UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO Portada ESTUDIO DE LA DOSIFICACIÓN Y TOXICIDAD DE LA TERAPIA CON miARNs EN ROEDORES Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Ciencias Biomédicas para optar al grado y título de Maestría Académica en Ciencias Biomédicas con énfasis en Genómica. OSVALDO VEGA MARTÍNEZ Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2020 i        Agradecimientos El autor desea dejar constancia de su agradecimiento a los siguientes organismos y personas por su colaboración en el presente trabajo: A los miembros de la empresa SPERATUM CR SA: PhD. Christian Marín Müller y MSc. Marianne Hütt Cabezas por su valiosa guía y apoyo durante la ejecución del proyecto A los profesores asesores: PhD. Warner Alpízar Alpízar y PhD. Rodrigo Mora Rodríguez por sus aportes y sugerencias durante la ejecución del proyecto Al Centro Nacional de Innovaciones Biotecnológicas (CENIBiot) Al Ministerio de Ciencia y Tecnología (MICIT) ii      “Esta tesis fue aprobada por la Comisión de Programa de Estudios de Posgrado en Ciencias Biomédicas de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar al grado y título de Maestría Académica en Ciencias Biomédicas con énfasis en Genómica” aprobación iii      Tabla de contenidos Portada ..................................................................................................................... i Agradecimientos ...................................................................................................... ii Hoja de aprobación ................................................................................................. iii Tabla de contenidos ................................................................................................ iv Resumen ................................................................................................................. vi Lista de figuras ...................................................................................................... viii Lista de abreviaturas ............................................................................................... ix Licencia de publicación .......................................................................................... xii Introducción ............................................................................................................ 1 Justificación ............................................................................................................ 2 Objetivo general ...................................................................................................... 3 Hipótesis ................................................................................................................. 4 Marco teórico .......................................................................................................... 4 Cáncer ..................................................................................................................4 Cáncer de ovario ..................................................................................................5 miARNs: síntesis y maduración ............................................................................7 miARNs en cáncer ................................................................................................7 Potencial terapéutico de los miARNs ....................................................................8 Hsa-miR-198 en cáncer ...................................................................................... 11 Hsa-miR-198 en cáncer de ovario ...................................................................... 11 La vía MSLN/PBX1/VCP en cáncer de ovario .................................................... 12 Metodología .......................................................................................................... 14 Determinación de la eficacia in vitro del Hsa-miR-198........................................ 14 Cultivo celular ..................................................................................................1 4 Transfección celular ........................................................................................ 14 Síntesis de nanopartículas .............................................................................. 15 iv      Proliferación celular ......................................................................................... 15 Migración celular ............................................................................................. 16 Determinación de la eficacia in vivo del Hsa-miR-198 ........................................ 16 Xenoinjertos subcutáneos ............................................................................... 17 Ensayo de Eficacia .......................................................................................... 17 Corroboración del mecanismo molecular ........................................................ 18 Determinación de la seguridad in vivo del Hsa-miR-198 .................................... 19 Ensayo de seguridad ....................................................................................... 19 Análisis estadísticos ............................................................................................ 20 Resultados ............................................................................................................ 21 Determinación de la eficacia in vitro del Hsa-miR-198........................................ 21 Ensayos de proliferación y migración celular................................................... 21 Determinación de la eficacia in vivo del Hsa-miR-198 ........................................ 22 Ensayo de crecimiento tumoral en modelo xenoinjerto subcutáneos .............. 22 Ensayo de expresión génica en modelo xenoinjertos subcutáneos ................ 22 Determinación de la seguridad in vivo del Hsa-miR-198 .................................... 23 Ensayo de biodistribución ................................................................................ 23 Ensayos de función hepática, renal y pancreática en sujetos experimentales sanos ...............................................................................................................2 3 Discusión .............................................................................................................. 26 Conclusiones......................................................................................................... 31 Bibliografía ............................................................................................................ 32 v      Resumen El cáncer de ovario corresponde al cáncer ginecológico de mayor mortalidad. A pesar de la necesidad de nuevas terapias que permitan hacer frente a esta situación, el progreso en opciones de tratamientos que ha experimentado este tipo de cáncer ha sido escaso. Tecnologías fundamentadas en el uso de ácidos nucleicos se han posicionado como promisorias en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas contra el cáncer. Entre estas estrategias, el uso de miARNs es de gran interés debido a su capacidad de modular simultáneamente la expresión de múltiples genes implicados en diferentes patologías. Desde el año 2006, existen reportes de cambios en los niveles de expresión de Hsa-miR-198 asociados a procesos carcinogénicos y, desde entonces, el número de publicaciones asociadas ha ido aumentando exponencialmente. Hsa-miR-198 ha surgido, principalmente, como un elemento clave en la patogénesis del cáncer de páncreas por su asociación con la regulación de la expresión de MSLN, PBX1 y VCP. En cáncer de ovario, se ha reportado en múltiples ocasiones la sobreexpresión de estás dianas moleculares asociadas con la progresión tumoral; sin embargo, el papel concreto del Hsa-miR- 198 en este tipo de cáncer se desconoce. En este estudio se evaluó el potencial uso de un vector de expresión de Hsa-miR-198 encapsulado en una nanopartícula de LGA-PEI como una alternativa terapéutica contra el cáncer de ovario, tomando como referencia la similitud molecular de este cáncer con el cáncer de páncreas en cuanto al mecanismo de regulación de la expresión de MSLN, PBX1 y VCP mediando por Hsa-miR-198. Los resultados obtenidos indican que Hsa-miR-198 actúa como un supresor tumoral en el cáncer de ovario. Las propiedades tumorigénicas que son reducidas significativamente en respuesta a la sobreexpresión de Hsa-miR-198 corresponden a proliferación y migración celular, así como crecimiento tumoral y generación de nódulos metastáticos en un modelo murino de xenoinjerto subcutáneo. Estos resultados, en conjunto con la disminución concomitante de la expresión de MSLN, PBX1 y VCP, muestran un mecanismo de regulación de la actividad proliferativa y migratoria en cáncer de ovario similar al reportado en cáncer de páncreas. Por otra parte, los estudios de bioseguridad vi      realizados permitieron descartar, desde una perspectiva bioquímica, la ausencia de daño hepático o renal como consecuencia del tratamiento con Hsa-miR-198. Sin embargo, es necesaria una evaluación más exhaustiva que permita tener una determinación preclínica más robusta del potencial uso terapéutico del Hsa-miR- 198. En conclusión, los resultados obtenidos muestran que el uso de un vector de expresión de Hsa-miR-198 encapsulado en una nanopartícula de LGA-PEI como potencial terapia contra cáncer de ovario es factible en términos de eficacia y seguro en un primer nivel de evaluación en un modelo murino. vii      Lista de figuras Figura 1. Efecto de M198 en la proliferación y migración de líneas celulares de cáncer de ovario .................................................................................................... 21 Figura 2. Efecto de M198 en el crecimiento y migración tumoral en modelo xenoinjerto subcutáneo ......................................................................................... 23 Figura 3. Efecto de M198 sobre la expresión de genes diana en modelo xenoinjertos subcutáneos .......................................................................................................... 24 Figura 4. Biodistribución de M198 en hígado, riñón y baso de ratones CD-1 sanos .............................................................................................................................. 25 Figura 5. Química sanguínea relativa a la función hepática de sujetos experimentales tratados con M198 ....................................................................... 25 Figura 6. Química sanguínea relativa a la función renal de sujetos experimentales tratados con M198 ................................................................................................ 26 viii      Lista de abreviaturas ADC: Conjugado anticuerpo-droga. ADNc: ADN copia. AGO: Proteína argonauta. ALKP: Fosfatasa alcalina plasmática. ALT: Alanina transaminasa plasmática. ARNm: ARN mensajero. BUN: Nitrógeno ureico en sangre. CDS: Región codificante. CREA: Creatinina. CTRL: Vector de expresión control encapsulado en nanopartícula de LGA-PEI. CXCL: Quimiocina. DGCR8: Subunidad del complejo microprocesador. DICER: Endoribonucleasa. DROSHA: Ribonucleasa III. FSTL1: Proteína 1 similar a la Folistatina. GAPDH: Gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa. GW182: Proteína involucrada en el silenciamiento génico mediado por AGO- miARN. HGSOC: Cáncer de ovario seroso de alto grado. HCC: Carcinoma hepatocelular. JAK: Quinasas de tirosinas asociadas a receptores de citoquinas. ix      KSRP: Proteína de unión a ARN implicada en la biogénesis de miARNs. LGA-PEI: Polímero resultante de la reacción entre el ácido poli(láctico-co-glicólico) y polietilenimina. M198: Vector de expresión de Hsa-miR-198 encapsulado en nanopartícula de LGA-PEI. M198-A: Vector de expresión de Hsa-miR-198 encapsulado en nanopartícula de LGA-PEI en dosis de 2.4 mg/kg M198-B: Vector de expresión de Hsa-miR-198 encapsulado en nanopartícula de LGA-PEI en dosis de 1.0 mg/kg miRISC: Complejo de silenciamiento inducido por miARN. MPM: Mesotelioma maligno pleural. MSLN: Proteína Mesotelina, normalmente presente en el revestimiento de las células mesoteliales MUC16: Glucoproteína expresada principalmente en mesotelios. NFκβ: Complejo proteico involucrado en la transcripción del ADN NOTCH: Sistema de señalización celular altamente conservado en la mayoría de los organismos multicelulares OCT2: Factor de transcripción perteneciente a la familia POU OVCAR3: Línea celular derivada de ascitis maligna de paciente con adenocarcinoma progresivo de ovario. PBX1: Proteína nuclear perteneciente a los factores transcripcionales de la familia Homeobox PBX. PDAC: Adenocarcinoma pancreático ductal PEI: Polietilenimina PLGA: Ácido poli(láctico-co-glicólico) x      Pre-miR: ARN precursor de miARN Pri-miR: ARN primario que da origen al ARN precursor de miARN Ran-GTP: Proteína G monomérica implicada en el transporte de péptidos y proteínas a través de la membrana nuclear. RT-qPCR: Método de cuantificación de expresión génica. SKOV3: Línea celular de adenocarcinoma ovárico de paciente caucásico. STAT: Factor de transcripción intracelular. TBIL: Bilirrubina sérica total. TGFβ1: Factor de crecimiento transformante. THF: Tetrahidrofurano. U6: ARN pequeño nuclear no codificante. UTR: Región no traducible. VCP: ATPasa transicional del retículo endoplásmico. XPO-V: Proteína implicada en el transporte de miARNs del núcleo al citoplasma. xi      Licencia de publicación xii  1    Introducción El cáncer de ovario es el cáncer ginecológico de mayor mortalidad y la sexta causa de muerte asociada a cáncer en mujeres1,2. El tratamiento estándar en pacientes con cáncer de ovario corresponde a agentes derivados del platino debido a su eficacia en un amplio espectro de casos3,4. Sin embargo, la probabilidad de recidiva es muy alta y en la mayoría de los casos esta reincidencia está asociada con resistencia al tratamiento5. A pesar de la necesidad de nuevas terapias alternativas que permitan hacer frente a esta situación, el nivel de avance en la búsqueda de opciones novedosas para el tratamiento de este tipo de cáncer en los últimos 30 años ha sido poco6. Los resultados de análisis genómicos llevados a cabo los últimos años han sido fundamentales para el esclarecimiento de muchos aspectos de la biología del cáncer y el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Lo anterior ha permitido replantear la forma de visualizar el cáncer, pasando progresivamente de la idea de la alteración de unos cuantos genes7,8 a un escenario en donde existe una enorme complejidad genómica9. Esto ha revolucionado el abordaje terapéutico, el cual incluye cada vez más las estrategias fundamentadas en el uso de ácidos nucleicos10–13 entre ellos los miARNs14. Estos corresponden a ARNs pequeños no codificantes con capacidad de regular la expresión de múltiples genes a las vez, funcionando como reguladores de dosificación proteica en los diversos procesos celulares15. Actualmente se han identificado más de 2500 miARNs16 y desde su descubrimiento se ha agregado otro nivel de regulación génica, la cual es susceptible a alteraciones en la expresión de estos y en consecuencia han sido involucrados en múltiples enfermedades humanas17–19, incluyendo el cáncer20. Es así como el estudio de la regulación mediada por miARNs ha arrojado resultados promisorios en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas contra el cáncer21.   2    Dos miARNs en particular han surgido como potenciales agentes terapéuticos contra el cáncer: Hsa-miR-34a22,23 y Hsa-miR-19824. Este último ha demostrado ser un supresor tumoral en varios tipos de cáncer25–38, y un elemento clave en la patogénesis del PDAC. En este caso, la sobreexpresión de MSLN conlleva a la disminución de la expresión del Hsa-miR-198, lo cual es mediado por OCT-2 que a su vez es inducido por NF-κβ; lo anterior conduce a la sobreexpresión de PBX-1 y VCP, favoreciendo esto mecanismos de proliferación celular, metástasis y resistencia a agentes quimioterapéuticos. Además, la restauración de la expresión de Hsa-miR-198 en ensayos in vitro e in vivo da lugar a la reducción de estos mecanismos a través de la regulación directa de MSLN, PBX-1 y VCP39. En cáncer de ovario, se ha observado expresión sustancialmente elevada de MSLN, PBX-1 y VCP asociada con mecanismos de proliferación celular, metástasis y resistencia a agentes quimioterapéuticos40–43. Además, se ha observado que la expresión de Hsa-miR-198 en tejido tumoral es mucho menor que en tejido sano adyacente44. Sin embargo, ningún informe ha descrito relación entre Hsa-miR-198 y el cáncer de ovario en términos de la regulación del eje MSLN/PBX1/VCP. Por tanto, en este estudio se evaluó el uso potencial del Hsa-miR-198 como una alternativa terapéutica contra el cáncer de ovario, tomando como referencia su similitud molecular con el PDAC en cuanto al mecanismo de regulación de la expresión de MSLN, PBX1 y VCP mediando por Hsa-miR-198. Justificación El tratamiento estándar en pacientes con cáncer de ovario presenta una alta eficacia en un amplio espectro de casos3,4. Sin embargo, la probabilidad de recidiva es muy alta y en la mayoría de los casos en los cuales se presenta resistencia al tratamiento5. A pesar de la necesidad de nuevas terapias alternativas que permitan hacer frente a esta situación, el progreso en opciones de tratamientos que ha experimentado este tipo de cáncer en los últimos 30 años ha sido escaso6. El uso   3    de ácidos nucleicos como una opción terapéutica para el tratamiento del cáncer se ha posicionado como una estrategia promisoria. En caso particular de los miARNs, se ha observado expresión alterada en prácticamente todos los tumores sólidos y neoplasias malignas hematológicas20,45,46, asociándose con procesos que toman lugar durante la iniciación, promoción y progresión tumoral47. El Hsa-miR-198 ha surgido como supresor tumoral en varios tipos de cáncer25–38 y como un elemento clave en la patogénesis del cáncer de páncreas; donde se ha asociado con tres dianas moleculares en particular: MSLN, PBX1 y VCP39. En cáncer de ovario, se ha reportado perfiles de expresión génica similares a los determinados en cáncer de páncreas respecto a estas tres dianas48–50. Sin embargo, la evidencia respecto a la participación del Hsa-miR-198 en este tipo de cáncer es muy escasa51. Objetivo general Determinar el potencial del Hsa-miR-198 como agente terapéutico contra el cáncer de ovario mediante estudios de eficacia y seguridad, con el fin de generar una potencial alternativa de tratamiento ante el escaso progreso en opciones de terapias contra este tipo de cáncer. Objetivos específicos 1- Determinar la eficacia in vitro del Hsa-miR-198 mediante estudios funcionales en líneas celulares de cáncer de ovario. 2- Determinar la eficacia in vivo del Hsa-miR-198 mediante el uso de un modelo murino de xenoinjerto subcutáneo implantando una línea celular humana de cáncer de ovario. 3- Establecer la seguridad de Hsa-miR-198 mediante la evaluación de parámetros clínicos de ratones dosificados en forma subcrónica.   4    Hipótesis El Hsa-miR-198 representa un potencial agente terapéutico contra el cáncer de ovario debido a la similitud molecular de este tipo de cáncer con el PDAC, propiamente en cuanto al mecanismo de regulación de la expresión de MSLN, PBX- 1 y VCP mediando por Hsa-miR-198, el cual ha sido asociado con mecanismos de proliferación celular, metástasis y resistencia a agentes quimioterapéuticos. Marco teórico Cáncer El cáncer comprende un grupo de enfermedades que involucran diversos mecanismos etiológicos, pero que comparten ciertas propiedades biológicas52. Dichas propiedades son adquiridas por mutaciones genéticas y alteraciones epigenéticas en genes de susceptibilidad53,54. Estos genes se clasifican de manera general en dos grupos: gatekeepers y caretakers 55,56. Los gatekeepers regulan directamente las vías de crecimiento y diferenciación celular y comprenden oncogenes y genes supresores de tumores. Los caretakers, por su parte, promueven la iniciación tumoral indirectamente. Estos están involucrados en los mecanismos de mantenimiento de la integridad genómica de la célula. De manera que, mutaciones en estos genes puede conducir a la inestabilidad genética52,57. La alteración de un gen, sin embargo, no es suficiente para dar lugar al cáncer. La iniciación, promoción y progresión tumoral requiere de múltiples mutaciones genéticas y/o alteraciones epigenéticas53,55,58. Los tumores son estructuras complejas compuestas de múltiples tipos de células distintas que participan en interacciones heterotípicas entre sí. Durante la última década, esta noción se ha solidificado y ampliado, revelando que la biología del cáncer no se puede entender simplemente enumerando los rasgos de las células   5    cancerosas, sino que debe abarcar las contribuciones del microambiente tumoral59. Se han propuesto características propias del cáncer, que en conjunto constituyen la base que permite comprender la diversidad de estas enfermedades neoplásicas. Estas características corresponden a: 1) señalización de proliferación continua, 2) evasión de la supresión tumoral, 3) activación de la invasión y metástasis, 4) activación de la inmortalidad replicativa, 5) inducción de angiogénesis, 6) resistencia a la muerte celular, 7) evasión del sistema inmune, 8) promoción de la inflamación tumoral, 9) inestabilidad genómica y 10) desregulación del metabolismo celular52,60. El cáncer es una causa importante de morbilidad y mortalidad, con aproximadamente 14 millones de nuevos casos y 8 millones de muertes para el año 2012. En hombres, los cinco sitios más comunes de cáncer diagnosticados en 2012 fueron pulmón (16.7% del total), próstata (15.0%), colon (10.0%), estómago (8.5%) e hígado (7.5%). De estos, los tres tipos cáncer de mayor mortalidad corresponden a pulmón (23.6%), hígado (11.2%) y estómago (10.1%). En mujeres, los cinco sitios más comunes de cáncer diagnosticados en 2012 fueron mama (25.2%), colon (9.2%), pulmón (8.7%), cuello uterino (7.9%) y estómago (4.8%). De estos, los dos tipos cáncer de mayor mortalidad corresponden a mama (14.7%), pulmón (13.8%)61 Cáncer de ovario A nivel global, se estima que más de 225.000 mujeres son diagnosticadas con cáncer de ovario por año62, la mayoría en estadios avanzados debido a la escasa sintomatología de esta enfermedad2. Es por esto que el cáncer de ovario corresponde al cáncer ginecológico de mayor mortalidad a nivel mundial, con una sobrevida a 5 años <50% y ~140.000 muertes por año62,63. El estándar de atención en pacientes con cáncer de ovario consiste en la eliminación quirúrgica de la masa tumoral, en combinación con tratamiento adyuvante con Paclitaxel y Carboplatino64 y, desde 2011, el uso de Bevacizumab en pacientes con pronóstico reservado65. A pesar de las favorables tasas de respuesta inicial a estos tratamientos, la probabilidad de recidiva sigue siendo muy alta, con poca o nula respuesta a otros   6    agentes5 y, consecuentemente, la tasa de supervivencia a 5 años en estos casos decae a <28%66. Entre los principales factores de riesgo para el cáncer de ovario se encuentran la menarquia en edad temprana67 y la menopausia en edad tardía68. Por otra parte, la nuliparidad y la baja paridad se han asociado con aumento en el riesgo de cáncer de ovario. De hecho, en mujeres multíparas el riesgo de cáncer de ovario se reduce en un 50%69. La lactancia materna, la ligadura de trompas, la salpingectonía y el uso de anticonceptivos han sido asociados con un riesgo reducido de cáncer de ovario70–73. Mientras que, la ingesta de carnes y grasa y el uso de la terapia de reemplazo hormonal en la menopausia se han relacionado con un mayor riesgo de cáncer de ovario74,75. El cáncer de ovario puede tener origen no epitelial y epitelial. El cáncer de ovario de origen no epitelial representa aproximadamente el 10% de todos los casos diagnosticados y su origen puede ser de células germinales o células estromales76. En el caso del cáncer de ovario de origen epitelial, existen seis subtipos histológicos principales: seroso, endometrioide, de células claras, mucinoso, de células transicionales y escamoso77. Aproximadamente el 70% de los canceres epiteliales corresponden al subtipo seroso78 y de estos, el ~90% corresponden al subtipo de alto grado (HGSOC)79. El HGSOC corresponde al subtipo más agresivo de cáncer de ovario de origen epitelial y es responsable de dos tercios de todas las muertes reportadas por cáncer de ovario80,81. A pesar de que el HGSOC responde favorablemente a los regímenes de quimioterapia estándar, un pequeño subgrupo (<10%) es refractario al tratamiento de primera línea82, e incluso en pacientes en que se ha dado la remisión clínica la probabilidad de recidiva es alta77. Las líneas celulares derivadas de tumores son los modelos más utilizados en la investigación del cáncer83,84. Estás representan una herramienta fundamental en la ciencia traslacional, pues permiten estudios de biología celular más allá de lo que se puede lograr razonablemente en ensayos clínicos o modelos animales85. Dos de las líneas celulares más utilizadas como modelos de cáncer de ovario y específicamente para el subtipo HGSOC corresponden SKOV3 y OVCAR386   7    miARNs: síntesis y maduración Los miARNs son moléculas endógenas, de banda simple, no codificantes, de 19-24 nucleótidos de extensión, que regulan la expresión génica a nivel postranscripcional mediante la formación de complejos ribonucleoproteicos87. Los miARNs surgen de secuencias largas de ARN no codificantes denominadas Pri- miRs; las cuales, dependiendo de su organización genómica, pueden ser transcritas por la ARN polimerasa II o surgir a partir de secuencias intrónicas o intergénicas procesadas88. Los Pri-miRs pueden dar origen tanto a un solo miARN como a un grupo de ellos88,89. Posterior a su transcripción, la estructura secundaria del Pri-miR es reconocida y procesada por el complejo microprocesador DROSHA/DGCR8, dando origen a una secuencia precursora de miARN denominada Pre-miR90, la cual es exportada al citoplasma a través del complejo proteico XPO5/Ran-GTP91,92. En el citoplasma, el Pre-miR es procesado por la proteína DICER, produciendo un miARN maduro doble banda93. Finalmente, el miARN doble banda se asocia con una de las cuatro proteínas AGO y con la proteína GW182, formando el complejo ribonucleoproteico denominado miRISC94. La unión miARN-AGO media la selección de una de las dos hebras del miARN95, la cual regula la síntesis de proteínas a través de represión de la traducción o degradación del ARNm por apareamiento de bases a secuencias parcialmente complementarias en las regiones 3'UTR de los ARNm diana96. No obstante, existe también regulación mediante la unión a regiones 5'UTR, promotores o secuencias codificantes 97–99. miARNs en cáncer Muchos miARNs han sido muy conservados, desde las plantas hasta los humanos, mientras que otros son linaje o tejido específicos100. Actualmente se han identificado más de 2500 miARNs distintos en humanos16 y se estima que regulan más del 60% de los genes codificantes101. Los miARNs funcionan como “reguladores maestros” en procesos biológicos claves, siendo una de sus características más notables su capacidad para modular simultáneamente la   8    expresión de varios, incluso cientos, de genes implicados en múltiples vías celulares96. Por lo tanto, estas moléculas poseen un papel fundamental tanto en procesos fisiológicos normales102–105 como fisiopatológicos17–19. Algunos de los componentes principales implicados en la biogénesis de miARN se encuentran desregulados durante el cáncer. Por ejemplo, i) en cáncer de piel los niveles de expresión de DGCR8 y AGO2 se han reportado significativamente más altos106, ii) en cáncer de ovario el silenciamiento de DGCR8 inhibe la proliferación y migración celular107, iii) en diversos tipos de cáncer se ha observado sobreexpresión de DICER108,109 y DOSHA110 y iv) durante el desarrollo del cáncer se ha reportado niveles de expresión de XPO5 elevados111. Además, se ha descrito que las proteínas BRCA1 y p53 pueden acelerar el procesamiento de pri-miRs a través de la regulación de DROSHA, SMAD3 y p68112,113. La primera evidencia de que los miARNs estaban relacionados con el cáncer surgió en 2002, cuando se identificó la ubicación del miR-15 y del miR-16 en una región frecuentemente eliminada en leucemia linfocítica crónica114. Desde entonces, la expresión alterada de miARNs en tejido normal se ha descrito prácticamente en todos los tumores sólidos y neoplasias malignas hematológicas20,45,46, donde han sido asociados con la iniciación, promoción y progresión tumoral47. De hecho, casi el 50% de los genes que codifican miARN se encuentran en sitios frágiles o áreas del genoma que están asociadas con el cáncer115. En este sentido, el estudio de los miARNs en el funcionamiento normal o patológico de las células, órganos o tejidos ha generado hallazgos que los posiciona como moléculas promisorias en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas contra el cáncer21. Potencial terapéutico de los miARNs Actualmente, existe mucha información que vincula de forma robusta la expresión aberrante de los miARNs con en el inicio, promoción y progresión del   9    cáncer116. No obstante, aún son pocos los estudios clave donde se evalúan los roles biológicos-moleculares, ya sean oncogénicos o como supresores de tumores, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas117. En este sentido, la administración de miRNAs supresores de tumores ha tenido éxito en varios modelos murinos, donde se ha comenzado con el uso de vectores de expresión y se ha progresado a la entrega intratumoral o sistémica de moléculas basadas en miRNAs118 Existen varios casos en los que se ha utilizado un enfoque de restitución de la expresión de miARNs con función supresora de tumores. La pérdida genómica del miARN let-7 y la disminución de su expresión, son dos eventos que se han asociado con múltiples tipos de cáncer119. Por tanto, la restauración de la expresión de let-7 ha demostrado potencial terapéutico en cánceres con pérdida o reducción de su expresión. De hecho, en un modelo murino inducible de cáncer de pulmón no microcítico, la administración de let-7 se asoció con reducción del crecimiento tumoral hasta en un 66%120. De igual forma, en modelos xenoinjerto, el crecimiento tumoral se reduce significativamente como consecuencia de la restitución de la expresión de let-7 mediante administración intratumoral o sistémica121,122. En aproximadamente el 25% de los cánceres humanos se presentan mutaciones en los genes RAS123. La expresión constitutiva de KRAS media la activación de RREB1, que a su vez inhibe directamente la transcripción del clúster miR-143/miR-145. Interesantemente, como mecanismo de retrocontrol, miR-143 y miR-145 regulan la expresión de RREB1 y KRAS, respectivamente124. En modelos xenoinjerto ortotópicos, la expresión forzada de miR-143 y miR-145 mediante administración sistémica regula negativamente la expresión de KRAS y RREB1, lo cual se asocia con un reducción significativa del crecimiento tumoral125. El nivel de expresión del miR-26 ha sido descrito como un elemento clave en la patogenia del carcinoma hepatocelular (HCC)126. En un modelo murino de HCC, la administración sistémica de un vector de expresión de miR-26a conduce a la inhibición de la progresión de la enfermedad a través de la regulación de la proliferación celular y de la inducción de apoptosis127.   10    Los miRNAs de la vía de p53 también se han evaluado como potenciales agentes terapéuticos. La expresión de p53 media la expresión de miR-34, el cual está involucrado en la regulación del ciclo celular y de la migración celular. Por tanto, varios laboratorios han examinado el potencial terapéutico miR-34 en varios tipos de cáncer128. En este sentido, en un modelo murino inducible de cáncer de pulmón no microcítico, el uso de un mímico de miR-34 administrado por vía intratumoral o sistémica, reduce significativamente el crecimiento tumoral122. Por otra parte, se ha descrito que la restitución de la expresión de miR-34 mediante administración sistémica de un mímico, reduce significativamente el crecimiento tumoral y la metástasis en modelos xenoinjertos y tumores primarios de cáncer de próstata129. Asimismo, la administración sistémica de un mímico de miR-34 en un modelo xenoinjerto subcutáneo y ortotópico de cáncer de páncreas, redujo el crecimiento tumoral mediante la supresión de la proliferación y la inducción de apoptosis125. En estudio, se observó que los niveles de expresión de miR-16 se encontraban significativamente disminuidos en muestras tumorales de pacientes con mesotelioma maligno pleural (MPM)130. Posteriormente, se demostró que la restitución de la expresión de miR-16, mediante administración sistémica de un mímico, reduce significativamente el crecimiento tumoral y la metástasis en modelos xenoinjertos MPM, sugiriendo el entonces la utilidad del miR-16 como potencial tratamiento de pacientes con MPM131 A pesar de ser varias las estrategias que se han evaluado en modelos murinos, muy pocas han logrado llegar a su evaluación en ensayos con humanos. Hasta la fecha, únicamente dos mímicos de miARN han sido evaluados como posibles herramientas terapéuticas contra el cáncer en humanos. El MRX34 (mímico de miR-34) corresponde al primer fármaco contra el cáncer fundamentado en el uso de un mímico de miARN que logró alcanzar su estudio clínico en humanos (NCT01829971). Más recientemente, un segundo fármaco denominado TargomiR (mímico de miR-16) logró llegas a fase clínica en humanos como terapia contra el cáncer (NCT02369198).   11    Hsa-miR-198 en cáncer El Hsa-miR-198 corresponde a un miARN específico de primates, localizado en el exón 11 del gen FSTL1 y cuya expresión está dada de forma “See-Saw”132; es decir, el mismo transcrito puede funcionar como Pri-miR o como ARNm133. Bajo determinadas condiciones, los motivos GUG presentes en el extremo 3’UTR del ARNm del gen FSTL1 pueden ser reconocidos por la proteína KSRP134, favoreciendo el procesamiento del transcrito en su forma Pri-miR-198. Bajo condiciones opuestas, la represión de KSRP mediada por TGF-β1 promueve el procesamiento del transcrito en favor del ARNm de la FSTL1132. Desde el año 2006, existen reportes de cambios en los niveles de expresión de Hsa-miR-198 asociados a procesos carcinogénicos135 y desde entonces el número de publicaciones sobre el papel que juega este miARN en cáncer ha ido aumentando exponencialmente. Se ha reportado expresión alterada de miR-198 en cáncer de hígado31,136–138, pulmón35,139,140, páncreas141–143, vías biliares144,145, colon146,147, retina148, esófago149, estómago29, cerebro27,150, lengua151, hueso38,152, mama30,153,154, médula osea155, próstata156–158 riñon37 y ovario44,159–161. En este último caso, mediante diferentes estrategias de determinación de expresión génica (e.g. microarreglos, RT-qPCR) se ha identificado alteración de diversos miARNs, que a su vez han sido asociados con la progresión tumoral, clasificación, estadio FIGO, pronóstico y resistencia a quimioterapia162,163. Hsa-miR-198 en cáncer de ovario En el caso específico del Hsa-miR-198, a la fecha únicamente se ha reportado relación entre sus niveles de expresión y la sensibilidad a agentes quimioterapéuticos160, así como expresión ligeramente aumentada en tumores recurrentes en comparación con tumores primarios159. Sin embargo, es necesario llevar a cabo más investigación para esclarecer la relevancia clínica del Hsa-miR- 198 en cáncer de ovario51.   12    La vía MSLN/PBX1/VCP en cáncer de ovario MSLN es una glucoproteína que se encuentra unida a la membrana plasmática por medio de glicosilfosfatidilinositol, la cual es altamente expresada en mesotelioma, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, adenocarcinoma de pulmón, cáncer endometrial, cáncer biliar, cáncer gástrico y leucemia mieloide aguda pediátrica164. En pacientes con cáncer de ovario específicamente, se ha reportado sobreexpresión de MSLN en ~70% de los casos48,165, de los cuales >75% corresponden a HGSOC166 y su expresión correlaciona de manera inversa con la sobrevida libre de progresión167. En el contexto neoplásico, la MSLN se une al antígeno de cáncer ovárico MUC16168. Estas dos proteínas son frecuentemente co- expresadas y se ha demostrado que la unión entre MSLN y MUC16 favorece la adhesión célula-célula, lo cual facilita a su vez la adhesión de las células cancerosas a la superficie serosa de la pleura y el peritoneo, contribuyendo con la diseminación metastásica169. Contrario a su alta expresión en cáncer de ovario, la expresión de la mesotelina en tejidos humanos no neoplásicos se limita a las células mesoteliales que recubren la pleura, el peritoneo y el pericardio, convirtiéndola en un blanco terapéutico atractivo170. De hecho, actualmente se están estudiando varios agentes terapéuticos que tienen por blanco la mesotelina entre los cuales se encuentran: inmunotoxinas171, anticuerpos quiméricos172, vacunas173, ADCs174 y Células-T modificadas175. PBX1 es un factor de transcripción que juega un papel clave en el desarrollo de tejidos ya que contribuye con el recambio de las células madre hematopoyéticas176 y en el desarrollo del páncreas, bazo, tracto urogenital y huesos177–180. También se ha reportado que esta es una potente oncoproteína en leucemia, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de páncreas y cáncer de ovario39,42,181–183. En este último, PBX1 actúa como un efector de las vías de señalización de NOTCH3, JAK2/STAT3 y CXCL3/CXCL5, promoviendo el desarrollo tumoral mediante la remodelación del microambiente y generando la resistencia a agentes derivados de platino mediante la regulación de   13    transportadores de fármacos42,184,185. Además, PBX1 se considera como un marcador de recurrencia post-quimioterapia en HGSOC, y su regulación negativa restaura la quimiosensibilidad de las células resistentes a agentes derivados de platino185–187. VCP, también conocida como p97, pertenece a la familia AAA188. VCP es una de las proteínas más abundantes en las células eucariotas y puede interactuar con más de 30 proteínas celulares con diversas funciones, incluyendo la alteración morfológica de membranas, regulación transcripcional, autofagia, división celular, muerte celular programada y degradación proteica dependiente de ubiquitina/proteosoma189–193. Estudios clínicos han encontrado una correlación entre la sobreexpresión de VCP y la progresión, el pronóstico y el potencial metastásico del cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de páncreas y cáncer de ovario39,50,194–196. En este último caso, VCP se encuentra entre las moléculas esenciales de 25 líneas celulares de cáncer50, y un elemento fundamental en HGSOC para el mecanismo de resistencia a derivados de platino196. Al ser crucial para la supervivencia de las células de cáncer, VCP representa un blanco de terapia promisorio43. De hecho, varios grupos han desarrollado recientemente inhibidores específicos contra VCP197,198, que incluso han llegado a ensayos clínicos de fase 1 (NCT02243917 y NCT02223598). A pesar de las alteraciones claramente existentes en la expresión de MSLN, PBX1 y VCP en cáncer de ovario, estas no han sido aún estudiadas en conjunto, ni su relación con la expresión de Hsa-miR-198. En PDAC se la dilucidado un bucle regulación recíproco entre MSLN y Hsa-miR-198. Hsa-miR-198 regula a través múltiples sitios en la región codificante de MSLN con un efecto aditivo que conduce a un bloqueo casi completo de la expresión de la proteína. Por otra parte, la sobreexpresión de MSLN conduce a la activación de NF-kB y esta, a la inducción de la expresión de OCT2, lo cual media la represión de Hsa-miR-198. Está desregulación conlleva a sobreexpresión de PBX1 y VCP que a su vez alimenta la vía de represión de Hsa-miR-198 a través de NF-kB/OCT224 (anexo 7).   14    Metodología Determinación de la eficacia in vitro del Hsa-miR-198 Cultivo celular Se trabajó con dos líneas celulares de cáncer de ovario humano: OVCAR3 (ATCC® HTB-161™) y SKOV3 (ATCC® HTB-77™), las cuales fueron seleccionadas con particular interés por su capacidad de respuesta a estrógenos199,200. La línea celular OVCAR3 se mantuvo en medio RPMI 1640 (Cat. 11875119, Thermo Fisher Scientific) suplementado con suero fetal bovino al 20% (Cat. F0392, Sigma-Aldrich) y 0,01 mg/mL de insulina bovina (Cat. I0516-5ML, Sigma-Aldrich); en una atmosfera de CO2 al 5% a 37ºC. La línea celular SKOV3 se mantuvo en medio McCoy 5A (Cat. 16600082, Thermo Fisher Scientific) suplementado con suero fetal bovino al 10% (Cat. F0392, Sigma-Aldrich); en una atmosfera de CO2 al 5% a 37ºC. Transfección celular Se utilizó un plásmido de expresión de Hsa-miR-198 (Cat. PMIRH198PA-1, SBI) y un plásmido scrambled como control negativo (Cat. PMIRHXXXPA-1, SBI) para la transfección transitoria de las líneas celulares OVCAR3 y SKOV3. En placas de 6 pozos, se sembraron 1×106 células por pozo en medio OptiMEM (Cat. 31985070, Gibco) y se transfectaron con 2µg/pozo del plásmido scrambled (denominado en adelante como “CTRL”) o el plásmido de expresión de Hsa-miR- 198 (denominado en adelante como “M198”). Para llevar a cabo la transfección, se utilizó una nanopartícula de LGA-PEI, según se ha descrito previamente201. Las células se colectaron a las 24 horas post-transfección para ser utilizadas en los ensayos de proliferación y migración.   15    Síntesis de nanopartículas Preparación del copolímero de LGA-PEI El copolímero LGA-PEI se preparó mezclando directamente PLGA (Cat. 23986-5, Polysciences Inc.) y B-PEI (Cat. 23966, Polysciences Inc.) en un solvente orgánico. Se disolvieron 250 mg de B-PEI y 120 mg de PLGA en 10 mL de THF cada uno. Posteriormente, se mezclaron ambas disoluciones y la disolución resultante se agitó moderadamente a temperatura ambiente durante 48 horas. El precipitado formado se separó de la solución y se lavó dos veces con THF. El sólido obtenido se secó al vacío a temperatura ambiente. Encapsulamiento del ácido nucleico El encapsulamiento se llevó a cabo mezclando directamente el copolímero de LGA-PEI con el plásmido respectivo en una solución acuosa. Se disolvieron 5 μg de copolímero y 2 μg de plásmido en 50 µl de H2O a 37°C cada uno. Posteriormente, se mezclaron ambas disoluciones y la disolución resultante se agitó 10s a 3000 rpm utilizando un agitador tipo vórtex. Finalmente, la solución se incubó a temperatura ambiente durante 30 min y se agregó al pozo que contenía las células según correspondía. Proliferación celular En placas de 96 pozos, se sembraron quintuplicados de 5x103 células por pozo en el medio de cultivo correspondiente, pero con una reducción del 50% de suero fetal bovino. Se determinó la densidad celular al inicio del experimento (0 horas) y a las 48 horas después de realizada la transfección celular, mediante el   16    uso del kit Titer 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation MTS Assay (Cat. G3580, PROMEGA) y siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. Para la realización de las lecturas se utilizó un lector de microplacas BioTek Synergy™ H1. Migración celular Se utilizaron soportes con membranas de policarbonato con un diámetro de poro de 8 µm, adaptables a placas de 24 pozos (Cat. CLS3422, Corning). En la cámara superior de los soportes se sembraron triplicados de 1.5x105 células por pozo en un volumen de 100 µL de medio de cultivo libre de suero. En la cámara inferior se agregaron 600 µL del medio de cultivo completo, como quimioatrayente. Se incubó la placa por un periodo de 48 horas en una atmosfera de CO2 al 5% a 37ºC. Posteriormente, las membranas se tiñeron utilizando una solución de calceína al 0,1% (Cat. 206700, Sigma-Aldrich) durante 1.5 horas y se fijaron las células utilizando una solución de paraformaldehído al 4% durante 10 minutos. La densidad celular se determinó mediante fluorescencia utilizando un lector de microplacas BioTek Synergy ™ H1 a una longitud de onda de excitación de 490 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm. Se realizó una primera lectura del total de células en la membrana del soporte y una segunda lectura después de retirar suavemente con un hisopo las células no adheridas a la membrana. El porcentaje de migración se definió como la relación entre la segunda y la primera lectura. Determinación de la eficacia in vivo del Hsa-miR-198 Todos los procedimientos realizados en animales se llevaron a cabo bajo las directrices aprobadas por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio de la Universidad de Costa Rica (CICUA 045-15).   17    Xenoinjertos subcutáneos Se inocularon de forma subcutánea 1,5x106 células de la línea OVCAR3 por ratón, las cuales habían sido previamente cultivadas siguiendo los protocolos arriba descritos. Estas se inocularon en el flanco izquierdo de ratones desnudos hembra (CD-1® / Crl:NU-Foxn1nu; NCI-Charles River) de 4 semanas de edad, utilizando 200 µL de una mezcla 1:1 de medio de cultivo completo y matrigel (Cat. 356237, Corning). Ensayo de Eficacia Siete días después de la implantación de los xenoinjertos subcutáneos, se calculó el volumen inicial de los tumores utilizando un calibrador vernier digital mediante la siguiente fórmula: 𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒆𝒍 𝒕𝒖𝒎𝒐𝒓 𝒎𝒎𝟑 0.52 ∗ 𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑚𝑚 ∗ 𝐴𝑛𝑐ℎ𝑜 𝑚𝑚 Los animales experimentales fueron asignados en los diferentes tratamientos según su volumen inicial de tumor, con el fin de tener medidas de volumen tumoral similares entre los tratamientos. Se designaron dos grupos de tratamiento con 4 sujetos experimentales cada uno: 1 mg/kg de plásmido scrambled (CTRL) y 1 mg/kg de plásmido de expresión de Hsa-miR-198 (M198). Se utilizó una nanopartícula de LGA-PEI como vehículo, según lo descrito anteriormente. Los sujetos experimentales fueron tratados vía intratumoral cada dos días con un volumen final de inyección de 100µL, iniciando el día de asignación en los diferentes tratamientos. Durante todo el estudio se evaluaron signos clínicos y se dio seguimiento al tamaño de los tumores. En el momento en que uno de los sujetos experimentales alcanzó un tamaño tumoral superior a 2000 mm3, se procedió a sacrificar a todos los sujetos experimentales y se evaluó macroscópicamente la presencia de los tumores y su diseminación. Los tumores fueron removidos,   18    pesados, colectados en solución RNA-Later (Cat. AM702, Thermo Fisher Scientific) y almacenados a -80°C para posteriores análisis. Corroboración del mecanismo molecular Se aisló ARN total de las células de los ensayos de transfección y de los tejidos tumorales del ensayo de eficacia, utilizando mirVana™ miRNA Isolation Kit (Cat. AM1560, Thermo Fisher Scientific). Para la conversión de miARN a ADNc se utilizó TaqMan® Advanced miRNA Assays (Cat. A25576, Thermo Fisher Scientific). Para la cuantificación de la expresión de las diferentes dianas moleculares, se utilizó un Sistema PCR en Tiempo Real 7500 (Applied Biosystems®) y el kit SuperScriptTM III One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq DNA Polymerase (Cat. 12574030, Thermo Fisher Scientific). Para el análisis de expresión de Hsa- miR-198, se utilizó la expresión de U6 como control endógeno; mientras que para MSLN, PBX1 y VCP se utilizó la expresión de GAPDH como control endógeno. Se determinó la expresión de las diferentes dianas moleculares mediante el método de expresión relativa 2- ΔΔCt. Los imprimadores (Cat. KSPQ12012, Sigma-Aldrich) utilizados fueron los siguientes:   19    Gen Imprimador (5′-3′) Hsa-miR-198 F: AACCTATCTCCCCTCTGGACC R: Reverso Universal* MSLN F: CTCAACCCAGATGCGTTCTCG R: AGGTCCACATTGGCCTTCGT PBX1 F: TGAGCGTGCAGTCACTCAATG R: CGAGTCCATCACTGTATCCTCC VCP F: GTTGTCGCCCATATTAGCTCG R: AGTAAGGCGCAATCGAACAGT GAPDH F: TGTACCACCAACTGCTTGGC R: GGCATGGACTGTGGTCAT U6 F: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT R: Reverso Universal* *Cat. RA420AU-3, SBI Determinación de la seguridad in vivo del Hsa-miR-198 Ensayo de seguridad Se utilizaron ratones CD-1 (CD-1® IGS Mice, Charles River) como sujetos experimentales. Estos fueron agrupados según su peso. Se designaron cinco tratamientos con 4 sujetos experimentales cada uno: solución salina 0.9% NaCl (NT), 1 mg/mL de plásmido scrambled (CTRL-B), 2.4 mg/mL de plásmido scrambled (CTRL-A), 1 mg/mL de plásmido de expresión de Hsa-miR-198 (M198-B) y 2.4 mg/mL de plásmido de expresión de Hsa-miR-198 (M198-A). Se utilizó una nanopartícula de LGA-PEI como vehículo, según lo descrito anteriormente. Los sujetos experimentales fueron tratados vía intravenosa cada dos días con un volumen final de inyección de 300 µL. En caso de los tratamientos CTRL-B, CTRL-A, M198-B y MIR198-A, el volumen total estaba conformado por 100 µL   20    correspondientes al tratamiento y 200 µL de solución salina 0.9% NaCl. La administración de los tratamientos se realizó cada dos días, con un total de 7 administraciones, iniciando el día de la distribución de los sujetos experimentales en los diferentes grupos. Una vez finalizado el régimen de tratamiento, se evaluaron los parámetros sanguíneos (ALT, ALKP, TBIL, CREA y BUN) mediante la obtención de sangre del seno retro-orbital y la utilización de un analizador veterinario de química sanguínea (IDEXX-VetTest® 8008). Además, se recuperó el bazo, el hígado y los riñones de los grupos experimentales CTRL-A y M198-A con el fin de evaluar la biodistribución de la formulación utilizada mediante la determinación de la expresión de Hsa-miR-198, siguiendo la metodología estipulada en el apartado “Corroboración del mecanismo molecular”. Análisis estadísticos Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el paquete estadístico IBM SPSS Statistics v23.0. Los parámetros de normalidad y homogeneidad de varianza se estimaron utilizando la prueba de Shapiro–Wilk y la prueba de Levene, respectivamente. Las diferencias significativas entre los grupos fueron estimadas utilizando la prueba t-student o ANOVA en caso de datos paramétricos y la prueba U de Mann-Whitney o Kruskal-Wallis en caso de datos no paramétricos. En caso de comparaciones múltiples, se utilizó la prueba de Tukey (post hoc). Se consideró estadísticamente significativo un valor p <0.05.   21    Resultados Determinación de la eficacia in vitro del Hsa-miR-198 Ensayos de proliferación y migración celular Se evaluó el efecto in vitro de M198 sobre la capacidad de proliferación y migración de las líneas celulares OVCAR3 y SKOV3. Como se muestra en la figura 1A, el nivel de expresión de Hsa-miR-198 en células transfectadas con M198 fue significativamente mayor que en las células transfectadas con CTRL (control) (anexo 1). Por su parte, los ensayos de proliferación y migración celular mostraron diferencias significativas, en al menos una de las dos líneas celulares en estudio, al comparar células transfectadas con M198 con células CTRL (figura 1B-C; anexo 2- 3). Figura 1. Efecto de M198 en la proliferación y migración de líneas c e lulares de cáncer de ovario. A: Expresión de Hsa-miR-198 48h post transfección. B: Cambio relativo de crecimiento celular de 0h a 48h post transfección. C: Porcentaje de migración celular 48h post transfección.   22    Determinación de la eficacia in vivo del Hsa-miR-198 Ensayo de crecimiento tumoral en modelo xenoinjerto subcutáneos Se evaluó la función in vivo de M198 en un modelo de xenoinjerto subcutáneo utilizando la línea celular OVCAR3. Como se muestra en la figura 2A, a partir del quinto día de iniciado el ensayo, el volumen tumoral fue significativamente menor en los sujetos experimentales tratados con M198 que en los sujetos experimentales controles; llegando a una diferencia de aproximadamente 5.24 veces para el último día del ensayo (anexo 4). Aunado a esto, hubo menor número de nódulos metastásicos en sujetos experimentales tratados con M198 que en los sujetos experimentales controles (figura 2B). Ensayo de expresión génica en modelo xenoinjertos subcutáneos Se evaluó el efecto in vivo de M198 sobre la expresión de genes diana en un modelo de xenoinjerto subcutáneo utilizando la línea celular OVCAR3. Como se muestra en la figura 3, la expresión de MSLN, PBX1 y VCP disminuyó significativamente en los sujetos experimentales tratados con M198 en comparación con los sujetos experimentales controles. Se observó correlación estadística inversa entre la expresión de Hsa-miR-198 y la expresión tanto de PBX1 (p=0.028) como de VCP (p=0.026). Además, se observó correlación estadística directa entre la expresión de PBX1 y la expresión de VCP (p=0.004) (anexo 5).   23    Figura 2. Efecto de M198 en el crecimiento y migración tumoral en modelo xenoinjerto subcutáneo con la línea celular OVCAR3. A: Curva de crecimiento tumoral durante el tratamiento. B: Tumores primarios y nódulos metastásicos recuperados al final del ensayo. Determinación de la seguridad in vivo del Hsa-miR-198 Ensayo de biodistribución Se evaluó la biodistribución de M198 en ratones CD-1 sanos tratados de forma intravenosa con una dosis de 2.4 mg/kg cada dos días durante 15 días. Con base en estudios previos, se eligieron riñón, baso e hígado como órganos diana para la determinación de la potencial toxicidad asociada a la terapia con oligonucleótidos202. Se obtuvo aumento significativo de la expresión de Hsa-miR- 198 en riñón e hígado de los sujetos tratados con M198 en comparación con los controles (figura 4; anexo 6a). Ensayos de función hepática, renal y pancreática en sujetos experimentales sanos Se evaluó el potencial toxicológico de M198 en ratones CD-1 sanos mediante administración intravenosa de dos dosis diferentes durante 15 días, dosificando   24    cada dos días. Los indicadores de función hepática ALT, ALKP y TBIL y los indicadores de función renal CREA y BUN no presentaron diferencias estadísticamente significativas de concentración sérica entre los sujetos experimentales tratados y los controles, indicando ausencia de daño hepático o renal asociado al tratamiento; desde una perspectiva bioquímica (figura 5 y 6; anexo 6b). Figura 3. Efecto de M198 sobre la expresión de genes diana en modelo xenoinjertos subcutáneos   25    Figura 4. Biodistribución de M198 en hígado, riñón y baso de ratones CD-1 sanos. Figura 5. Química sanguínea relativa a la función hepática de sujetos experimentales tratados con M198. A: Concentración sanguínea de ALT. B: Concentración sanguínea de ALKP. C: Concentración sanguínea de TBIL.     26    ----------- Figura 6. Química sanguínea relativa a la función renal de sujetos experimentales tratados con M198. A: Concentración sanguínea de CREA. B: Concentración sanguínea de BUN. Discusión   27    El estudio de los miARNs en el contexto de las patologías humanas es, actualmente, en uno de los temas de mayor interés científico debido a la relevancia de estos en la regulación de la expresión génica 203. Un ejemplo de esto es Hsa- miR-198, el cual ha sido involucrado en la patogenia de muchas enfermedades humanas204–206. En cáncer, existe cada vez más evidencia que sugiere la participación de Hsa-miR-198 en los diversos procesos involucrados en la progresión del tumoral137,207. De hecho, se han reportado múltiples genes diana de Hsa-miR-198 involucrados en la progresión de diferentes tipos de cáncer incluyendo colon34, estómago29, cerebro27,150, hígado136,137,208, mama30, hueso38, páncreas39, próstata158,209 y pulmón35,139, lo cual a su vez indica que el efecto de Hsa-miR-198 sobre la progresión tumoral es en gran medida dependiente del tipo de cáncer, así como los genes diana involucrados. En cáncer de ovario se ha reportado expresión anormal de múltiples miARNs210,211. Sin embargo, el papel de Hsa-miR-198 en el desarrollo y progresión del cáncer de ovario aún no ha sido bien dilucidado. A la fecha, únicamente se ha reportado: 1) una disminución significativa de la expresión de Hsa-miR-198 en tejido tumoral, respecto a tejido sano44; 2) correlación entre los niveles de expresión de Hsa-miR-198 y la sensibilidad a agentes quimioterapéuticos160 y 3) niveles de expresión de Hsa-miR-198 ligeramente mayores en tumores recurrentes en comparación con tumores primarios159. En este estudio se demostró que Hsa-miR-198 regula la proliferación y migración de células de cáncer de ovario, lo cual sugiere un escenario en el que Hsa-miR-198 funciona como un supresor tumoral en este tipo de cáncer. En la línea celular OVCAR3, la sobreexpresión de Hsa-miR-198 dio como resultado una inhibición significativa de la proliferación y migración celular; mientras que en la línea celular SKOV3 hubo inhibición significativa únicamente en la migración celular (figura 1). El hecho de no haber obtenido diferencias significativas en la proliferación de la línea celular SKOV3 transfectada con M198, podría estar relacionado con múltiples factores en los cuales esta línea celular difiere de la línea celular OVCAR3: histológicos, genómicos, moleculares85,199,200,212. No obstante, más estudios son necesarios para corroborar estas hipótesis. Por otra parte, la relación entre la   28    sobreexpresión de Hsa-miR-198 y su posible papel en la regulación de la proliferación y migración celular ha sido reportada en varias líneas celulares de cáncer, incluyendo SW116, HCT11634, U8727, Pop10, HepG2, Hep3B31,32, MCF7, MDA-MB-23130, HOS, U2OS38, MIA-MSLN, AsPC139, PC3, LNCap26,158, A549 y Calu-333,35. En el modelo de xenoinjerto murino, la restauración de Hsa-miR-198 mediante expresión ectópica inhibió significativamente el crecimiento y la migración tumoral (figura 2). Este resultado apoya la hipótesis de que la sobreexpresión de Hsa-miR-198 generalmente se asocia con fenotipos menos agresivos de cáncer de ovario, que a su vez coincide con reportes previos en cáncer de ovario donde concluyen que la expresión de Hsa-miR-198 en tejido tumoral es mucho menor que en tejido sano adyacente44. A la fecha, ningún informe ha descrito esta relación entre Hsa-miR-198 y el cáncer de ovario en términos de regulación de la proliferación y la migración tumoral en un modelo de xenoinjerto murino. Más importante aún, se demostró que la función de Hsa-miR-198 en la regulación del crecimiento y migración tumoral del cáncer de ovario está relacionada con la regulación de la expresión del interactoma MSLN/PBX1/VCP (figura 3), el cual fue descrito previamente en adenocarcinoma pancreático ductal por Marin- Müller et al39. Con base en esta información, se realizaron correlaciones entre los genes reportados por Marin-Müller et al39 y el crecimiento tumoral de un modelo xenoinjerto subcutáneo murino de cáncer de ovario. De los diferentes genes implicados, la correlación entre la expresión de PBX1 y el crecimiento tumoral fue la que presentó una mayor significancia estadística, de la mano con la correlación entre la expresión de Hsa-miR-198 la expresión de PBX1 (anexo 5). PBX1 tiene un papel crítico en la regulación transcripcional y está involucrado en una gran variedad de procesos biológicos que incluyen la determinación del destino celular durante la organogénesis y la actividad oncogénica en cáncer de mama y cáncer de ovario213. Tanto para cáncer de mamá como para cáncer ovario se ha reportado sobreexpresión de PBX1185,214, donde su función ha sido relacionada con la regulación positiva de la señalización estrogénica, promoviendo el crecimiento y migración tumoral214,215. Asimismo, la expresión de PBX1 ha sido asociada con la   29    expresión aberrante de genes HOX involucrados en diversos tipo de cáncer entre los cuales destacan próstata, colon y pulmón216 De igual manera, se determinó significancia estadística en las correlaciones entre los demás genes implicados en el interactoma y el crecimiento tumoral. La expresión de MSLN correlacionó significativamente con el crecimiento tumoral (anexo 5). Aunque la expresión de MSLN pareciera no ser esencial en los tejidos normales217, en cáncer se ha demostrado que la sobreexpresión de MSLN correlaciona con la agresividad tumoral en muchos tipos de tumores sólidos218. En el caso particular del cáncer de ovario, aproximadamente el 70% de los casos presentan sobreexpresión de MSLN48,165, implicando una menor sobrevida global, principalmente por su asociación con el aumento en la capacidad de diseminación metastásica a peritoneo219. De hecho, en este estudio los tumores provenientes de los animales experimentales tratados con M198 presentaron menor número de nódulos metastásicos (figura 2B) en conjunto con una menor expresión de MSLN (figura 3). Por otra parte, no se logró alcanzar la significancia estadística al correlacionar la expresión de MSLN con la expresión de Hsa-miR-198 (anexo 5). Dado que la regulación de Hsa-miR-198 sobre la expresión de MSLN no se da por la vía canónica39, se sugiere que esta podría estar asociada tanto a degradación de su ARNm como a represión traduccional220. Por lo tanto, la correlación realizada considera parcialmente el efecto que tiene Hsa-miR-198 en la regulación de la expresión de MSLN. Estudios sobre el efecto de Hsa-miR-198 sobre la expresión de MSLN a nivel proteico son necesarios para corroborar esta hipótesis. No se logró establecer correlación estadística significativa entre la expresión de VCP y el crecimiento tumoral (figura 3; anexo 5), a pesar de que varios estudios sugieren que la expresión de VCP está involucrada en la proliferación de células tumorales de diferentes tipos de cáncer, incluyendo cáncer de ovario39,50,194–196. Por otra parte, en este estudio se logró determinar correlación significativa entre la expresión de Hsa-miR-198 y la expresión de VCP, así como correlación significativa robusta entre la expresión de PBX1 y VCP (figura 3; anexo 5); lo cual coincide con estudios previos que indican que la regulación de la expresión de VCP mediada por Hsa-miR-198 puede darse por dos mecanismos: 1) de forma directa a través de la   30    vía de regulación canónica de los miARNs39,221y 2) de forma indirecta a través de la regulación de PBX1, el cual está involucrado en la regulación de la expresión de VCP. 222. VCP ha sido estudiado en cáncer de ovario como un elemento fundamental en los mecanismos de autofagia y resistencia a derivados de platino196. En este trabajo no se investigó el papel del eje Hsa-miR-198/PBX1/VCP en la sensibilidad a agentes quimioterapéuticos. No obstante, existen estudios previos donde se ha reportado el papel de Hsa-miR-198 en la sensibilización de diferentes tipos de cáncer a agentes quimioterapéuticos150,223. En el caso concreto del cáncer de ovario, existe solo una investigación donde se ha asociado baja expresión de Hsa- miR-198 con menor sensibilidad a quimioterapia160. Lo anterior sugiere un potencial papel de la expresión de Hsa-miR-198 y de VCP en la sensibilidad del cáncer de ovario a agentes quimioterapéuticos. Sin embargo, es necesaria más investigación que permita dilucidar concretamente esta hipótesis. Dada la posible función de Hsa-miR-198 como supresor tumoral en cáncer de ovario, que se sugiere a partir de los resultados obtenidos en este trabajo a través de ensayos in vitro e in vivo, se estableció un primer informe a nivel preclínico de las posibilidades de uso terapéutico de esta molécula. Se administró a ratones CD- 1 por vía intravenosa la formulación M198 cada dos días con un total de 7 administraciones. Se evaluaron indicadores clínicos como, ganancia/perdida de peso, piloerección, fatiga, ingesta e hidratación anormal; y no se evidenciaron cambios asociados a los tratamientos evaluados (datos no mostrados); permitiendo una primera inferencia general sobre la ausencia de alteraciones en la salud sistémica de los sujetos experimentales. En cuanto a la biodistribución de M198, la expresión de Hsa-miR-198 aumentó aproximadamente 7 veces a nivel hepático y 4 veces a nivel renal en los sujetos experimentales tratados M198 en comparación con los sujetos control (figura 4). Mediante el análisis bioquímico de la función hepática y función renal, se determinó que los niveles sanguíneos de ALT, ALKP, TBIL, CREA y BUN en los sujetos experimentales tratados con M198 no difirieron significativamente de los   31    observados en los controles respectivos (figura 5 y 6). Las enzimas ALT y ALKP son expresadas principalmente en las células hepáticas173. TBIL corresponde a un producto de la degradación de glóbulos rojos involucrado en la síntesis de ácidos biliares a nivel hepático174. BUN es un producto del metabolismo celular y CRE corresponde a un producto específico de la degradación muscular226,227. Cambios en la concentración sanguínea de estas variables corresponden a indicadores de hepatotoxicidad o disfunción renal173-176. Al no observarse cambios significativos en la concentración sanguínea de estas variables en los sujetos experimentales tratados con M198 en comparación con los sujetos controles (figuras 5 y 6), se descarta, al menos desde una perspectiva bioquímica, la ausencia de daño hepático o renal como consecuencia del tratamiento con M198. Conclusiones Los resultados obtenidos indican que Hsa-miR-198 actúa como un supresor tumoral en cáncer de ovario. La sobreexpresión de Hsa-miR-198 conduce a la   32    reducción de al menos una de las capacidades tumorigénicas estudiadas en ambos tipos de células. Las funciones tumorigénicas reducidas significativamente en respuesta a la expresión ectópica de Hsa-miR-198 corresponden a proliferación y migración celular, así como crecimiento tumoral y generación de nódulos metastáticos en un modelo murino de xenoinjerto subcutáneo. En conjunto con hallazgos previos en cáncer de páncreas, la reconstitución de Hsa-miR-198 en tumores de cáncer de ovario, conduce a una menor tasa de crecimiento tumoral y la disminución concomitante de la expresión de MSLN PBX1 y VCP. Estos resultados, muestran un mecanismo de regulación de la capacidad de proliferación y migración celular en cáncer de ovario similar al reportado en cáncer de páncreas, a través del interactoma Hsa-miR-198/MSLN/PBX1/VCP. Los resultados obtenidos muestran que el uso de un vector de expresión de Hsa-miR-198 encapsulado en una nanopartícula de LGA-PEI como potencial terapia contra cáncer de ovario es factible en términos de eficacia y seguro en un primer nivel de evaluación en murinos. Las etapas posteriores a este hallazgo corresponden a la sustitución y evaluación del vector de expresión por análogos sintéticos y estudios de seguridad de mayor plazo y en animales superiores. Esto con el fin de tener una determinación preclínica más robusta del potencial uso terapéutico de la formulación empleada. Bibliografía 1. Torre, L. A. et al. Global Cancer Statistics, 2012. CA a cancer J. Clin. 65, 87–108 (2015).   33    2. Siegel, R. L., Miller, K. D. & Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin 66, 7–30 (2016). 3. Agarwal, R. & Kaye, S. B. Ovarian cancer: strategies for overcoming resistance to chemotherapy. Nat. Rev. Cancer 3, 502–516 (2003). 4. Coleman, R. L., Monk, B. J., Sood, A. K. & Herzog, T. J. Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 211–24 (2013). 5. Hoon, D., Seung, H., Chang, S. & Bristow, R. E. Surgical management of recurrent ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 11 (2016). doi:10.1016/j.ygyno.2016.04.537 6. Bowtell, D. D. et al. Rethinking ovarian cancer II: reducing mortality from high-grade serous ovarian cancer. Nat. Rev. Cancer 15, 668–79 (2015). 7. Guilford, P. et al. 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Análisis estadístico correspondiente a la evaluación del crecimiento de células transfectadas con M198. Anexo 3. Análisis estadístico correspondiente a la evaluación de la capacidad de migración de células transfectadas con M198.   57    Anexo 4. Análisis estadístico correspondiente a la evaluación del crecimiento tumoral en modelo xenoinjerto subcutáneo tratado con M198 o CTRL. Tratamiento Tratamiento Anexo 5. Análisis estadístico correspondiente a la evaluación del efecto de M198 sobre la expresión de genes diana en modelo xenoinjertos subcutáneos   58    Tratamiento Tratamiento Anexo 6a. Análisis estadístico correspondiente a la evaluación de seguridad del tratamiento con M198.   59    Anexo 6b. Análisis estadístico correspondiente a la evaluación de seguridad del tratamiento con M198.   60      61      62    Anexo 7. Interactoma propuesto por Marín-Müller et al., relativo a la patogénesis del PDAC.