Rev. Agr. Trop. 34: 41-51 (2004) EFECTO DE CONCENTRACIONES ENZIMÁTICAS Y TIEMPOS DE DIGESTIÓN EN EL AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE CALLOS Y CULTIVOS EN SUSPENSIÓN DE DOS CULTIVARES DE NARANJA DULCE (Citrus sinensis OSB)1 Mónica Jadán2, Eric Guevara3, Víctor M. Jiménez4 RESUMEN ABSTRACT Efecto de concentraciones enzimáticas y tiempos Effect of several enzyme concentrations and de digestión en el aislamiento de protoplastos a partir digesting times on the isolation of callus and de callos y cultivos en suspensión de dos cultivares de suspension culture protoplasts from two sweet orange naranja dulce (Citrus sinensis Osb.). A partir de callos (Citrus sinensis Osb.) cultivars. The effect of three embriogénicos y cultivos en suspensión de los cultivares enzyme concentrations and different digesting times over de naranja dulce (‘Acosta 6’ y ‘Washington Navel’), se intact-protoplasts recovery from embryogenic callus and evaluó el efecto de tres concentraciones enzimáticas y de cell suspension cultures of sweet orange (Citrus sinensis diferentes tiempos de digestión sobre la obtención de Osb.) cultivars ‘Acosta 6’ and ‘Washington Navel’ was protoplastos intactos. Se encontró que la concentración evaluated. It was found, that the intermediate enzyme enzimática intermedia, que contenía 1,0% celulasa, 0,2% concentration (1.0% cellulose, 0.2% pectolyase and pectoliasa y 1,0% macerozima, liberó la mayor cantidad 1.0% macerozyme) produced the highest amount of de protoplastos intactos. Los tiempos de digestión más intact protoplasts. The most effective digestion interval efectivos variaron de acuerdo con el genotipo y el tipo de varied according to the genotype and the culture type, explante inoculado, entre cuatro y ocho horas de incuba- oscillating between four and eight hours in the already ción en la solución enzimática de concentración interme- mentioned enzyme concentration. While the cell dia. En ‘Acosta 6’, los cultivos en suspensión liberaron suspension cultures released more protoplasts than the más protoplastos que los callos, pero en ‘Washington Na- callus cultures in cv. ‘Acosta 6’, no difference was found vel’ no se observó diferencia entre ellos. En forma gene- among culture types in ‘Washington Navel’. Generally, ral, se logró liberar mayor cantidad de protoplastos y cé- more protoplasts and individual cells were obtained from lulas individuales a partir de ‘Acosta 6’ que de ‘Acosta 6’ than from ‘Washington Navel’. Additionally, ‘Washington Navel’. Adicionalmente, se incluyen algu- fresh and dry weight, as well as cell size and density nas características de la estructura de la célula como la were determined in the different culture types employed cantidad obtenida de protoplastos intactos, así como, pe- for isolation. so fresco y seco, el tamaño y la densidad en los materia- les vegetales evaluados. Key words: isolation techniques, enzymatic analysis, tissue analysis, digestive absorption, Citrus sinensis, cell Palabras clave: técnicas de aislamiento, análisis enzi- structure, in vitro culture, protoplasts. mático, análisis de tejidos, absorción digestiva, Citrus si- nensis, estructura celular, cultivo in vitro, protoplastos. 1 Parte del Trabajo Final de Graduación de la coautora, presentado al Programa de Posgrado en Ciencias Agrícolas y Recursos Naturales de la Universidad de Costa Rica, para optar por el título de Magister Scientiae. 2 Ingeniería en Biotecnología, Facultad de Ciencias Aplicadas, Escuela Politécnica del Ejército, Avenida El Progreso s/n, Sangolquí, Santa Clara, Ecuador, A.S. 3 Centro de Investigación en Granos y Semillas (CIGRAS), Universidad de Costa Rica, 2060 San Pedro, Costa Rica 4 Correo electrónico: vjimenez@cariari.ucr.ac.cr. 42 REVISTA DE AGRICULTURA TROPICAL INTRODUCCIÓN más adecuadas para obtener protoplastos con capa- cidad embriogénica. Vardi et al. (1975) fueron los Desde el punto de vista de su aplicación prác- primeros en lograr en forma exitosa el aislamiento tica, el aislamiento y el cultivo de protoplastos (cé- de protoplastos totipotentes en cítricos, y posterior- lulas desprovistas de la pared celular) permiten la mente este mismo grupo consiguió obtener las pri- hibridación somática y el uso de una serie de técni- meras plantas de protoplastos aislados de varias es- cas para la transformación genética de plantas con pecies del género (Vardi 1981, Vardi et al. 1982). A importancia económica. Para el mejoramiento ge- partir de ese momento, la cantidad de especies de nético de plantas leñosas, en particular, este sistema Citrus y de géneros emparentados, a partir de los ofrece muchas ventajas con relación a la hibrida- cuales se ha logrado aislar y cultivar protoplastos ción convencional, ya que estas plantas normal- con éxito, ha aumentado rápidamente (Jiménez, mente poseen ciclos reproductivos muy prolonga- 1996). Esto ha permitido un rápido avance en la ob- dos, muchas veces en los períodos juveniles y en tención de híbridos somáticos, con el registro de, al ocasiones con problemas de incompatibilidad gené- menos, 200 combinaciones hasta el año 2000 (Gros- tica que limitan su cruzamiento sexual efectivo (Hi- ser et al. 2000). daka y Kajiura 1988, Jiménez 1996). Si bien el aislamiento, la fusión y el cultivo de La fusión de protoplastos en cítricos puede te- protoplastos en cítricos han tenido un gran desarro- ner aplicaciones hortícolas de gran importancia pa- llo en unos pocos laboratorios alrededor del mundo, ra el mejoramiento genético de patrones y de injer- hay que tomar en cuenta que el comportamiento in tos. Con relación a los primeros, se conocen más vitro de prácticamente cualquier material vegetal se de 20 características importantes, tanto hortícolas ve afectado por una serie de factores internos y ex- como de resistencia/tolerancia a organismos pató- ternos, dentro de los cuales se pueden citar: la edad genos, que son controladas o determinadas por los de la planta y del tejido, su estado fisiológico, así patrones de cítricos. En ese sentido existen dos como condiciones propias del laboratorio donde se aplicaciones principales para la fusión de protoplas- realizan los experimentos (como agua, fuentes y tos: la producción de híbridos alotetraploides entre marcas comerciales de compuestos minerales, saca- cultivares que posean características deseables rosa, agar, etc.) (Debergh 1983, Drew y Smith complementarias y la formación de estos mismos 1986, Pierik 1987, Poonsapaya et al. 1989, Auer et híbridos, pero entre miembros del género Citrus y al. 1992). Un factor especialmente crítico al res- de otros géneros emparentados, sexualmente in- pecto lo constituyen las enzimas utilizadas para la compatibles, que aporten alguna característica de digestión de la pared celular. Estas enzimas son ex- interés. Por su parte, el mejoramiento de injertos se tractos crudos purificados y originados de diferen- ha orientado principalmente hacia la producción de tes organismos, principalmente hongos (Ishii triploides sin semilla, con calidad de fruto similar al 1989), por lo cual sus características pueden variar de las variedades actuales, lo cual podría estimular de un lote a otro, y por lo tanto, hay que adaptar de el crecimiento del mercado de fruta fresca (Grosser manera constante, ciertas condiciones de aislamien- y Gmitter 1990). to, principalmente los tiempos de digestión y su concentración (Vardi y Galun, 1988 y 1989). Con En cítricos se ha logrado el aislamiento y culti- relación a esto último, diversas investigaciones se- vo exitoso de protoplastos a partir de varios tejidos, ñalan que el proceso de incubación (concentración incluyendo hojas, callos no embriogénicos, tétradas de la solución enzimática y el tiempo de digestión) florales (para la obtención de protoplastos haploi- es crítico y requiere de mayor estudio para cada ge- des), callos embriogénicos y cultivos embriogénicos notipo individual (Niedz 1993, Grosser 1994, Jimé- en suspensión (Grosser y Chandler 1987, Grosser y nez 1995, Aoyagi et al. 1999). Además, si bien los Gmitter 1990), siendo las dos últimas las fuentes callos y los cultivos, ambos embriogénicos en JADÁN et al.: AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE CALLOS Y CULTIVOS EN SUSPENSIÓN DE CULTIVARES DE NARANJA DULCE 43 suspensión se utilizan prácticamente de manera in- a 1 ml de medio BH3 0,7 M (pH 5,7), esterilizado distinta, hasta donde se conoce, no se ha realizado mediante filtración y contenido en frascos erlenme- ninguna evaluación sistemática que permita com- yer estériles de 50 ml de capacidad. Enseguida se parar ambas fuentes de material en cuanto a sus ca- agregó l,5 ml del mismo medio y luego, gota a go- racterísticas y eficiencia para el aislamiento de pro- ta, se añadió 1,5 ml de solución enzimática, com- toplastos embriogénicos en cítricos. puesta por las sales minerales del medio CPW (Frearson et al. 1973, citados por Grosser y Gmit- En vista de lo mencionado anteriormente, en ter 1990), 0,7 M manitol, 12 mM CaCl2, 6 mM áci- este trabajo se pretende evaluar el efecto de concen- do 2-(N-morfolino) etano sulfónico), 1,4 mM traciones enzimáticas y tiempos de incubación so- NaH2PO4, así como una de las concentraciones en- bre la obtención de protoplastos de naranja dulce zimáticas detalladas en el Cuadro 1, de acuerdo con (cv. ‘Acosta 6’ y cv. ‘Washington Navel’), a partir el tratamiento a evaluar (con el pH ajustado a 5,6) de callos y suspensiones celulares embriogénicos. y se agitó ligeramente. Adicionalmente se decidió evaluar y comparar di- versas características de los callos y cultivos en sus- Posteriormente se colocaron en agitación mo- pensión que podrían ser relevantes para el aisla- derada, a 50 rpm en un agitador orbital horizontal miento de protoplastos. (en oscuridad y a una temperatura de 26 a 28°C). Aislamiento de protoplastos a partir de MATERIALES Y MÉTODOS suspensiones celulares Material vegetal En este caso se colocaron 2 ml de suspensión celular, 7-9 días, después del subcultivo, en frascos Se utilizaron callos nucelares friables y sus- erlenmeyer estériles de 50 ml de capacidad. En se- pensiones celulares de los cultivares de naranja dul- guida se agregaron 2 ml de medio BH3 0,6 M y lue- ce (Citrus sinensis Osb.) ‘Washington Navel’ y go, gota a gota, se añadieron 2 ml de solución enzi- ‘Acosta 6’ cultivados durante seis años en el Labo- mática, con la composición que se detalló ratorio de Biotecnología del Centro para Investiga- anteriormente (Cuadro 1) y se agitó ligeramente. ciones en Granos y Semillas, en un medio despro- El contenido se colocó en las mismas condiciones visto de reguladores de crecimiento. Subcultivos descritas anteriormente para el aislamiento de pro- periódicos se realizaron cada cuatro semanas en el toplastos a partir de callo. caso de los callos y cada dos semanas en el de las suspensiones celulares (Jiménez y Guevara 1995). Cuadro 1. Composición de las soluciones enzimáticas evaluadas para el aislamiento de protoplastos Aislamiento de protoplastos a partir de en cítricos. callo Compuestos Tratamientos Se utilizó el procedimiento descrito por Gros- Bajo Intermedio Alto ser y Gmitter (1990), que se modificó con la finali- Celulasa RS (Karlan dad de evaluar el efecto de la utilización de tres Research) 0,5% 1,0% 1,5% concentraciones enzimáticas y de diferentes tiem- Pectoliasa Y-23 (Karlan pos de digestión sobre la obtención de protoplastos. Research) 0,1% 0,2% 0,3% El procedimiento consistió en agregar 1 g de peso Macerozima R-10 (Karlan fresco (PF) de callo, 15 días después del subcultivo, Research) 0,5% 1,0% 1,5% 44 REVISTA DE AGRICULTURA TROPICAL Evaluación del proceso de digestión y y el conteo de las células se hicieron con la ayuda determinación del número de proto- de un microscopio y un hemocitómetro, siguiendo plastos el mismo procedimiento descrito anteriormente pa- ra el conteo de protoplastos. Cada 2 horas, hasta las 14 horas, se tomaron muestras, con ayuda de pipetas Pasteur, para eva- luar el efecto del tiempo de incubación sobre la de- gradación de la pared, mediante la realización de RESULTADOS observaciones en un microscopio invertido (250X). La densidad de protoplastos intactos por g (PF) de Proceso de digestión tejido inoculado se determinó en un hemocitómetro (10X) de acuerdo con la técnica descrita por French Observaciones de los callos y los cultivos en y Hebert (1982). Las evaluaciones se realizaron suspensión realizadas al microscopio durante las por triplicado y en cada repetición se realizaron dos primeras dos horas de digestión enzimática, mos- conteos en diferentes puntos de la muestra para de- traron la acción progresiva de las enzimas sobre la terminar la reproducibilidad de la metodología. pared celular de la siguiente manera: inicialmente Los resultados se analizaron con el programa STA- ocurrió la digestión de la lámina media, lo cual cau- TISTICA (StatSoft Inc., Tulsa, Oklahoma, EUA). só una separación de los agregados celulares, libe- Se aplicó la ‘prueba de Tukey para muestras con di- rando células individuales o grupos pequeños com- ferente número de repeticiones’ (∝= 0,05) para la puestos por muy pocas células. Posteriormente, se separación de promedios. inició la degradación de las paredes celulares ex- puestas, las cuales, al inicio se fueron separando de la membrana plasmática y luego se fragmentaron, Evaluación de pesos fresco y seco para dejar libres los protoplastos. Una vez degrada- da la pared, los protoplastos adoptaron una forma Se colocó 1 g (PF) de callo en una estufa a completamente esférica (Fig. 1). 70°C por 24 horas, después de lo cual se determinó el peso seco (PS). Para las suspensiones celulares, se tomaron 2 ml de cada suspensión, se filtraron con ayuda de vacío y se determinó el PF. Luego, se secaron como se detalló anteriormente y se les de- terminó el PS. Cada determinación se hizo por tri- plicado. Determinación del número y tamaño de las células de callos y suspensiones ce- lulares Para determinar, tanto en callos como cultivos en suspensión, el número de células por g de PF y su tamaño, se procedió a tratarlas durante 14 horas de la misma forma que se hizo para el aislamiento de protoplastos, pero utilizando como única enzima Figura 1. Protoplastos aislados a partir de callo del cv. la pectoliasa (0,3%), con el fin de separar las célu- ‘Acosta 6’ utilizando 1,0% celulasa, 0,2% pecto- las sin degradar la pared celular. Las observaciones liasa y 1,0% macerozima. Barra = 40 mm. JADÁN et al.: AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE CALLOS Y CULTIVOS EN SUSPENSIÓN DE CULTIVARES DE NARANJA DULCE 45 Efecto de la concentración enzimática 8 Callos y el tiempo de digestión a a 6 Tanto la concentración enzimática, como el tiempo de digestión, fueron aspectos críticos en la b mayoría de los experimentos realizados. En gene- 4 c ral, en callos y en cultivos en suspensión, la con- c cd centración enzimática intermedia (1,0% celulasa, 2 def 0,2% pectoliasa y 1,0% macerozima) produjo ma- ef cde ef ef ef f ef yor liberación de protoplastos intactos, aunque el f ámbito de digestión óptimo fue diferente para cada Cultivos en suspensión uno de los tipos de materiales y cultivares evalua- a dos. Períodos más cortos o más prolongados resul- 9 b taron en una menor obtención de protoplastos intac- tos después del proceso de purificación (Fig. 2 y 3). cd c c6 e de ce Al utilizar callos del cv. ‘Acosta 6’, la mayor f liberación de protoplastos intactos ocurrió al utili- 3 e ff zar la solución compuesta por 1,0% celulasa, 0,2% f f f pectoliasa y 1,0% macerozima, al cabo de 6 y 8 0 horas de digestión, llegando a alcanzar una concen- 2 4 6 8 10 tración de aproximadamente 5,9x106 protoplastos/g Tiempo de digestión (h) PF (Fig. 2). También fue evidente que tiempos ma- 0,5% celulasa, 0,1% pectoliasa y 0,5% macerozima yores y menores de digestión liberaron menor can- 1,0% celulasa, 0,2% pectoliasa y 1,0% macerozima tidad de protoplastos. El uso de una concentración 1,5% celulasa, 0,3% pectoliasa y 1,5% macerozima enzimática mayor (1,5% celulasa, 0,3% pectoliasa y 1,5% macerozima) liberó aproximadamente la Figura 2. Efecto del tiempo de digestión y de la concentra- mitad de protoplastos intactos que la de mayor res- ción enzimática sobre la recuperación de proto- puesta, encontrándose los valores más altos al cabo plastos a partir de callos y cultivos en suspensión de 4-8 horas. La solución enzimática menos con- de naranja dulce (Citrus sinensis Osb) cv. ‘Acos- centrada (0,5% celulasa, 0,1% pectoliasa y 0,5% ta 6’ (diferencias significativas (∝= 0,05) entre macerozima) tuvo una eficiencia muy baja, y no se promedios se indican con letras distintas). observó ninguna diferencia entre los diferentes tiempos de digestión evaluados. En todos los trata- mientos valorados, tiempos de digestión superiores disminución en el rendimiento. En el caso de los a las 10 horas, mostraron en todos los casos rendi- cultivos en suspensión, la concentración enzimática mientos muy bajos en cuanto a la recuperación de mayor (1,5% celulasa, 0,3% pectoliasa y 1,5% ma- protoplastos intactos. cerozima) liberó al cabo de 4 horas de digestión una cantidad considerable de protoplastos, incluso su- En el caso de los cultivos en suspensión del cv. perior a la obtenida para ese mismo tiempo con la ‘Acosta 6’, la mayor eficiencia para la obtención de concentración enzimática intermedia. Sin embar- protoplastos intactos se obtuvo con seis horas de di- go, conforme avanzó el proceso de digestión, los gestión, de nuevo con la concentración enzimática rendimientos disminuyeron abruptamente, situán- intermedia (1,0% celulasa, 0,2% pectoliasa y 1,0% dose rápidamente en los mismos niveles obtenidos macerozima), liberando aproximadamente 1,1x107 al utilizar la concentración enzimática menor (0,5% protoplastos/g PF (Fig. 2). Nuevamente, tiempos celulasa, 0,1% pectoliasa y 0,5% macerozima). Al mayores y menores de digestión produjeron una comparar los dos tipos de material vegetal del cv. protoplastos g-1 (106) protoplastos g-1 (106) 46 REVISTA DE AGRICULTURA TROPICAL ‘Acosta 6’ utilizados para el aislamiento de proto- 6 Callos plastos (callos y cultivos en suspensión), se obtuvo, a a en los tratamientos más eficientes en cada caso, a a aproximadamente dos veces más protoplastos en a4 a los cultivos en suspensión que en los callos. No a a obstante, cabe hacer notar que el ámbito de tiempo para la digestión eficiente de cultivos en suspensión 2 b b fue más restringido (limitándose a un tiempo de 6 b b horas), en comparación con el de los callos, en los b b cuales es posible utilizar, en forma eficiente, perío- b dos de digestión de hasta 8 horas. Cuttivos en suspensión Al evaluar en callos del cv. ‘Washington Na- a a vel’ los mismos tratamientos descritos anteriormen- 4 te, se observó que las concentraciones intermedia y ab mayor de solución enzimática (1,0% celulasa, 0,2% abc abc pectoliasa y 1,0% macerozima y 1,5% celulasa, 2 0,3% pectoliasa y 1,5% macerozima, respectiva- b bc bcd mente) fueron las más eficientes para la recupera- c b c d ción de protoplastos intactos (aproximadamente 4,0 d0 – 4,7x106 protoplastos/g PF), sin que hubiera dife- 2 4 6 8 10 rencias significativas entre ellas en los tiempos de 4 Tiempo de digestión (h) a 10 horas de digestión (Fig. 3). Digestión con esas concentraciones enzimáticas por dos horas produjo 0,5% celulasa, 0,1% pectoliasa y 0,5% macerozima una menor recuperación de protoplastos, con nive- 1,0% celulasa, 0,2% pectoliasa y 1,0% macerozima 1,5% celulasa, 0,3% pectoliasa y 1,5% macerozima les similares a los encontrados al utilizar la menor concentración de solución enzimática. Figura 3. Efecto del tiempo de digestión y de la concentra- ción enzimática sobre la recuperación de protoplas- En relación con la recuperación de protoplas- tos a partir de callos y cultivos en suspensión de na- tos a partir de cultivos en suspensión de este culti- ranja dulce (Citrus sinensis Osb) cv. ‘Washington var, la mejor respuesta se obtuvo, al igual que para Navel’ (diferencias significativas (∝= 0,05) entre el cv. ‘Acosta 6’, con el uso de la combinación de promedios se indican con letras distintas). 1,0% celulasa, 0,2% pectoliasa y 1,0% macerozima (2,3 – 4,3x106 protoplastos/g PF). Pero, a diferen- cia de lo encontrado en ‘Acosta 6’ no se observaron diferencias significativas entre los diferentes tiem- celulares, ‘Acosta 6’ tuvo rendimientos mayores en pos de digestión evaluados (Fig. 3). Las otras dos cuanto a la liberación de protoplastos intactos, uti- concentraciones enzimáticas liberaron cantidades lizando la concentración intermedia de enzimas. menores de protoplastos intactos, apreciándose po- Sin embargo, en el caso de ‘Acosta 6’, la concentra- ca diferencia entre ellas. ción alta liberó mayor cantidad de protoplastos in- tactos en callos de ‘Washington Navel’ que en los En el caso del cv. ‘Washington Navel’, a dife- de ‘Acosta 6’ (Fig. 2 y 3). rencia de lo observado al comparar ambos tipos de material vegetal en el cv. ‘Acosta 6’, los cultivos en Como se puede observar en las Figuras 2 y 3, suspensión liberaron cantidades similares de proto- los tiempos de digestión más efectivos, determina- plastos en los tratamientos más eficientes (Fig. 3). dos por la densidad de protoplastos intactos obteni- Además, tanto en callos como en suspensiones dos, variaron de acuerdo con el genotipo y el tipo protoplastos g-1 (106) protoplastos g-1 (106) JADÁN et al.: AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE CALLOS Y CULTIVOS EN SUSPENSIÓN DE CULTIVARES DE NARANJA DULCE 47 de explante inoculado. Estos tiempos variaron en- No se observaron diferencias de tamaño entre tre cuatro y ocho horas de incubación en la solución las células de callo y de cultivos en suspensión de enzimática de concentración intermedia. ‘Acosta 6’ (Cuadro 2). Sin embargo, las células de cultivos en suspensión de ‘Washington Navel’ resul- taron ser más grandes que las del callo del mismo Características de los callos y los cul- cultivar. En general, las células de este último cul- tivos en suspensión tivar fueron de mayor tamaño que las de ‘Acosta 6’. En vista de las diferencias observadas entre ca- La densidad de células individuales, liberadas llos y cultivos en suspensión, así como entre culti- tras la digestión con pectoliasa de callos y cultivos vares, se decidió evaluar la cantidad de tejido (en en suspensión, fue mayor en los cultivos en suspen- forma de PF y PS) utilizada como unidad de aisla- sión que en los callos de cada genotipo (Cuadro 2). miento de protoplastos (1,0 g y 2 ml para callos y Se observó, además, un mayor número de células suspensiones, respectivamente), para determinar si por unidad de masa de tejido en ‘Acosta 6’ que en los resultados presentados anteriormente están rela- ‘Washington Navel’. cionados con las características del material inocu- lado. Como se observa en el Cuadro 2, la cantidad de tejido utilizada (en PF) para el aislamiento de DISCUSIÓN protoplastos es tres veces mayor en callos que en la alícuota usada para el aislamiento de protoplastos Proceso de digestión de la pared de cultivos en suspensión. Sin embargo, al deter- minar los PS, si bien son mayores en los callos que Las soluciones enzimáticas evaluadas en este en los cultivos en suspensión, esa diferencia se re- trabajo (Cuadro 1) se derivan de la preparación re- duce considerablemente. Se observó además, que comendada para el aislamiento de protoplastos a el PF de los cultivos en suspensión fue ligeramente partir de hojas y cultivos embriogénicos de cítricos mayor en ‘Acosta 6’ que en ‘Washington Navel’. (Grosser y Chandler, 1987; Grosser y Gmitter, Adicionalmente, se puede notar que los PS de los 1990), y están compuestas por dos pectinasas, deri- callos de ambos cultivares fueron muy similares en- vadas de diferentes microorganismos (macerozima tre sí, mientras que los de los cultivos en suspensión R-10 y pectoliasa Y-23), y por una celulasa (celula- de ‘Acosta 6’ son, de nuevo, mayores que los de sa RS). La combinación de enzimas utilizada pro- ‘Washington Navel’ (Cuadro 2). picia que el aislamiento de protoplastos ocurra de Cuadro 2. Peso fresco y seco, así como tamaño y densidad de células en callos y cultivos en suspensión de naranja dulce (Citrus sinensis Osb), cvs. ‘Acosta 6’ y ‘Washington Navel’, a partir de 1 g de callo y 2 ml de cultivo en suspensión. Cultivares ‘Acosta 6’ ‘Washington Navel’ Callos Suspensiones Callos Suspensiones Peso fresco (g) 1,0±0,0 0,3472 ±0,08123 1,0±0,0 0,3273 ±0,0879 Peso seco (g) 0,0887 ±0,00029 0,0796 ±0,00963 0,0879 ±0,00003 0,0747 ±0,00173 Tamaño (µm) 15 15 20 30 Ámbito (µm) 10-20 10-20 15-25 15-45 Densidad (células/g PF) 6,4x106 2,4x107 4,8x106 1,6x107 48 REVISTA DE AGRICULTURA TROPICAL una manera gradual, tal y como se describió ante- trabajo, se observaron variaciones de acuerdo con riormente en el presente trabajo, ocurriendo prime- el genotipo y el tipo de material inoculado (callos o ro una liberación de células individuales, por efec- cultivos en suspensión). En trabajos previos ya se to de las pectinasas, seguida de la degradación habían observado diferencias en los rendimientos subsecuente de las paredes celulares, como conse- en la obtención de protoplastos de acuerdo con el cuencia de la acción de la celulasa (Ishii 1989). genotipo y la condición del callo empleado. Así, Hidaka y Kajiura (1988) encontraron rendimientos que variaron entre 2x106 y 8x106 protoplastos/g de Efecto de la concentración enzimática tejido, al evaluar tres especies de cítricos y un ám- y el tiempo de digestión en relación bito todavía mayor (105-106 protoplastos/g PF de con el genotipo y el tipo de explante callo) fue descrito por Hidaka y Omura (1989) en 11 cultivares, dependiendo de la línea y condición Es probable que concentraciones enzimáticas del callo. Más reciente, Latado et al. (1999) encon- bajas, así como períodos cortos de digestión, causa- traron rendimientos dos veces más altos en la recu- ran una digestión incompleta y poco eficiente de la peración de protoplastos a partir de suspensiones pectina en la lámina media (lamela) y de la celulo- celulares de C. reshni, que de C. limonia, utilizan- sa en la pared celular, lo cual tuvo como consecuen- do el mismo protocolo experimental. Diferencias cia la recuperación de menor cantidad de protoplas- estructurales y en composición de la pared celular tos (Fig. 2 y 3) y la observación de la presencia de se conocen en plantas pertenecientes a grupos taxo- pequeños grupos de células intactas (con pared) tras nómicos muy distintos (ej. monocotiledóneas y di- la digestión (datos no presentados). Resultados si- cotiledóneas) (Ishii 1989). Hasta donde se sabe, di- milares fueron obtenidos por Burger y Hackett ferencias menores, a nivel de especies o cultivares (1982), quienes al evaluar diferentes concentracio- dentro de un mismo grupo taxonómico no han sido nes enzimáticas para la obtención de protoplastos a caracterizadas. Sin embargo, es probable que dife- partir de cotiledones de cítricos, encontraron que rencias estructurales menores en las paredes celula- concentraciones enzimáticas bajas no liberaban res primarias (grosor, composición de las fibrillas, cantidades adecuadas de protoplastos. etc.) entre los cultivares, sea un factor que afecte la digestión de la pared celular y la liberación de los Por otro lado, la baja cantidad de protoplastos protoplastos. Grosser et al. (1988), utilizando la obtenida con concentraciones altas y tiempos pro- misma composición enzimática que dio el mejor re- longados de exposición se puede deber a una sobre- sultado en la presente investigación, lograron el ais- digestión de los protoplastos. Si bien las enzimas lamiento de protoplastos de cultivos embriogénicos utilizadas tienen un alto grado de pureza, son ex- de Severinia disticha (un género emparentado a Ci- tractos crudos, que tienen cierta cantidad de conta- trus) en 2-4 horas, mientras que para cultivos simi- minantes (especialmente problemáticos son los lares de naranja dulce necesitaron 10-14 horas. Es contaminantes enzimáticos, que no se pueden eli- posible que las ligeras divergencias en la composi- minar fácilmente durante la purificación, como es ción y/o estructura de la lámina media o de la pared el caso de nucleasas, proteasas, lipasas y peroxida- celular se vean acentuadas por las condiciones de sas) que pueden dañar la integridad de la membra- cultivo empleadas en cada caso y por el estado fi- na plasmática. Concentraciones altas y tiempos siológico de los cultivos al momento del aislamien- prolongados de exposición a la mezcla enzimática to. Al respecto, Latado et al. (1999) indican que las pueden acentuar ese efecto (Ishii 1989, Grosser suspensiones celulares permiten el aislamiento de 1994). un mayor número de protoplastos que a partir de callos, pero sin aportar evidencia experimental al Al comparar las concentraciones y tiempos de respecto. Las diferencias en los rendimientos de digestión más efectivos para el aislamiento de pro- acuerdo con el tipo de tejido inoculado en la solu- toplastos de los materiales evaluados en el presente ción enzimática en este trabajo (Fig. 2 y 3), pueden JADÁN et al.: AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS A PARTIR DE CALLOS Y CULTIVOS EN SUSPENSIÓN DE CULTIVARES DE NARANJA DULCE 49 estar relacionadas con las condiciones de cultivo a Características de los callos y cultivos las que estuvieron sujetos (cultivo sobre medio só- en suspensión lido o cultivo en suspensión en medio líquido), lo cual podría incidir en las características de la pared Pesos frescos mayores en callos que en culti- celular. vos en suspensión en ambos genotipos no parecen ser un indicativo directo de la cantidad de células Los mayores rendimientos, obtenidos en este que tienen, ya que diferencias muy grandes en peso trabajo con cultivos en suspensión de ‘Acosta 6’ fresco no se reflejan en los correspondientes valo- (1,1x107 protoplastos/g PF), concuerdan en gran res de densidad celular (Cuadro 2). La evidencia medida con los rendimientos descritos en varios parece indicar, entonces, que son las diferencias en trabajos previos (Ling et al. 1989, 1990; Niedz la cantidad de agua en los tejidos, las responsables 1993, Jumin y Nito 1995, 1996a, 1996b; Latado et de las diferencias en peso fresco. al. 1999), los cuales se encuentran alrededor de 1,0 - 2,5x107 protoplastos/g PF, en callos o suspensio- No se conocen trabajos previos en los cuales se nes celulares de un total de 13 genotipos distintos, haya determinado el diámetro de células de cítricos pertenecientes al género Citrus y otros emparenta- (con su pared celular) aisladas con ayuda de pecti- dos. Hay otros trabajos en los cuales se ha informa- nasas. En todos los trabajos conocidos, se determi- do de rendimientos menores (Vardi et al. 1975, Hi- nó esa característica pero para protoplastos aislados daka y Kajiura 1988, Hidaka y Omura 1989, con la intervención de pectinasas y celulasas (di- Kunitake et al. 1991, Jumin y Nito 1996c) con un gestión total de la pared celular) (Hidaka y Kajiura ámbito comprendido entre 105 y 2x106, los cuales 1988, Sim et al. 1988, Ling et al. 1989, Kunitake et coinciden con los rendimientos más bajos, obteni- al. 1991, Jumin y Nito 1995, 1996a, 1996b, 1996c). dos en este trabajo con los callos de ‘Acosta 6’ y En estos trabajos, el ámbito de tamaño va desde los ‘Washington Navel’ (Fig. 2 y 3). 10 a los 70 µm. En algunos de estos trabajos se ob- servaron diferencias en los tamaños de los proto- Vardi y Galun (1988) y Grosser (1994) reco- plastos de acuerdo con el genotipo (Hidaka y Kajiu- miendan, para el aislamiento de protoplastos en cí- ra 1988). tricos, evaluar en forma empírica, antes de trabajar con materiales nuevos, diferentes fuentes y concen- Los resultados de este trabajo evidencian que traciones de enzima, así como tiempos de digestión es posible aislar protoplastos de los materiales eva- (6 a 12 horas). Vardi y Galun (1988) incluso indi- luados utilizando períodos de digestión de 6-8 ho- can que enzimas de una misma marca comercial y ras, lo que hace factible realizar los demás procesos fuente pueden variar de acuerdo con el lote, por lo de fusión y cultivo de los fusionantes en un solo que hay que hacer evaluaciones periódicas o cuan- día. Esto constituye una ventaja en comparación do se adquieran lotes nuevos de producto. con períodos largos de digestión, descritos en mu- chos otros trabajos (Hidaka y Kajiura 1988, Sim et Fue posible aislar mayor cantidad de proto- al. 1988, Ling et al. 1989), en donde es necesario plastos en ‘Acosta 6’ que de ‘Washington Navel’ dejar los protoplastos aislados en refrigeración has- (Fig. 2 y 3). Esto se podría explicar, aparte del ta su posterior fusión y cultivo, lo cual podría afec- efecto de posibles características propias de la lámi- tar su calidad, viabilidad, capacidad de fusión y re- na media o de la pared celular, por la cantidad de generación. Adicionalmente, estos resultados células presente en cada evento de digestión. Ha- apoyan investigaciones previas, que indican la im- bía mayor cantidad de células de ‘Acosta 6’, y de portancia de analizar cada cultivar y tipo de explan- menor tamaño, que de ‘Washington Navel’ en cada te de forma independiente con relación a los reque- evento de digestión (Cuadro 2). rimientos para el aislamiento de protoplastos. 50 REVISTA DE AGRICULTURA TROPICAL Agradecimiento Severinia for use in somatic hybridization experi- ments. Sci. Hort. 31:253-257. Se agradece al Servicio Alemán de Intercam- bio Académico (DAAD), por la beca de posgrado ; GMITTER, JR., F.G. 1990. Protoplast fusion otorgada a la coautora de este artículo. and Citrus improvement. Plant Breeding Rev. 8:339-374. ; ; CHANDLER, J.L. 1988. Intergene- LITERATURA CITADA ric somatic hybrid plants from sexually incompati- ble woody species: Citrus sinensis and Severinia AOYAGI, H.; TAKAYANAGI, T.; JITSUFUCHI, T.; TA- disticha. Theor. Appl. Genet. 75:397-401. NAKA, H. 1999. 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