdo con Osorio y colaboradores (2010), fueron aisladas e identificadas por cromatografía de contracorriente y HPLC; dichos investigadores señalaron la cianidina-3-rutinósido y cianidina-3-glucósido como los http://www.palmpedia.net/wiki/Bactris_guineensis 30 componentes principales (72,2 % y 15,7 %, respectivamente), además de otros pigmentos en pequeñas cantidades como la peonidina-3-rutinósido (5,1 %). Ese mismo grupo de investigación en el 2011 realizó un estudio por medio de espectroscopía paramagnética de resonancia (EPR) para analizar la actividad captadora de radicales libres mediante los métodos ABTS y DPPH (Osorio et al., 2011). Estos investigadores observaron que un extracto rico en antocinaninas provenientes del fruto presenta una mayor actividad barredora de radicales con el método DPPH (1,61x108 L mol-1 min-1) que con el método ABTS (2,02 x 106 L mol-1 min-1), además, el extracto rico en antocianinas posee una mayor actividad contra ambos radicales que las antocianinas individuales, por lo que es posible que exista un efecto de sinergia en el extracto. En el 2017, Lopez y colaboradores estudiaron la acción citoprotectiva del huiscoyol, para lo que se obtuvieron extractos de pulpa y semilla del fruto de la palma y se evaluó su capacidad para proteger tanto las neuronas como los astrocitos (Lopez et al., 2017). El análisis de estrés de la actividad química antioxidante mostró que el extracto crudo y los extractos en acetato de etilo y etanol tenían mayor capacidad antioxidante con los métodos ABTS y DPPH en comparación con los extractos obtenidos en hexano y diclorometano. Los ensayos de toxicidad también mostraron que el extracto crudo de pulpa y los extractos de acetato de etilo y etanol en dosis bajas no afectaron la viabilidad de las células de neuroblastoma y de astrocitos primarios. Por otro lado, los extractos de acetato de etilo y etanol no solo disminuyeron la producción de radicales de O2, sino que también presentaron un efecto neuroprotector contra el estrés oxidativo inducido por la rotenona. A raíz de que existen hasta ahora muy pocos estudios sobre la caracterización parcial del fruto Bactris guineensis y la estabilidad de los compuestos polifenolicos presentes, y considerando el potencial comercial de este cultivo, se planteó la presente investigación con el objetivo de determinar su valor como alimento funcional, tanto en la fruta fresca como en un jugo, con el fin de visualizar su uso como materia prima para la elaboración de productos de interés comercial. Una primera etapa correspondió a la caracterización nutricional completa del fruto fresco, mediante la determinación del aporte energético, contenido de fibra dietética, minerales, vitaminas, azúcares simples, ácidos orgánicos; además, se generó un perfil de los compuestos polifenólicos presentes y su actividad antioxidante. Seguidamente se evaluó el efecto de diversos procesos para la obtención de un jugo a escala piloto sobre los cambios a nivel de la composición de compuestos bioactivos (compuestos polifenólicos, vitamina C), así como en su capacidad antioxidante. 31 4 METODOLOGÍA 4.1 Localización del proyecto El proyecto se realizó en las instalaciones del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CITA), y de la Escuela de Tecnología de Alimentos ubicados en la Universidad de Costa Rica (UCR), Ciudad Universitaria Rodrigo Facio. Se utilizó la Planta Piloto del CITA para el procesamiento de la fruta, así como los Laboratorios de Química del CITA y de la Escuela de Tecnología de Alimentos para los respectivos análisis fisicoquímicos de los productos obtenidos. Además, se trabajó en los laboratorios del CIPRONA (Centro de Investigación en Productos Naturales) de la UCR, específicamente con el equipo de cromatografía líquida de ultra-alta eficiencia (UPLC) acoplado a espectrometría de masas (MS) marca Waters Acquity. 4.2 Materia prima El fruto de huiscoyol se recolectó en racimos, en la provincia de Guanacaste, en localidades cercanas a ríos y pantanos de la zona de Palo Verde y Cañas. La recolección se realizó durante los picos más altos de producción, los cuales fueron entre los meses de febrero-mayo y agosto-octubre. En los años 2014-2016, se recolectaron tres lotes de aproximadamente 10 kg de fruta cada uno. Estos se almacenaron en congelación a -20 °C por un período máximo de tres meses, hasta su procesamiento. 4.3 Determinación del perfil nutricional, composición de compuestos bioactivos y la capacidad antioxidante por el método ORAC de la fruta fresca de huiscoyol De la fruta recolectada se descongeló una muestra de aproximadamente 1 kg, la cual se lavó con agua potable sumergiéndola en una tina, luego se desinfectó por 20 min con una mezcla de perácidos (ácido peracético y ácido perooctanoico) en una concentración de 1 400 ppm. Luego se enjuagó con agua destilada y se dejó escurrir. Se determinó el peso de 10 frutos y de cada uno de ellos se midió con una regla las dimensiones del fruto tanto a lo largo como a lo ancho según el anexo 1. Con la ayuda de un cuchillo y de forma manual se separó la cáscara y la pulpa de la semilla. Se colocó la cáscara junto con la pulpa en una bolsa de polietileno transparente y se descartaron las semillas. Se procesaron aproximadamente 250 g de la pulpa con cáscara para realizar los análisis químicos en fresco correspondientes a: humedad, proteína, cenizas, grasa, minerales (Na, K, Fe y 32 Ca), fibra dietética, contenido de vitamina C total, acidez titulable, pH, color y grados Brix. El resto de la muestra se congeló a -20 °C y se liofilizó. El liofilizado se procesó en un molino Knifetec 1095 (Sample Mill, Foss Tecator), se empacó en bolsas metalizadas y se almacenó en congelación a -20 °C. Con esta porción de muestra se realizaron los análisis químicos de: azúcares por HPLC, capacidad antioxidante por el método ORAC, contenido de polifenoles totales con el reactivo de Folin, contenido de antocianinas totales y perfil de ácidos orgánicos y polifenoles por HPLC. 4.3.1 Diseño experimental y tratamiento estadístico Se recolectaron tres lotes de aproximadamente 1 kg de frutos correspondientes a tres picos de cosecha diferentes en la misma zona geográfica (Cañas, Guanacaste), dos de ellos durante el 2014 en los meses de febrero y setiembre, el otro lote en agosto de 2016. Se realizó una caracterización física del los frutos para lo cual se midieron con la ayuda de un calibrador las dimensiones (diámetro logitudinal y ecuatorial) del fruto (Anexo 1), masa del mismo y el color. Se determinaron parámetros a nivel de composición proximal y se midió el contenido de compuestos bioactivos, así como la capacidad antioxidante de la fruta de huiscoyol. Las variables analizadas fueron: humedad, proteína, cenizas, grasa, minerales (Na, K, Fe y Ca), azúcares por HPLC, fibra dietética, contenido de vitamina C, acidez, pH, color, grados Brix, capacidad antioxidante con el método ORAC, polifenoles totales, antocianinas totales y ácidos orgánicos por HPLC. Todos los análisis se realizaron por duplicado. Junto a esta información se analizaron también los datos nutricionales obtenidos de otros tres lotes de huiscoyol que fueron cosechados en años anteriores. En marzo de 2007 se analizó un lote proveniente de Cañas y otro lote proveniente de Palo Verde, el tercer lote fue cosechado en julio del 2011 proveniente de Cañas. Con estos seis lotes diferentes de fruta se calculó la media (�̅�) de cada una de las variables analizadas y se estimó un rango de valores con el fin de determinar la variabilidad estacional del fruto. 4.4 Efecto del procesamiento del jugo de huiscoyol sobre el contenido de compuestos bioactivos y la capacidad antioxidante por el método ORAC 33 4.4.1 Procesamiento de la fruta fresca de huiscoyol para la obtención de jugo a escala laboratorio mediante cuatro diferentes tratamientos Cada lote de fruta (10 kg) recolectado se descongeló a temperatura ambiente, se colocaron los tres lotes en una tina para formar una muestra compuesta y separar cada uno de los frutos de los racimos y seleccionar de manera manual los frutos de buena calidad según su color y textura. Se eliminaron aquellos que se encontraron inmaduros (verdes), con daño físico evidente o que presentaron contaminantes físicos como ramas y hojas o con contaminantes biológicos como moscas o gusanos. Una vez seleccionados los frutos, la muestra compuesta de huiscoyol se dividió en tres partes iguales en masa que se rotularon como muestra 1 (M1), muestra 2 (M2) y muestra 3 (M3). Cada muestra se procesó de manera individual en días diferentes. Las muestras que no se procesaban se mantuvieron en congelación (-20 °C) según el diagrama de flujo expuesto en la Figura 12. Figura 12. Flujo de proceso para la obtención de cuatro diferentes tipos de jugo de huiscoyol a escala piloto. Jugo A Jugo C C B Jugo B Jugo D 34 Una vez descongelada la muestra a procesar, se lavaron los frutos cuatro veces por inmersión con agua potable, se dejaron escurrir y luego se desinfectaron utili