UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO DISEÑO DE MEMBRANAS DE ÁCIDO POLILÁCTICO PARA LIBERACIÓN CONTROLADA DE TRAMADOL Trabajo final de investigación aplicada sometido a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Odontología para optar al grado y título de Maestría Profesional en Odontología con Énfasis en Prostodoncia LAFITTE FERNÁNDEZ MINOTRE Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2023 ii Dedicatoria A mi esposa, Laura, por no permitirme renunciar a mis sueños, por ser mi motor, mi inspiración y mi apoyo en todo este proceso. A mi mamá, Danay, mi hermana, Fannella y mi sobrina, Sofía por ser mi ejemplo de actitud ante la vida. A mi papá, Lafitte, por enseñarme a no tener miedo de contar la verdad y, por eso, me enseñó el amor y el respeto a la investigación … Te amo Pa, un beso y abrazo al cielo. Agradecimientos A mis mentores en investigación, amigos y quienes me impulsaron a vivir esta aventura que nunca olvidaré, Dr. Daniel Chavarría (Chava) y Dr. Mauricio Montero (Mau), inmensamente agradecido con ustedes. Al Dr. Marco Álvarez y la Dra. Febe Carolina por abrirme las puertas en México, brindarme su guía, enseñanza y amistad. Al Dr. Amury Pozos por su importante guía en el desarrollo y escritura de este estudio. Al Dr. Jose Viales y su esposa por recibirme en México con toda la amistad y cariño, me hicieron sentir en casa. Al Dr. Jose Vega por darme el honor de realizar parte de la investigación en el Laboratorio de Nanotecnología del Centro Nacional de Alta Tecnología. Al Sr. Reinaldo Pereira por su invaluable ayuda en materia de microscopía electrónica de barrido. Al Dr. David Lafuente y todos mis profesores del posgrado en Prostodoncia por toda la enseñanza y amistad que me brindaron. iii Hoja de aprobación iv Tabla de Contenido Portada ............................................................................................................... i Hoja de aprobación .........................................................................................iii 1. Resumen ....................................................................................................... vi 2. Introducción .................................................................................................. 1 3. Marco Teórico .............................................................................................. 2 3.1 Ingeniería tisular ...................................................................................................................... 2 3.2 Membranas, andamios en los procesos de regeneración: ..................................................... 2 3.2.1 Materiales comúnmente utilizados: ................................................................................ 4 3.2.2 Producción de membranas: ............................................................................................. 5 3.2.3 Materia prima para la industria biomédica. ................................................................. 8 3.3 Dolor y analgesia periférica: .................................................................................................... 9 3.3.1-Dolor: ................................................................................................................................ 9 3.3.2-Tramadol como agente de analgesia periférica:.......................................................... 11 4. Marco metodológico ................................................................................... 13 4.1 Planteamiento del problema y justificación ......................................................................... 13 4.2 Pregunta de investigación ...................................................................................................... 13 4.3 Objetivo general ...................................................................................................................... 13 4.4 Objetivos específicos ............................................................................................................... 13 4.5 Hipótesis nula .......................................................................................................................... 14 4.6 Hipótesis Alternativa .............................................................................................................. 14 4.7 Diseño del Estudio .................................................................................................................. 14 4.8 Variables de estudio: .............................................................................................................. 14 4.9 Lugares donde se desarrolla la investigación ....................................................................... 17 5. Metodología. Materiales y Métodos ......................................................... 18 5.1 Preparación de las muestras:................................................................................................. 18 5.2 Caracterización: ..................................................................................................................... 19 5.2.1 Análisis de macro y microarquitectura: ....................................................................... 19 5.2.2 Perfil termodinámico: .................................................................................................... 19 5.2.3 Composición química: ................................................................................................... 20 v 5.2.4 Análisis de biocompatibilidad (citotoxicidad, adhesión e interacción celula- material): .................................................................................................................................. 21 6. Resultados ................................................................................................... 24 6.1 Análisis macroscópico de los andamios ................................................................................ 24 6.2 Análisis microtopografía mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). .............. 24 6.3 Análisis de perfil termodinámico por calorimetría diferencial de barrido (DSC)............ 26 6.4 Análisis Termogravimetría (TGA) ........................................................................................ 28 6.5 Análisis FT-IR ......................................................................................................................... 31 6.6 Análisis espectrometría UV-VIS ........................................................................................... 32 6.7- Análisis de biocompatibilidad. ............................................................................................. 33 7. Discusión ..................................................................................................... 36 7.1 Macro y microtopografía: ...................................................................................................... 36 7.2 DSC y TGA: ............................................................................................................................ 38 7.3 FTIR Y UV-VIS: ..................................................................................................................... 39 7.4 Biocompatibilidad ................................................................................................................... 39 8. Conclusión ................................................................................................... 43 9. Referencias bibliográficas ......................................................................... 44 vi 1. Resumen Introducción: Lograr una mejor sinergia entre los biomateriales utilizados para la regeneración de tejidos y los medicamentos analgésicos desde el mismo acto quirúrgico podría ser posible si se toma en cuenta la similitud de las membranas reabsorbibles a base de ácido poli-láctico (PLA), los mecanismos actuales para la liberación controlada de drogas y el método de fabricación compatible con la carga del medicamento en la membrana o andamio. Objetivo del estudio: Diseñar membranas a base de ácido poliláctico (PLA) por medio de air jet spinning (AJS) cargadas con tramadol con características fisicoquímicas estables y biocompatibles. Materiales y Métodos: Se sintetizaron dos grupos de membranas por técnica AJS, membranas de PLA al 10% (control) y membranas de PLA al 10% cargadas con tramadol puro en una razón 80:1 (experimental). Se caracterizaron con análisis de microscopía (SEM) a 50x, 2000x y 5000x, el perfil termodinámico se evaluó por calorimetría (DSC) y termogravimetría (TGA), la estructura química se determinó por espectrometría (FT-IR), la identidad de los compuestos según su espectro de absorbancia se determinó por espectroscopia ultravioleta (UV-VIS), se analizó la biocompatibilidad de las membranas al exponerlas a células de osteoblastos humanos y se sometieron a pruebas de tinción de resazurina y cristal violeta para estudios de espectrofotometría a 545 nm y tinción con diacetato de 5-clorometilfluoresceína para microscopía de fluorescencia. Los resultados se analizaron con las pruebas estadísticas ANOVA y Chi cuadrado. Resultados: Al SEM se observó una distribución aleatoria de fibrillas del polímero de aproximadamente 5 µm, con ausencia de zonas desnudas. La calorimetría del sistema de PLA 10% con tramadol indica que la droga estaba incorporada de manera homogénea y estable, la presencia de la droga aumenta la capacidad térmica del sistema polimérico. El TGA mostró ausencia de impurezas o productos secundarios del proceso de fabricación, la presencia de tramadol, disminuye el To (punto de inicio) y Tp (punto de inflexión) de la membrana de PLA 10%. El análisis FT-IR mostró que la síntesis de las membranas no altera su composición y que la incorporación del tramadol es compatible con el sistema polimérico, y no altera el perfil infrarojo. La prueba UV-VIS identifica la presencia del tramadol en las alícuotas recuperadas para las 24, 48 y 72 horas respectivamente. Las pruebas de biocompatibilidad indican que las membranas con tramadol no generan una respuesta de citotoxicidad y el número de células muestra un ligero crecimiento similar al grupo control. Conclusión: Fue posible diseñar membranas del PLA al 10% cargadas con tramadol en concentración 80:1 con características físico-químicas estables y biocompatibles. 1 2. Introducción Gran parte del éxito en la rehabilitación protésica depende de disponer de una buena calidad y cantidad de tejidos remanentes blandos y duros. Motivo por el cual, el profesional en prostodoncia depende de otras especialidades odontológicas del área quirúrgica con un alto conocimiento en ingeniería tisular que se encargue de garantizar la preservación y/o regeneración de los tejidos aledaños al espacio a rehabilitar. Por supuesto, al ser lo anterior un procedimiento de primera fase en la mayoría de los tratamientos buco-dentales, y que el éxito de todo plan odontológico depende de la actitud y compromiso del paciente. El equipo de especialistas debe priorizar el confort y el ganar la confianza del paciente para que éste continúe cumpliendo con las distintas citas que conlleva los objetivos de trabajo. Por lo cual, en las etapas iniciales del tratamiento juega un papel fundamental tanto la buena aplicación de la ingeniería tisular como el manejo farmacológico seleccionado para evitar la mayor cantidad de molestias y complicaciones del caso. Es en lo anterior, donde resulta relevante lograr una mejor sinergia entre los biomateriales utilizados para la regeneración de tejidos y los medicamentos analgésicos desde el mismo acto quirúrgico y esto es posible si se toma en cuenta la similitud de las membranas reabsorbibles a base de ácido poli-láctico (PLA), los mecanismos actuales para la liberación controlada de drogas y el método de fabricación que sea compatible con la carga del analgésico en la membrana o andamio. El presente estudio busca desarrollar de forma in vitro una membrana a base de PLA para liberación controlada de tramadol, por medio de una técnica de fabricación efectiva y económica, como lo es el método air jet spinning. 2 3. Marco Teórico 3.1 Ingeniería tisular La ingeniería tisular, se basa en una tríada derivada de tres componentes principales: las células, su membrana extracelular (MEC) y un sistema de señalización. Mediante el uso de uno o más de estos componentes, es posible desarrollar un tejido funcional, es decir, la premisa básica es una manipulación controlada del microambiente extracelular, en busca de conducir la capacidad de las células para organizarse, crecer, diferenciarse, formar una MEC y, en última instancia, desarrollar un nuevo tejido funcional. Sin lugar a dudas, se trata de un proceso complejo en donde se requieren señales autocrinas, paracrinas, endocrinas, señales posicionales, interacciones célula-matriz, fuerzas mecánicas y contactos célula-célula para mediar en la formación de un nuevo tejido con la arquitectura y función adecuada1, por ende, los procedimientos de regeneración o preservación de los tejidos, requieren de biomateriales de alta calidad, capaces de asemejar a los componentes biológicos y sus propiedades físicas deseables con el fin de guiar el comportamiento celular en cuanto al tráfico, apego y proliferación en los tejidos remanentes2. 3.2 Membranas, andamios en los procesos de regeneración: Los datos históricos reportan que fue en el campo de la cirugía ortopédica donde se dieron los primeros esfuerzos en desarrollar una barrera capaz de aislar una lesión ósea para impedir la invasión de tejidos suaves con el objetivo de que estos no interfirieran en el proceso de reparación y crecimiento óseo. Hurley y colaboradores describen por primera vez el concepto de membrana, más adelante, en la década de 1960 Bassett, Boyne y colaboradores probaron unos filtros de celulosa microporosa (Millipore) para la curación de defectos corticales en huesos largos y en reconstrucciones óseas de la cara; por medio de este filtro consiguieron un entorno adecuado para la osteogénesis excluyendo las células de tejido conectivo de los defectos óseos. Ya para los años ochenta, este 3 principio se comienza a probar experimentalmente en la regeneración de tejidos periodontales perdidos y surge lo que hoy se conoce como regeneración tisular guiada en odontología3. La aplicación de una membrana para evitar que los tejidos no osteogénicos interfieran con la regeneración ósea es un principio clave de la regeneración ósea guiada (ROG). Se comprende que la regeneración se logra cuando las células osteoprogenitoras pueden repoblar exclusivamente el sitio del defecto óseo, es decir, sin la invasión de tejidos no osteogénicos. Las membranas utilizadas en este proceso terapeútico deben poseer características deseables que incluyan biocompatibilidad, propiedades de oclusión celular, integración a los tejidos del huésped, posibilidad de administración clínica, capacidad de creación de espacio y propiedades físico-mecánicas adecuadas. A través del tiempo se han desarrollado membranas de tipo reabsorbible y no reabsorbible, Las de tipo no reabsorbibles, principalmente las de politetrafluoroetileno (PTFE) en su forma expandida (e-PTFE), constituyeron la primera generación de membranas de barrera. En general, estos tipos de membrana demuestran biocompatibilidad y capacidad de creación de espacio. Sin embargo, las de tipo no reabsorbibles necesitan una segunda intervención quirúrgica para la extracción de la barrera4. Posteriormente, se han desarrollado membranas reabsorbibles, que tienen como objetivo eliminar las complicaciones quirúrgicas asociadas con su extracción. Técnicas conocidas, basadas en polímeros, se han utilizado de manera rutinaria para sintetizar membranas porosas y tridimensionales que guíen y aíslen el proceso, es decir como andamios para la regeneración de tejidos5. Las membranas, también actúan como un andamiaje para reconstruir tejidos blandos en el proceso de cicatrización de una herida. Un andamio, se encarga de imitar a la MEC transportando las células al sitio del defecto o herida, permitiendo, así, el crecimiento celular y preservando el espacio. El andamio ideal cumple cualidades especiales, debe tener una estructura tridimensional, ser fácil de manejar, poseer una respuesta inflamatoria mínima, propiedades mecánicas y fisicoquímicas apropiadas, con un proceso de tiempo biodegradable6. Se trata de una armazón de biomatrices, compuesta por estructuras nanofibrosas que funcionan como una plataforma de soporte natural propocionando soporte biofísico 4 y mecánico para el reclutamiento, adhesión, proliferación, diferenciación y / o metabolismo celular. Esta armazón debe cumplir con la denominada microarquitectura matricial, es decir, con las características geométricas, semejantes a la MEC, en la que una célula interactúa con su sustrato7. La manufactura de membranas y de forma general, cualquier sustituto de tejido, debe considerar incorporar en su producción las ventajas biológicas de un autoinjerto y proporcionar las de un aloinjerto, al tiempo que alivie las complicaciones de los mismos. Scheller y colaboradores indican que los productos deben satisfacer requisitos esenciales como: biocompatibilidad, conductividad para la unión y proliferación de células, capacidad de incorporar factores inductivos para dirigir y mejorar el crecimiento de nuevos tejidos, apoyar el crecimiento vascular para el transporte de oxígeno y biomoléculas, integridad mecánica para soportar cargas; tasa de degradación controlada, predecible, reproducible y no tóxica; por último, un procesamiento fácil y rentable en formas irregulares de tamaño suficiente para llenar defectos clínicamente relevantes1. 3.2.1 Materiales comúnmente utilizados: La ingeniería tisular se ha apoyado en diversos biomateriales para el desarrollo de una variedad de membranas capaces de soportar la unión celular y, en algunos casos, proporcionar las señales necesarias para el desarrollo espacial y temporal controlado de los tejidos. Dentro de los biomateriales más comúnmente utilizados se encuentran los polímeros biodegradables, los cuales se categorizan como polímeros naturales y sintéticos. Los polímeros sintéticos también se dividen en dos categorías: poliésteres alifáticos saturados y otros polímeros sintéticos. Los polímeros de origen natural, como el quitosán, el colágeno, la elastina, la gelatina, el alginato y las fibras de seda, se han desarrollado como materiales de base debido a su similitud con la MEC, así como a su biocompatibilidad y biodegradabilidad. Los polímeros de base sintética, de tipo poliésteres alifáticos saturados, aplicados para la construcción de andamiajes son: poli-a-hidroxiésteres saturados, que incluyen ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA) y polilacticolglicolida (PLGA)1,7,8. 5 En comparación con los andamios de base natural, las bases sintéticas tienen varias ventajas, incluidas propiedades físicas y químicas predefinidas como: manejabilidad, procesabilidad, biodegradación ajustada y capacidad de encapsulación de fármacos, además, su elaboración tiene un costo relativamente bajo2,3. El PLA, cumple con las características anteriormente mencionadas, es un polímero termoplástico derivado del ácido láctico que pertenece a la familia de los α-hidroxiácidos. El ácido láctico se obtiene como producto de la fermentación de almidón de plantas como el maíz, la caña de azúcar, las papas, la remolacha, etc. El polímero se sintetiza por policondensación directa de ácido láctico o la polimerización de apertura de anillo del dímero de lactida usando un catalizador adecuado; se caracteriza por ser de alta resistencia, biodegradable y compostable, es decir, se degrada biológicamente sin dejar residuos tóxicos visibles o distinguibles. Es ampliamente utilizado para producir artículos de envasado industrial y dispositivos médicos biocompatibles y bioadsorbibles. Ha sido objeto de considerable atención debido a su gran potencial en aplicaciones biomédicas y aún más importante es que es un polímero aprobado por la Administración Federal de Medicamentos de los Estados Unidos5,9,10,11. 3.2.2 Producción de membranas: Existen diferentes métodos de producción de membranas y andamios, entre ellos: el electrohilado (electrospinning) y el hilado por chorro de aire o air jet spinnig (AJS). 3.2.2.1 Técnica de electrohilado: El electrohilado es la técnica de producción de nanofibras más ampliamente investigada, sus principales ventajas son: ser apropiado para una gran variedad de materiales, ofrece la posibilidad de obtener fibras de varios nanómetros de diámetro y es sumamente viable para la producción comercial12. El electrohilado es un enfoque nanotecnológico que puede reproducir las propiedades físicas de la MEC: porosidad, diámetro de nanofibras, geometría y composición, sin embargo, está limitado por la velocidad lenta de producción de fibra y requiere una conductividad adecuada para 6 formar un chorro de polímero. El alto riesgo por la necesidad de una fuente de alto voltaje se suma al costo y la complejidad del proceso6,13. 3.2.2.2 Técnica air jet spinning: La técnica AJS puede considerarse como la más ventajosa desde el punto de vista de la industrialización y la escalabilidad. Tiene varias ventajas, es más rápida y fácil de usar, menos costosa, segura porque no emplea alto voltaje y posee versatilidad en la elección del disolvente. Básicamente, consiste en un aerógrafo comercial, comúnmente utilizado para pintar, conectado a un suministro de aire comprimido y apuntando a cualquier superficie que pueda capturar la solución; su principio es el uso del gas presurizado que se dispensa a una velocidad extrema para estirar la solución de polímero en fibras delgadas, las cuales, como se mencionó, se depositan sobre un sustrato, logrando producir fibras a micro y nanoescala de diferentes polímeros ya sean sintéticos o naturales5,12,13. En un estudio realizado por el Dr. Medeiros y colaboradores, se comparó los productos nano- fibrosos obtenidos de los métodos de soplado de solución (AJS) y electrohilado. Aportando una importante conclusión, pues informa que la técnica de hilado por soplado de solución es útil para hacer una gama de micro y nanofibras a partir de soluciones de polímeros en el mismo rango de tamaño que las fibras hechas por electrohilado pero con mayor potencial para la ampliación comercial. Esto, porque en relación con el proceso de electrohilado, el hilado por soplado de solución se puede realizar a velocidades de inyección mucho más altas (un orden de magnitud más alto). Además, el proceso de hilado por soplado de la solución, al no requerir de alto voltaje ni ningún colector conductor de electricidad puede usarse para recubrir cualquier tipo de material con una gama más amplia de soluciones de polímeros. No se limita a disolventes con una alta constante dieléctrica, ni afecta negativamente a los polímeros sensibles al calor o al voltaje, como proteínas, etc. Otro aspecto importante de esta investigación destaca que debe haber una relación óptima entre la presión 7 de flujo de gas, la velocidad de alimentación de la solución y la distancia de trabajo para que el solvente se evapore y forme fibras solidificadas en el colector, pues de lo contrario se produce la formación de una película en lugar de las fibras12,14. 3.2.2.3 Factores influyentes en la producción de membranas y andamios por AJS: La morfología de la fibra puede variarse al controlar varios parámetros, como la concentración del polímero, la tensión superficial, la distancia de trabajo, el gas de hilado, la temperatura, la presión del gas y la velocidad de evaporación5. En un estudio realizado en la Universidad de Shangai se investigaron las correlaciones entre la morfología de la fibra soplada en solución y los campos de flujo de aire turbulento anular bajo diferentes presiones de aire. Los resultados demuestran que la velocidad relativa, la longitud del segmento recto del chorro de solución de polímero, las fluctuaciones de velocidad, el movimiento de aleteo y la evaporación del solvente afectan la morfología final de la fibra en el soplado de la solución. Los diámetros de fibra se volvieron más uniformes y el diámetro promedio disminuyó al aumentar la presión del aire de entrada. Sin embargo, al aumentar aún más la presión del aire, los diámetros de fibra se redujeron ligeramente y se volvieron desiguales, acompañados por la aparición de algunas hebras de fibra. Este trabajo mostró por primera vez la influencia del campo de flujo de aire anular turbulento en la solución de soplado mediante simulación numérica, así también, investigó el movimiento de aleteo de fibra con una cámara de alta velocidad e inspeccionó la correlación con la morfología de la fibra, lo cual, ayuda a comprender mejor la fabricación controlable de nanofibras por AJS15. Una investigación focalizada en producir fibras de celulosa a escala submicrométrica por AJS destacó el efecto de la temperatura del aire en la formación de las fibras por su efecto sobre la evaporación del disolvente. Se dieron cuenta de que al aumentar la temperatura se reduce el número de fibras más finas debido a una evaporación más rápida16. Las propiedades mecánicas de las fibras también se ven afectadas por la agregación de componentes orgánicos a la solución, en otro estudio, 8 durante un proceso de elaboración de membranas a base de PLA y mediante AJS, se adicionaron nanopartículas de hidroxiapatita (HA) con el fin de optimizar su resistencia mecánica, luego las membranas se llevaron a evaluar mediante la prueba de tracción. Los resultados indicaron que la fabricación de membranas por AJS pueden mejorar sus propiedades de tracción por los nanocompuestos HA-PLA. Además de lo anterior, se demuestra que que AJS es un método efectivo para preparar un andamio de nanocompuesto híbrido orgánico / inorgánico con una red fibrosa altamente interconectada13. En la publicación de la Dra. Stojanovska y colaboradores se desarrolla una tabla con los parámetros a considerar durante la elaboración de membranas y andamios por la técnica AJS, entre ellos se citan: parámetros de la solución (viscosidad, concentración del polímero, peso molecular, tensión superficial, presión de vapor); parámetros del proceso (presión de aire, distancia entre la boquilla eyectora y el colector, flujo de solución); parámetros del sistema (diámetro de la boquilla eyectora, geometría de la boquilla eyectora); parámetros ambientales (temperatura, humedad, presión atmosférica)12. 3.2.3 Materia prima para la industria biomédica. Los andamios nanofibrosos por su versatilidad han sido aplicados en el ámbito biomédico, como apósitos para heridas, vasos sanguíneos artificiales, administración de fármacos y como se ha mencionado en la regeneración de tejidos; el PLA como biopolímero biodegradable se utiliza ampliamente para la regeneración ósea por medio de nanofibras, para proporcionar apoyo al crecimiento del hueso nuevo, por ejemplo, se han desarrollado esteras compuestas de nanofibras de PLA con hidroxiapatita12,13. En cuestiones de biocompatibilidad, un aspecto importante a estudiar es la proliferación celular, y el PLA ha demostrado ser un material que cumple con dicha cualidad. Recientes estudios enfocados en crear materiales para recubrir las prótesis vasculares a base de nanofibras de PLA por 9 técnica AJS señalaron resultados muy aceptables en cuanto a adhesión y proliferación de células endoteliales17. La literatura demuestra la creciente e innegable importancia de las membranas sintéticas reabsorbibles para la industria médica que busca optimizar los procesos de ingeniería tisular y de liberación controlada de medicamentos, el desarrollo de mejores biomateriales a base de PLA fabricados por la beneficiosa técnica AJS podría detonar como un catalizador para el crecimiento de más y mejores investigaciones dentro de este ámbito. 3.3 Dolor y analgesia periférica: 3.3.1-Dolor: El dolor es una sensación desagradable multidimensional que varía en intensidad, calidad, duración y referencia. Es decir, puede ser: leve, moderado, severo, de tipo agudo, ardiente o sordo, superficial o profundo, localizado o difuso; es una “experiencia sensorial y emocional desagradable asociada con un daño tisular real o potencial, o descrita en términos de dicho daño” según la definición de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (IASP). Tiene componentes cognitivos, emocionales y se acompaña de reflejos motores de evitación y alteraciones en la producción autonómica. El dolor puede ser adaptativo, contribuyendo a la supervivencia al proteger al organismo de lesiones o colaborando en la curación de las mismas. También, se categoriza como desadaptativo, el cual, es razón patológica del funcionamiento del sistema nervioso. El dolor, en general, se clasifica en varios tipos: nociceptivo, inflamatorio, neuropático y funcional. Cuando un estímulo nocivo causa una sensación dolorosa aguda, lo hace mediante el sistema nociceptivo, un sistema sensorial especializado de alto umbral que se extiende desde la periferia a través de la médula espinal, el tronco encefálico y el tálamo hasta la corteza cerebral, donde se percibe la sensación. En el caso de una cirugía de regeneración ósea, por ejemplo, se produce un daño tisular que ignora al mecanismo de defensa del sistema nociceptivo, el organismo reacciona buscando la curación de la zona lesionada 10 por medio del dolor inflamatorio, aumentando la sensibilidad en la parte afectada, provocando que estímulos que normalmente no causarían dolor ahora lo causan. Esto permite que se evite el movimiento o el roce del sitio operado durante la sanación o reparación de esa parte, minimizando la posibilidad de un daño adicional, en este caso el dolor agudo cumple con el rol de ser un método preventivo contra daños tisulares potencialmente graves que afecten la integridad de los tejidos y órganos, caso contrario al dolor crónico que es fisiopatológico. El actuar del profesional en odontología, luego de un procedimiento quirúrgico, debe ser el controlar el dolor inflamatorio, sin interferir en el proceso de curación o afectar gravemente al sistema nociceptivo. El objetivo es normalizar la sensibilidad al dolor, no eliminarlo y regular la inflamación de manera que no sea excesiva, el tratamiento antiinflamatorio-analgésico está dirigido a suprimir o controlar los síntomas. Actualmente se ha conceptualizado el término de neuroplasticidad del dolor, lo que define un proceso dinámico de señalización que no solo implica la participación de células neuronales, sinó, también de factores genéticos, características ambientales, intensidad del estímulo que actuará generando cambios bioquímicos, células no neuronales como el caso de macrófagos y células gliales que son más relevantes en el caso del dolor patológico y que actúan periférica y centralmente para modular el dolor. Este dinamismo del dolor ha permitido la evolución de mejores enfoques farmacológicos para lograr una analgesia más efectiva y consiente de los mecanismos involucrados18,19. Como analgesia periférica se conoce a la aplicación local de analgésicos en los sitios de origen del dolor periférico, esto se ha logrado mediante el uso de, por ejemplo, geles o cremas tópicas, parches, aerosoles, enjuagues bucales entre otros. Con este método se obtiene la gran ventaja de alcanzar una alta concentración local del medicamento en el punto de inicio del dolor con niveles sistémicos más bajos o insignificantes de este mismo, reduciendo los efectos adversos del fármaco e inclusive anulándolo. También, se logra mitigar las interacciones farmacológicas y se facilita el uso del fármaco sin limitarse a depender de la dosis de tolerabilidad20. 11 3.3.2-Tramadol como agente de analgesia periférica: Los opioides son fármacos de elección para el alivio profundo del dolor, esta analgesia se caracteriza por la ausencia de pérdida de conciencia. A ciencia cierta, los opioides no mitigan y/o tratan la causa del dolor, sino que disminuyen su percepción, es decir, logran que el estímulo doloroso se vuelva más tolerable. El mecanismo de acción de los opioides es mediante receptores celulares específicos: µ [mu], κ [kappa] y δ [delta], los cuales se encuentran localizados en el sistema nervioso central y en células mononucleares como las presentes en el corazón, pulmones, intestinos y en la sangre periférica. Al producirse la interacción con los receptores de opiáceos se generan señales intracelulares, cuyo principal efecto es la reducción de la excitabilidad celular y la neurotransmisión21. El tramadol es considerado un agonista opioide débil o como un opioide atípico por su acción central de agonismo con el receptor µ [mu], es efectivo para la analgesia del dolor leve a moderado y, además, inhibe levemente la recaptación de serotonina y norepinefrina. Aun así, el efecto modulador en canales sodio dependientes de voltaje, canales V1 de potencial receptor transitorio, receptores de glutamato, adrenoreceptores δ2, receptores de adenosina y los mecanismos que involucran la sustancia P, el péptido relacionado con el gen de la calcitonina, la prostaglandina E2 y citosinas proinflamatorias; podrían modular la hiperexcitabilidad neuronal tanto periférica como central19,21. En modelos experimentales de nocicepción en animales han mostrado resultados favorables del manejo del control del dolor. Por otra parte, estudios realizados en seres humanos ha evidenciado ser un buen medicamento coadyuvante en combinación con otros fármacos como los anestésicos para potenciar su efecto ya sea en anestesia general o local. Con respecto a esto último, resulta evidente la potencial importancia del uso del tramadol en combinación con anestésicos de uso rutinario en odontología y, dicha complementación, no pasa desapercibida por los esfuerzos investigativos que 12 buscan mejorar el efecto y la duración de la anestesia local, tal es el caso de la combinación tramadol- mepivacaína con resultados alentadores en el bloqueo del nervio alveolar inferior, de igual forma se evidenció en el estudio de la sinergia entre tramadol-articaína para la cirugía de terceros molares incluídos y en el tratamiento del dolor agudo de la pulpitis irreversible sintomática22. 13 4. Marco metodológico 4.1 Planteamiento del problema y justificación El acto quirúrgico de un procedimiento de regeneración tisular demanda no solo de una buena aplicación de la técnica y del conocimiento de las bases teóricas de la ingeniería tisular en la búsqueda del éxito del plan de trabajo general, sino también de un buen manejo farmacológico del dolor y que garantice el confort del paciente en el post-operatorio, pues a fin de cuentas es el paciente quién decide si continúa o no con el tratamiento, parte de ese bienestar radica en mitigar los efectos secundarios de los analgésicos a medicar durante el periodo de sanado. Contar con una bio-herramienta que no solo cumpla con los requisitos mínimos de una membrana de segunda generación y que además actúe como un agente liberador local de tramadol puede ser un factor clave en el cumplimiento de los objetivos de los procedimientos terapeúticos. Y por eso, el presente estudio busca desarrollar de forma in vitro una membrana a base de PLA para liberación controlada de tramadol, por medio de una técnica de fabricación efectiva y económica, como lo es el método air jet spinning. 4.2 Pregunta de investigación ¿Es posible diseñar membranas de PLA cargadas con TMD por técnica air jet spinning para liberación periférica del fármaco? 4.3 Objetivo general Diseñar membranas de PLA cargadas con Tramadol mediante la técnica de Air Jet Spinninng para su liberación periférica. 4.4 Objetivos específicos 1 Analizar la topografía microscópica de las membranas. 14 2 Evaluar el perfil termodinámico de las membranas. 3 Evaluar la composición química de las membranas. 4 Evaluar biocompatibilidad de las membranas en pruebas de proliferación, adhesión y morfología celular. 4.5 Hipótesis nula Por medio de la técnica air jet spinning no es posible diseñar membranas a base de PLA como mecanismo de liberación periférica de tramadol. 4.6 Hipótesis Alternativa Por medio de la técnica air jet spinning es poiblse diseñar membranas a base de PLA como mecanismo de liberación periférica de tramadol. 4.7 Diseño del Estudio Estudio experimental In Vitro. 4.8 Variables de estudio: 4.8.1 Variable independiente, carga del fármaco:  Presencia de tramadol.  Ausencia de tramadol. 4.8.2- Variables dependientes: 4.8.2.1 Cambios morfológicos: • Macro y micro-arquitectura, microscopio de luz y microscopio electrónico de barrido. Es una variable cualitativa y se hará un análisis descriptivo. 15 4.8.2.2 Perfil termodinámico: Las pruebas térmicas permiten analizar el efecto de los componentes añadidos a una matriz polimérica confirmando la presencia de aditivos, rellenos e inclusive impurezas y contaminantes del proceso de fabricación. Esto es posible gracias a que un cambio en la masa de los materiales implica un cambio químico que es reflejado en las características termodinámicas, lo cual es reflejado en el termograma o curva de descomposición térmica que es una gráfica de pérdida de masa según la temperatura23. • Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC). La calorimetría establece una relación entre la temperatura y las propiedades físicas de las mezclas poliméricas, es un método para determinar la entalpía asociada con el proceso de estudio. La calorimetría diferencial de barrido (DSC por sus siglas en inglés) mide el cambio de dichas propiedades físicas de las muestras en función de la temperatura, flujo de calor, transiciones de los materiales y el tiempo. Además, determina la cantidad de calor que los grupos experimentales y control irradian o absorben en función de la diferencia de temperatura entre ellos24. • Análisis termogravimétrico (TGA). El análisis termogravimétrico (TGA por sus siglas en inglés) mide el cambio del peso/masa, ya sea pérdida o ganancia y la tasa de cambio del peso en función de la temperatura, el tiempo y atmósfera controlable. Con esto, es posible determinar la composición de la mezcla polimérica y pronosticar su estabilidad térmica. Su utilidad es para caracterizar materiales que experimentan pérdida o ganancia de peso debido a sorción/desorción de volátiles, descomposición, oxidación y reducción. Con lo anterior podemos inferir la estabilidad térmica del material, su estabilidad oxidativa, la composición del sistema, su vida útil, su cinética de descomposición, el efecto de atmósferas reactivas o corrosivas y el contenido de componentes volátiles25. 16 Variables cuantitativas con prueba estadística Wilcoxon. 4.8.2.3 Composición química: • Espectrometría infraroja transformada de Fourier (FT-IR): FT-IR representan las siglas en inglés para Fourier Transform Infrared, es una prueba de laboratorio que se ha utilizado durante muchos años para identificar el espectro infrarrojo de una muestra, lo cual, es prácticamente la huella digital de todo compuesto químico y lo que representa son los picos de absorción que corresponden a las frecuencias de las vibraciones entre los enlaces de los átomos que componen el material. Esto permite identificar los componentes de la muestra, ya que cada material es una combinación única de átomos y no es posible que dos compuestos produzcan exactamente el mismo espectro infrarrojo26. • Análisis espectrometría del espectro visible ultra violeta (UV-VIS): La espectrometría UV-VIS (espectro visible ultra violeta) es una de las técnicas instrumentales de análisis más antiguas. Se trata de la medición del resultado de la interacción electromagnética de la luz ultravioleta con los átomos, iones y moléculas de las muestras. Así, es posible medir la atenuación de un haz de luz tras su paso por una muestra27. En el caso de esta variable cualitativa se hará un análisis descriptivo. 4.8.2.4 Biocompatibilidad (citotoxicidad, proliferación e interacción célula-material): Se cuantifica la cantidad de células que se adhieren y proliferan en la muestra, con esto se determina la citotoxicidad de la muestra y por tanto su biocompatibilidad, para esto se utiliza una línea de osteoblastos humanos, se toma una cantidad previamente cuantificada y se realiza un cultivo en platos de cultivo celular donde se pondrán en contacto con las muestras, se realiza una tinción con un medio como cristal violeta y/o rezasurina28. Dichos colorantes se unen a las células vitales y se llevan a un conteo por medio de un lector ELISA CROMATE 4300. 17 Las variables de adhesión y proliferación celular son variables cuantitativas y su análisis estadístico es ANOVA. En el caso de la morfología celular, por medio de una tinción CellTracker™ Green CMFDA (diacetato de 5-clorometilfluoresceína) en rojo de fenol libre se logra observar los osteoblastos y su interacción celular gracias a la microscopía por fluorescencia, de igual forma, la morfología celular se puede aprecia por medio de SEM. Esta variable es cualitativa y su análisis será descriptivo. 4.9 Lugares donde se desarrolla la investigación La metodología del presente estudio se realizó en los siguientes lugares: a. Laboratorio Nacional de Nanotecnología (LANOTEC), Centro Nacional de Alta Tecnología, San José, Costa Rica. b. Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos, Departamento de Estudios de Posgrado e Investigación, Facultad de Odontología, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad de México, México. 18 5. Metodología. Materiales y Métodos 5.1 Preparación de las muestras: Para producir 2 grupos de membranas basadas en PLA al 10 %, se disolvieron 4 gramos de gránulos de ácido poliláctico (C3H4O3; peso molecular (MW) 192 000, denominado Ingeo 2003D) de Pro-maplast, México) en una mezcla de cloroformo (CHCl₃) y alcohol etílico anhidro absoluto (CH₃CH₂OH suministrado por J. T. Baker). En una relación de volumen de 3:1 a 40 mililitros de solución, ésta se mezcló en una placa de agitación durante 30 minutos. Los 4 gramos de PLA se colocaron en un vaso de precipitados y se vertió la mezcla 3:1 de cloroformo y etanol, el compuesto se colocó en una placa de agitación durante 5 horas. El producto obtenido se divide en 2 grupos del mismo volumen cada uno, el primer grupo era un grupo control con solo 10% PLA y el segundo era un 10% PLA con 12,34 mg de tramadol (HCL, código 15101782, lote 3735ID12) obteniendo una mezcla con una relación volumétrica de 80:1, para lograr lo anterior se adicionó el fármaco a la solución de PLA al 10% y se corrió una placa de agitación por 45 minutos, asegurando que a la velocidad utilizada, en este caso a nivel 3, no produjera grumos ni burbujas. Para la síntesis de las membranas, se utilizó la técnica AJS, primero se cargó la mezcla control en un aerógrafo disponible comercialmente (Toolcraft, modelo TC4176) con boquilla de 0,3 mm de diámetro y depósito de 7 ml, el cual fue previamente purgado con acetona, se conectó a un compresor de aire libre de aceite (De Walt, modelo D2002M-WK) con una presión de disparo de 30 Psi. Se coloca una hoja de papel encerado de aproximadamente 25 cm de alto por 35 cm de largo a una distancia de 10 cm desde la punta de disparo del aerógrafo y se dispara la solución manualmente, manteniendo un movimiento horizontal de ida y vuelta de derecha a izquierda durante 10 minutos. A continuación, se realizó el mismo procedimiento con la solución cargada con tramadol. Una vez obtenidas las láminas con las membranas, se cortaron las muestras con un sacabocados con diámetro de corte de 1 cm, se cortaron 90 muestras por cada lámina. 19 5.2 Caracterización: 5.2.1 Análisis de macro y microarquitectura: Durante el procedimiento de corte de las muestras se observó la textura de las mismas, su apariencia y sus cualidades en el proceso de manipulación de las mismas.  Microscopio electrónico de luz: Por medio de un microscopio electrónico de luz (AmScope, T610d-Ipl, USA) se analizó la distribución de las fibras a una magnificación de 40x  Microscopía electrónica de barrido (SEM): Las membranas fueron observadas por microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (JEOL JSM-7600F FE-SEM) para determinar la morfología y estructura de las fibras obtenidas por la técnica AJS, y para las pruebas biológicas se utilizó para observar la presencia, morfología, propagación e interacción de osteoblastos. Para el análisis SEM, al final del tiempo de cultivo de incubación, las membranas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se fijaron con glutaraldehído al 2 % durante 1 h y luego se deshidrataron con una serie graduada de etanol del 25 al 100 %; Finalmente, las muestras se sometieron a secado en punto crítico. Las muestras se cubrieron mediante pulverización catódica con 5 nm de una fina capa de oro (EMS 150R, Quorum, EE. UU.) para analizar las superficies exterior e interior. 5.2.2 Perfil termodinámico:  Calorimetría diferencial de barrido (DSC): Para analizar la respuesta térmica de las membranas se realizaron medidas de calorimetría diferencial de barrido con un equipo DSC Q200 (TA Instruments, Delaware, USA) con entre dos y 20 cuatro miligramos, aproximadamente por cada muestra, las cuales se pesaron y prepararon cápsulas estándar de aluminio DSC y se sellaron. Cada muestra se estabilizo a 20ºC por 3 minutos, antes de iniciar un análisis con una rampa de calentamiento de 10ºC/min hasta alcanzar los 250ºC. incialmente se realizaron calorimetrías para la membrana de PLA 10%, PLA 10% + Tramadol 80:1, pellet de PLA puro y tramadol puro, para conocer las curvas calorimétricas esperadas. Posteriormente, se realizaron 5 muestras de cada membrana, y se calcularon los valores promedios de las temperaturas máximas para cada cambio de la curva, y se calculó la capacidad térmica (J/g) del área bajo la curva de cada una de las señales identificadas. Los datos se analizan utilizando el software DSC (Universal V4.5A TA Instruments), identificando los puntos de fusión (Tm) y la temperatura de transición vítrea (Tg). Posteriormente, se realizó un análisis estadístico de Walcoxon para comparar los resultados obtenidos para las membranas de PLA 10% y las membranas de PLA 10% + tramadol 80:1. Se consideraron diferencias estadísticamente importantes los valores de p<0,05.  Análisis Termogravimetría (TGA): El análisis de TGA se realizó colocando una muestra de cada uno de los grupos y del tramadol puro. El equipo fue tarado, y después cada muestra se estabilizó por 5 minutos a 20ºC. posteriormente, se inicio una tasa de calentamiento de 10ºC/min hasta alcanzar la temperatura máxima de 800ºC. 5.2.3 Composición química:  Espectroscopia infrarroja (FTIR): La incorporación de tramadol en la membrana de PLA 10% fue evaluada mediante espectrometría infraroja transformada de Fourier (FT-IR), utilizando un equipo FTIR Nicolet iS50, Thermo Fisher, Madison, USA. El análisis se realizó por triplicado colocando las muestras en la superficie del ATR (siglas en inglés para Attenuated Total Reflection) que es un cristal transmisor de alto índice de refracción. 21  Análisis espectrometría UV-VIS: Para identificar la presencia del tramadol en el sistema polimérico, se realizó una revisión de literatura para determinar la longitud de onda de lectura en el espectrofotómetro. Se terminó que el tramadol sería analizado a una longitud de 271nm, mientras que el PLA es medible a 230nm aproximadamente. Se realizó una curva de calibración para el tramadol, con el fin de conocer si el mismo era recuperado de las membranas ya sintetizadas. Se colocaron 23 mg de membranas de PLA 10% + Tramadol 80:1, en un sistema Transwell, con insertos de 12mm de diámetro y membranas de policarbonato con poros de 0,4um. En cada uno de los pozos de añadieron 1.5mL de agua destilada tipo 3, y dentro de cada inserto 0,5mL adicionales según las indicaciones del fabricante. Las placas se guardaron en una incubadora 37ºC para tomar una alícuota de 1 mL a las 24, 48 y 72 horas de liberación. Las mismas fueron analizadas en el espectrómetro identificar la presencia de tramadol liberado a partir del sistema. El experimento se realizó por triplicado para cada uno de los tiempos evaluados. 5.2.4 Análisis de biocompatibilidad (citotoxicidad, adhesión e interacción celula- material): Para evaluar la respuesta biológica a las membranas, se utilizaron células de osteoblastos fetales humanos (hFOB, 1.19 ATCC CRL-11372). Las células hFOB se habían cultivado en matrices de cultivo celular de 75 cm² con una mezcla 1:1 de medio Ham's F12 y Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), complementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS, Biosciences, Princeton, NJ, EE. UU.), L-glutamina 2 0,5 mM y solución antibiótica (estreptomicina 100 µg/mL y penicilina 100 U/mL, Sigma-Aldrich). Los cultivos celulares se incubaron en un ambiente 100 % humidificado a 37 °C en 95 % de aire y 5 % de CO2. Para exponer membranas de PLA con y sin tramadol a células hFOB se seleccionó una caja o plato de cultivo celular con cuarenta y dos espacios por ser la opción que mejor se ajustaba al tamaño de las 22 membranas, se manipuló en campana de flujo laminar, en el cual, dicha caja fue dividida y marcada, de acuerdo a los siguientes grupos: Control (C, placa con células), membrana PLA en medio sin células (M), membrana PLA con células (MC), membrana PLA con tramadol sin células (MT), membrana PLA con tramadol con células (MTC) y grupo de membranas para SEM. Las membranas, sin separarlas del papel encerado, fueron esterilizadas por exposición a luz ultravioleta durante 10 minutos, luego colocadas de manera que la superficie con papel encerado estuviera en contacto con la placa de cultivo, exponiendo la superficie formada únicamente por las fibras. Para fijar más fácilmente las membranas a la placa, se colocó una pequeña gota de PBS para fijarlas, reduciendo el efecto estático. Una vez colocados, se esterilizaron nuevamente exponiéndolos a la luz ultravioleta por 10 minutos. Para extraer las células hFOB a utilizar de la matriz del medio de cultivo, se lavó con PBS para eliminar las células no adheridas o muertas, luego se colocó 1 ml de tripsina y se colocó en la incubadora por 5 minutos a velocidad. Terminado el proceso de separación de las células adheridas a la matriz de crecimiento, se inactiva el efecto de la tripsina añadiendo DMEM, la solución obtenida se centrifuga a 5000 revoluciones para obtener 2 ml de sedimento celular del que se obtienen 10 microlitros y realizar el conteo celular logrando un número representativo de células por volumen, el cual fue de 10.000 células por gota de 10 microlitros, dicha gota se diluyó en 200 microlitros de caldo de cultivo celular para mejorar la humectabilidad de las membranas. Se permitió un tiempo de adhesión celular de 4 y 24 horas para la prueba del cristal violeta y de 24 y 48 horas para la prueba de la resazurina. Transcurrido el tiempo anterior, las membranas se enjuagaron tres veces con PBS para eliminar las células no adherentes. Las células unidas a las membranas se fijaron con paraformaldehído al 4 % y se incubaron con solución de cristal violeta al 0,1 % durante 15 min. A continuación, el colorante se extrajo con dodecilsulfato de sodio al 0,1 % (SDS). Para la prueba de resazurina, se añadieron a las muestras 20 µl de solución de resazurina (sal sódica de resazurina, BioRea-gent, R7017, número CAS 62758-13-8), que se incubaron durante 24 y 48 horas a 37 °C. En ambas pruebas de tinción, la absorción óptica se cuantificó mediante espectrofotometría a 545 nm 23 con un lector de placas Chromate (Awareness Technology, Palm City, FL, EE. UU.). Además, se utilizó microscopía de fluorescencia (AMSCOPE) después de 48 horas de cultivo celular para analizar también la morfología celular, el patrón de propagación y la interacción entre el material y la célula. Para ello, antes de sembrar sobre las membranas, las células del cultivo se incubaron con CellTracker™ Green CMFDA (diacetato de 5-clorometilfluoresceína) en medio libre de rojo fenol a 37 °C durante 30 min. El cultivo celular se lavó con PBS y se incubó durante 1 h en medio completo. Después de la recuperación, las células se tripsinizaron y contaron hasta la concentración celular deseada (1 × 103 células/mL) y se incubaron durante 48 h en las membranas para obtener imágenes mediante microscopía de fluorescencia. Finalmente, los resultados cuantificados se analizaron con la prueba estadística ANOVA. 24 6. Resultados 6.1 Análisis macroscópico de los andamios Tras la aplicación del método de síntesis fue posible obtener membranas de PLA 10% con carga de tramadol en proporción 80:1 polímero-fármaco. Macroscópicamente estas membranas tienen una textura blanda y color blanco-transparente. A pesar de poder ser aisladas, separadas y cortadas, su manipulación suele ser delicada para evitar distorsiones del biomaterial. Ante la magnificación de 40X del microscopio de luz es posible apreciar la disposición aleatoria de las fibras con zonas de mayor y menor aglomeración (figura 1). 6.2 Análisis microtopografía mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). A una baja magnificación de 50x, no es posible apreciar diferencias entre el grupo control (membrana de PLA 10%) y el grupo experimental que contiene el tramadol en proporción 80:1. Las membranas muestras una distribución aleatoria de fibrillas del polímero, con ausencia de espacios o zonas desnudas. En las magnificaciones de 2000x y 5000x, fue posible apreciar la arquitectura microscópica de las fibras de PLA. Debido a la forma de síntesis es posible obtener fibras longitudinales orientadas en diversos planos y angulaciones. El tamaño promedio de las fibras no excede los 5m. en algunas zonas, es posible ver la formación de placas o constructos de mayor dimensión por precipitación de fibras individuales (figura 2). 25 Figura 1. Dos grupos de membranas y la imagen del microscopio óptico con un aumento de 40x, (a) membrana de PLA al 10 % cargada con una concentración de TMD de 80:1, (b) membrana de control de PLA al 10 %. Figura 2. Las microfotografías obtenidas por SEM a aumentos de 50X, 2000X y 5000X muestran membranas de control y experimentales con una disposición aleatoria de las fibras. P LA 1 0 % + T ra m ad o l 8 0 :1 m e m b ra n e P LA 1 0 % m e m b ra n e 50x 2000x 5000x (a) (b) 26 6.3 Análisis de perfil termodinámico por calorimetría diferencial de barrido (DSC) Se observó que el grupo de control presentaba curvas calorimétricas diferentes a las del polímero puro (pellet de PLA), que no mostraba la primera señal endotérmica y mostraba una segunda señal bien definida (figura 3). Al analizar la calorimetría del grupo experimental, se evidenció que no mostraba el pico endotérmico del TMD puro, indicando que el fármaco se incorporaba de forma homogénea y estable al sistema. Posteriormente, se realizó el análisis DSC cinco veces para los grupos de control y experimental para verificar la pureza de las muestras. La figura 4 muestra que la temperatura máxima y la capacidad calorífica de la primera señal no mostraron diferencias estadísticas (p>0,05). La única diferencia estadísticamente significativa fue la capacidad térmica observada en la membrana cargada con TMD (p<0,05), lo que indica que la presencia del fármaco aumenta la capacidad térmica del sistema polimérico (figura 5). Posteriormente, se analizaron ambos grupos (membranas PLA 10% y membranas de PLA 10% + tramadol 80:1) (n=5), con el fin de analizar cambios en los valores obtenidos. La temperatura máxima de ambas señales endotérmicas (ºC) no fue estadísticamente diferente, así como tampoco la capacidad térmica (J/g) de la primera señal (p>0,05). La única diferencia estadísticamente importante fue la capacidad térmica observable en la membrana cargada de tramadol (p<0,05), lo cual indica que la presencia de la droga aumenta la capacidad térmica del sistema polimérico. 27 Figura 3. Termogramas DSC de PLA puro, membrana de PLA al 10%, TMD puro y membrana de PLA+TMD al 10%. Figura 4. Temperatura máxima (°C) de la primera y segunda señal de capacidad endotérmica para los grupos experimental y de control. 28 Figura 5. Capacidad calorífica (J/g) de la primera y segunda señal de capacidad endotérmica para los grupos experimental y de control. 6.4 Análisis Termogravimetría (TGA) El análisis TGA mostró la ausencia de impurezas o subproductos durante el proceso de fabricación de la membrana. Las membranas de PLA al 10% y las membranas de PLA + TMD al 10% mostraron una única caída de masa, con un punto de inicio visible (To), así como un único punto de inflexión (Tp) (Tabla 1), calculado por la derivada del cambio porcentual de peso/temperatura. (Figuras 6-9) El tramadol puro también mostró una única curva de caída de masa, con To y Tp visibles (Tabla 1). Product Onset point (To) (ºC) Inflection points (Tp) (ºC) Tramadol 234,39 270,57 PLA 10% membrane 310,24 343,35 PLA 10% membrane + Tramadol 80:1 302,33 334,40 Tabla 1. Valores de los parámetros termogravimétricos. La TMD disminuye la To y la Tp de las membranas de PLA 10%. 29 Figura 6. Derivada del porcentaje de cambio de peso/temperatura del TMD puro. Figura 7. Derivada del cambio porcentual de peso/temperatura de la membrana de PLA 10%. 30 Figura 8. Derivada del cambio porcentual de peso/temperatura de la membrana de PLA 10% + TMD 80:1. Figura 9. Comparación de los puntos de inflexión. 31 6.5 Análisis FT-IR Se obtuvieron las señales en un rango de resolución de absorbancia de 400 a 4000 cm-1. Los resultados demuestran que la manipulación del polímero para la síntesis de las membranas no altera su composición. De igual forma, la incorporación del tramadol es compatible con el sistema polimérico, y no altera el perfil infrarrojo. Únicamente se observó un aumento en la señal entre los 2800 y 3000 cm-1; atribuible a la presencia del tramadol que presenta una señal simétrica de CH2 medible entre 2900 y 2800 cm-1, y la señal asimétrica de 2933 cm-1 del grupo metileno, descritos anteriormente para esta molécula. Las demás señales del tramadol pueden haber pasado desapercibidas debido a la baja proporción de la droga y su incorporación a la matriz polimérica previo a la síntesis por airjet-spinning (Figura 10). Figura 10. La estructura química del TMD, del PLA puro, de la membrana de PLA 10% y de la membrana de PLA 10% + TMD fue analizada por FTIR en el rango de 400-4000 cm-1. 32 6.6 Análisis espectrometría UV-VIS Con la previa calibración del sistema, fue posible identificar la presencia del tramadol en las alícuotas recuperadas, específicamente 185,31 2,1 uG/mL, 180,8015,27 uG/mL y 174,8816 uG/mL para las 24, 48 y 72 horas respectivamente, lo que comprueba que el tramadol fue efectivamente cargado en las membranas y puede ser recuperado mediante la hidrólisis del sistema (figura 11 y 12). Futuros estudios analizarán la relación entre carga teórica y carga recuperada; así como la cinética de liberación en función del tiempo. Figura 11. Curva de calibración del TMD UV-VIS 33 Figura 12. Concentración de TMD por alícuota en diferentes momentos 6.7- Análisis de biocompatibilidad. 6.7.1 Citotoxicidad celular: La prueba del de cristal violeta sólo detecta células vivas, por lo que se observó una ausencia de citotoxicidad cuatro horas después del contacto de las células con las membranas. A las 24 horas, se observó un aumento del crecimiento celular en el grupo de control. El grupo experimental tampoco mostró evidencia de citotoxicidad a las 4 horas y un sutil aumento del crecimiento celular a las 24 horas (figura 13). 34 Figura 13. Prueba de cristal violeta para la citotoxicidad en células de osteoblastos. Resultados espectrofotométricos a 545 nm. 6.7.2- Adhesión celular: La prueba de la resazurina no mostró efectos adversos sobre la adhesión celular, y no hubo diferencias significativas entre los grupos (p<0,05) (Figura 14). Figura 14. Prueba de adhesión celular con resazurina, resultados espectrofotométricos a 545 nm. 6.7.3 Interacción célula-material por microscopía de fluorescencia y SEM. De acuerdo con las pruebas de biocompatibilidad, las microfotografías mostraron la presencia y viabilidad de las células a las 48 horas del cultivo celular para los grupos de control y experimental. Además, se identificó la posición y la distribución homogénea de las células en las membranas y la 35 morfología hexagonal característica de los osteoblastos. Se observó que las células presentaban prolongaciones citoplasmáticas para la interacción con las células vecinas utilizando sus lamelipodios (figura 15). Figura 15. Microfotografías de la interacción de las células con las membranas mediante microscopía de fluorescencia y SEM tras 48 horas de cultivo celular. P LA 1 0 % + T ra m ad o l 8 0 :1 m em b ra n e P LA 1 0 % m e m b ra n e 36 7. Discusión 7.1 Macro y microtopografía: Se escogió la técnica de producción AJS sobre la técnica de electrohilado pese a que la literatura reporta que esta última es la técnica de producción de nanofibras más ampliamente investigada, sin embargo, está limitada por la velocidad lenta de producción de fibra y requiere una conductividad eléctrica adecuada para formar un chorro de polímero, lo cual implica un alto riesgo, por la necesidad de una fuente de alto voltaje, esto se suma al costo y la complejidad del proceso6,13. El método AJS permitió obtener membranas de PLA al 10% con y sin TMD en una concentración 80:1 de una forma rápida, de sencilla y con un bajo costo económico, tal y como lo indica Medeiros y colaboradores quienes compararon la eficacia de los métodos AJS y electrohilado, concluyendo que el primer método logra crear una gama de micro y nanofibras a partir de diferentes soluciones de polímeros en el mismo rango de tamaño que las fibras hechas por electrohilado pero con mayor potencial para la ampliación comercial; debido a que el AJS se puede realizar a velocidades mucho más altas, no requiere de alto voltaje ni ningún colector conductor de electricidad, por lo cual, puede usarse para recubrir cualquier tipo de material con una gama más amplia de soluciones de polímeros, al no limitarse a disolventes con alta constante dieléctrica, también, no afecta negativamente a los polímeros sensibles al calor o al voltaje, como proteínas, etc. Otro aspecto importante, citado por Medeiros, es el hecho de que debe de haber una relación óptima entre la presión de flujo de gas, la velocidad de alimentación de la solución y la distancia de trabajo para que el solvente se evapore y forme fibras solidificadas en el colector, pues de lo contrario se da la formación de una película en lugar de las fibras14. Lo anterior, del mismo modo, fue analizado en un estudio realizado en la Universidad de Shangai que investigó las correlaciones entre la morfología de la fibra soplada en solución y los campos de flujo de aire turbulento anular bajo diferentes presiones de aire. Dicha investigación, indica que la velocidad relativa, la longitud del segmento recto del chorro de solución 37 de polímero, las fluctuaciones de velocidad, el movimiento de aleteo y la evaporación del solvente afectan la morfología final de la fibra en el soplado de la solución. Los diámetros de fibra se volvieron más uniformes y el diámetro promedio disminuyó al aumentar la presión del aire de entrada, sin embargo, los diámetros de fibra se redujeron ligeramente y se volvieron desiguales, acompañados por la aparición de algunas hebras de fibra15. Stojanovska y colaboradores, desarrollaron una lista de parámetros a considerar durante la elaboración de membranas y andamios por AJS, donde destacaron la concentración del polímero, la presión de aire, el diámetro de la boquilla eyectora, la distancia entre ésta y el colector12. En la presente investigación, se utilizó una presión de aire de 30 psi, un aerógrafo con una boquilla de salida de 0,3 mm apuntando a un colector que se encontraba a una distancia de 11 cm para disparar una solución polimérica de PLA al 10%, basándose en la metodología empleada por Suarez-Franco y colaboradores, quienes estudiaron la influencia de la concentración del PLA al 6%, 7% y 10% en la biocompatibilidad de las membranas, donde concluyeron que la mejor respuesta biológica en cuanto a adhesión y proliferación celular se obtuvo en la mayor concentración7. Con respecto a la concentración del medicamento en un estudio piloto previo, se determinó que la concentración 80:1 era la más favorable en cuanto a la estabilidad de las fibras y esto se evidenció en los resultados aquí expuestos, pues la microtopografía del grupo experimental y control mantuvieron características similares como la distribución aleatoria de fibrillas del polímero, orientadas en diversos planos y angulaciones, con un tamaño de fibra que no supera las 5 µm. Esto es favorable para la interacción celular con la membrana polimérica, de hecho, el PLA es un excelente biomaterial para conseguir dichas características y producir andamios para la regeneración de tejidos blandos, pero se ha debatido su uso para procedimientos de regeneración ósea por sus cualidades mecánicas, sin embargo, las críticas son realizadas cuando las membranas se han fabricado por medio de electrohilado y no AJS, siendo esta última técnica la que más favorece la deposición al azar, la morfología de las fibras, la formación de poros y el comportamiento de la solución polimérica para lograr mejores cualidades físico-mecánicas; no obstante, en el presente estudio se notó una 38 manipulación dificultosa de las muestras, por lo que futuros estudios deben centrarse en mejorar este aspecto, como lo cita Bharadwaz y colaboradores, quienes indican que para mejorar la resistencia mecánica de los andamios de PLA se ha optado por hacer mezclas con otras fibras poliméricas o modificar la estructura del polímero como tal29,30,31. 7.2 DSC y TGA: Las pruebas térmicas, permiten analizar el efecto de los componentes añadidos a una matriz polimérica confirmando la presencia de aditivos, rellenos e inclusive impurezas y contaminantes del proceso de fabricación. Las muestras se sometieron al análisis de DSC y lo primero que es fácil de observar es la ausencia del pico endotérmico característico del TMD reportado en la literatura, el cual se ubica en aproximadamente los 180 °C, esto podría deberse a la pérdida de la estructura cristalina del fármaco32, además, se identificó un cambio en la capacidad térmica de la mezcla polimérica, siendo mayor en el grupo experimental, por lo cual, se asume que el medicamento estaba incorporado de manera homogénea y estable en el sistema, tal como lo afirma Kumar y colaboradores, quienes al analizar los resultados del DSC aplicados en muestras de micro gel de alginato y gelatina cargados con TMD, también notaron la ausencia de este pico de la droga, con esto, indican que es producto de un posible blindaje del TMD por un complejo de inclusión fármaco-polímero33. En la presente investigación, es notable el cambio en el comportamiento termodinámico al comparar el grupo control con el experimental, tanto en el DSC como en el TGA, esto se debe a que un cambio en la masa de los materiales implica un cambio químico que es reflejado en las características termodinámicas23,34. En el TGA la presencia de TMD en el sistema, disminuye el To y Tp de la membrana de PLA 10%, comportamiento similar al estudio de Maubrouk y colaboradores, donde se valoró el efecto del TMD en cintas de poli(Ɛ-caprolactona)35, además el TGA demostró la eficacia del método de manipulación y producción de las muestras al no identificar impurezas del proceso. 39 7.3 FTIR Y UV-VIS: La incorporación de TMD en la membrana de PLA 10% fue evaluada mediante espectrometría infrarroja transformada de Fourier (FT-IR). Los resultados demuestran que la manipulación del polímero para la síntesis de las membranas no altera su composición. De igual forma, la incorporación del TMD es compatible con el sistema polimérico, y no altera el perfil infrarrojo, lo cual es coincidente con otros estudios que incorporaron la droga a una matriz polimérica33,34,36,37,38. Seguidamente, para comprobar que el TMD fue efectivamente cargado en las membranas se utilizó la prueba UV-VIS, con el objetivo de evidenciar la recuperación del medicamento mediante la hidrólisis del sistema. Según Küçük y Kadıoğlu, se logra determinar la presencia de TMD en metanol y agua por medio un espectrofotómetro ultra violeta a una longitud de onda de lectura de 271 nm39, mientras el PLA es medible a 230nm aproximadamente. En base a estos datos, se realizó una curva de calibración como se mencionó en la metodología. Fue posible identificar la presencia del TMD en las alícuotas recuperadas, específicamente 185,31  2,1 µG/mL, 180,80  15,27 µG/mL y 174,88  16 µG/mL para las 24, 48 y 72 horas respectivamente, lo que comprueba que el TMD fue efectivamente cargado en las membranas y puede ser recuperado mediante la hidrólisis del sistema. Futuros estudios analizarán la relación entre carga teórica y carga recuperada; así como la cinética de liberación en función del tiempo. Una limitante del presente estudio fue el uso de agua destilada grado 3, este tipo de agua presenta un pH entre los 5,0 y 7,5 en 25 °C según la norma ISO 3696 Standard40. El uso de una solución tampón puede afectar la liberación del TMD, por lo cual, futuros estudios deben valorar el comportamiento de la membrana con el fármaco en otros medios como la saliva y la sangre34. 7.4 Biocompatibilidad Para determinar la biocompatibilidad de las muestras, se optó por estudiar la citotoxicidad de las membranas de PLA al 10% y las de PLA al 10% con TMD por medio de pruebas de tinción para 40 cuantificar la adhesión y proliferación celular, esto está influido por el medio en el que se encuentran las células y éste debe de asemejar a la microarquitectura de la MEC, por lo cual, las matrices poliméricas deben de proveer un medio ambiente que permita estos comportamientos dinámicos de las células a través de nanoporos y fibras morfológicamente compatibles con los requisitos mecánicos mínimos7,41,42. La biocompatibilidad de los andamios de PLA no está en discusión, Granados- Hernández y colaboradores utilizaron células estromales mesenquimales de médula ósea humana en andamios de PLA al 10% realizadas por AJS y sus resultados mostraron que durante todos los tiempos de cultivo celular no hubo citotoxicidad, por el contrario, mostraron una buena respuesta de biocompatibilidad con el material. Diversos estudios han utilizado una metodología similar a la expuesta en el presente documento para analizar el comportamiento celular al contacto prolongado con matrices poliméricas a base de PLA, por medio del uso de una línea de osteoblastos fetales humanos y la prueba de tinción cristal violeta, la cual permite evaluar la citotoxicidad de las membranas al detectar únicamente las células vivas, debido a que el colorante se une a la cromatina y al núcleo de ellas. Se buscó comparar el comportamiento celular, de manera que la presencia de TMD no disminuyera la adhesión ni la proliferación de los osteoblastos en las matrices poliméricas, se valoraron a las primeras horas de exposición y al obtener un resultado favorable se procedió a realizar otra cuantificación a las 24 horas. Los resultados muestran un crecimiento amplio en el caso del PLA solo y un ligero incremento en el caso de las membranas con TMD 80:1, de esta manera se puede concluir que las muestras con TMD en su primer contacto con las células no generan una respuesta de citotoxicidad, las células se mantuvieron vivas sobre la membrana y muestran un ligero crecimiento, lo que descarta la citotoxicidad y esto permitió seguir con las evaluaciones a mayor tiempo; lo cual fue semejante a las interpretaciones de otras investigaciones en andamios realizados con el mismo polímero pero sin la carga farmacológica con la que aquí se produjeron43,44. Se realizaron ensayos biológicos para determinar si el TMD afectaba la adhesión celular sobre la superficie de las membranas, para lo cual, se hicieron evaluaciones a las 24 y 48 horas en 41 condiciones estándar de cultivo celular y no se encontraron diferencias entre los grupos. Para determinar lo anterior, se usó la prueba de tinción de rezasurina, éste es un buen método de amplio uso para valorar adhesión celular por su permeabilidad no tóxica a las células, también es un indicativo de vitalidad celular, pues necesita ser reducido en las mitocondrias a resorufina, compuesto que brinda el color rosa característico45, por lo tanto, las membranas cargadas con TMD nuevamente mostraron ser biocompatibles debido a que la adhesión celular se mantuvo y fue igual al de las membranas control, esto indica que no afectan el microambiente ni la supervivencia celular y pueden ser usadas de forma segura. Para poder observar la interacción que tienen las células sobre las membranas con y sin fármaco, se llevó a cabo una evaluación por microscopia de fluorescencia. Esta técnica permite evaluar no solo la presencia o ausencia de viabilidad de las células sobre las membranas, sino también, su distribución y morfología. Debido a que el CellTracker™ tiene afinidad por los lípidos, la tinción solo emitirá su señal al unirse a la membrana celular intacta. En las microfotografías, se observó presencia y viabilidad celular a las 48hrs posteriores al cultivo y se mantiene entre el grupo control y experimental, lo cual, coincide con las evaluaciones previas de biocompatibilidad. Además, podemos identificar la posición y distribución homogénea de las células sobre las membranas, la morfología hexagonal característica de los osteoblastos, además se observa que comienzan a presentar prolongaciones citoplasmáticas para empezar a interactuar con las células vecinas por medio de sus lamelipodios, todo lo anterior, indica que la membrana con TMD 80:1 permite un crecimiento igual o similar al de la membrana sin fármaco. Lo cual, permite concluir que esta membrana puede ser usada de forma segura a nivel biológico y no tendrá un impacto negativo en el microambiente celular13,42,43. Un aspecto clave para lograr los resultados obtenidos en cuanto a biocompatibilidad, fue la dosificación baja de TMD presente en las membranas, no solo por su efecto en la morfología de las matrices poliméricas, sino también, por los resultados obtenidos en biocompatibilidad, pues, según 42 dos Santos, en su estudio sobre hidrogeles para administración de TMD, a mayores concentraciones del fármaco mayor potencial citotóxico in-vitro y este efecto nocivo podría ser atenuado por el medio que se utiliza para transportar el fármaco46, por lo cual, el PLA podría estar contrarrestando la citotoxicidad del medicamento y esto podría explicar la razón por la que el grupo experimental no tuvo un incremento tan amplio en la proliferación celular como el grupo control, pero que a fin de cuentas si aumentó pero de forma ligera. Futuras investigaciones deberán analizar si la dosis de TMD en las membranas es suficiente para lograr los efectos clínicos deseables. 43 8. Conclusión Con las limitaciones del presente estudio, se logra concluir que es posible producir membranas de PLA al 10% cargadas con TMD en una concentración 80:1 por técnica AJS con características físico químicas aceptables y que éstas cumplan con biocompatibilidad y liberación del fármaco; con lo cual se rechaza la hipótesis nula planteada. Futuros estudios deben centrarse en su acción terapéutica, asimismo, evaluar y fortalecer las cualidades físico-mecánicas para su posible uso como sustituto de membranas de regeneración ósea guiada. 44 9. Referencias bibliográficas 1-Scheller, E. L., Krebsbach, P. H., & Kohn, D. H. (2009). Tissue engineering: state of the art in oral rehabilitation. Journal of oral rehabilitation, 36(5), 368-389. 2-Lu, Y., Aimetti, A. A., Langer, R., & Gu, Z. (2016). Bioresponsive materials. Nature Reviews Materials, 2(1), 1-17. 3- Schenk, R. K., Buser, D., Hardwick, W. R., & Dahlin, C. (1994). 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