UNIVERSIDAD DE COSTA RICA FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS ESCUELA DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS Proyecto final de graduación presentado a la Escuela de Tecnología de Alimentos para optar por el grado de Licenciatura en Ingeniería de Alimentos Evaluación del potencial de inhibición de diferentes antimicrobianos sobre el crecimiento de Alicyclobacillus acidoterrestris en jugos de naranja del mercado costarricense Paola María Gamboa Moreno Carné: B42706 Ciudad Universitaria Rodrigo Facio Junio, 2020 i Tribunal Examinador Trabajo Final de Graduación presentado a la Escuela de Tecnología de Alimentos como requisito parcial para optar por el grado de Licenciatura en Ingeniería de Alimentos. Aprobado por: ________________________________________ PhD. Natalia Barboza Vargas Presidenta del Tribunal ________________________________________ PhD. Eric Wong Gonzalez Profesor Designado ________________________________________ PhD. Jessie Usaga Barrientos Directora del Proyecto _______________________________________ PhD., MADE, Óscar Acosta Montoya Asesor del Proyecto ________________________________________ Lic. Gabriela Davidovich Young Asesora del Proyecto ii Dedicatoria A Dios y a mi familia, gracias por siempre estar conmigo. “Nada te turbe, nada te espante, todo se pasa, Dios no se muda. La paciencia todo lo alcanza, quien a Dios tiene, nada le falta. Solo Dios basta.” Santa Teresa de Ávila iii Agradecimientos Agradezco a Dios, por sus incontables bendiciones y su infinito amor. Gracias por darme esta oportunidad. Gracias por darme la fuerza, la perseverancia y la valentía para culminar esta etapa de mi vida. Gracias por todos los ángeles que has puesto en mi camino. Gracias a mis papás, por darme apoyo, escucha y sobretodo tiempo. Gracias por las noches, fines de semana y feriados que pasamos en el laboratorio. Gracias por aprender sobre mi trabajo y ayudarme con todo lo que podían. Gracias por su amor incondicional. Este logro es nuestro, de los tres, como siempre. Gracias a Esteban por siempre creer en mí y mantenerme positiva hasta en los peores momentos. Te amo. Gracias a Eri, mi amiga de toda la U, por acompañarme y motivarme siempre. Gracias a Corderito por ayudarme siempre sin esperar nada a cambio y por alegrar mis días en el laboratorio. Gracias a Ale por la disposición a ayudarme en todo momento y por alivianarme la carga cuando lo necesitaba. Gracias a Steph por escucharme siempre y por recibir mis juguitos en planta. Gracias a Mike por ayudarme a llevar naranjas a planta. Gracias a Luis por almorzar conmigo cuando no había nadie en la U. Gracias a Feli por preocuparse por cómo andaba la tesis. Y gracias a todos por ser parte de mi tiempo en la U. Me llevo muchos recuerdos lindos con ustedes. Los quiero mucho. Gracias a Esther, por las muchas conversaciones que tuvimos en momentos de crisis. Creo que ambas obtuvimos mucha motivación de ahí cuando lo necesitábamos. Gracias a Jessica, por instruirme en la tesis y por siempre atender mis dudas, aunque fuese mucho tiempo después de haber terminado la U. Y gracias a Cata y a Gaby por toda su ayuda en el laboratorio. Gracias a la profe Gabriela por atender mis inquietudes amablemente y lo más rápido posible y por colaborar para que siempre pudiera avanzar satisfactoriamente con mi proyecto. Gracias a los profes Jessie y Óscar por todos los mensajes y llamadas que me contestaron, aunque fuera fin de semana. Gracias por siempre resolver y ayudarme a encontrar opciones cuando no las veía. Gracias por escucharme cuando sentía que estaba muy cansada y por comprender cuando algo no salía bien. Y, por último, muchas gracias por todas las oportunidades que me abrieron a lo largo de este año, que sin duda me han hecho crecer mucho como persona y profesional. Gracias a Vanny por escucharme tantas veces, gracias por los consejos y la amabilidad siempre. Gracias a Laura por ayudarme a lavar, autoclavar, hacer medios y cuanta emergencia tuviera. Gracias a las dos por hacer que trabajar en el laboratorio de micro siempre fuese una grata experiencia. Gracias a Alonso, Camacho, Luis y Giova por ser siempre tan serviciales y amables. Gracias a todo personal del laboratorio de Química del CITA. Y gracias a todos los profesores que tuve durante mi carrera, sé que llevo una educación envidiable conmigo. iv Índice General Tribunal Examinador ............................................................................................................... i Dedicatoria.............................................................................................................................. ii Agradecimientos .................................................................................................................... iii Índice de Figuras .................................................................................................................. vii Índice de Cuadros ................................................................................................................ viii Resumen ................................................................................................................................ ix Abreviaciones y definiciones................................................................................................. xi 1. Justificación ..................................................................................................................... 1 2. Objetivos ......................................................................................................................... 4 2.1. Objetivo General ...................................................................................................... 4 2.2. Objetivos Específicos............................................................................................... 4 3. Marco Teórico ................................................................................................................. 5 3.1. Generalidades de los jugos de naranja y su industria .............................................. 5 3.1.1. Principales características del jugo de naranja ...................................................... 5 3.1.2. Industria nacional e internacional de jugo de naranja ........................................... 6 3.2. Generalidades sobre Alicyclobacillus acidoterrestris y su efecto en jugos ............. 7 3.2.1. Principales características de A. acidoterrestris ............................................... 7 3.2.2. Alicyclobacillus acidoterrestris en la industria de jugos y bebidas .................. 8 3.3. Principales factores que afectan el crecimiento de A. acidoterrestris ..................... 9 3.3.1. Temperatura de almacenamiento ...................................................................... 9 3.3.2. pH ................................................................................................................... 10 3.3.3. Contenido de sólidos solubles (grados Brix) .................................................. 11 3.3.4. Espacio de cabeza y oxígeno disponible ........................................................ 11 3.4. Uso de antimicrobianos en jugos para inhibir el crecimiento de A. acidoterrestris.... ............................................................................................................... 12 3.4.1. Benzoato de sodio y su efecto sobre A. acidoterrestris .................................. 12 3.4.2. Sorbato de potasio y su efecto sobre A. acidoterrestris ................................. 13 3.4.3. Nisina y su efecto sobre A. acidoterrestris ..................................................... 13 v 4. Materiales y Métodos .................................................................................................... 14 4.1. Localización ........................................................................................................... 14 4.2. Selección de los jugos del mercado costarricense por analizar ............................. 15 4.3. Elaboración de jugos de naranja en planta piloto .................................................. 20 4.4. Caracterización fisicoquímica de los jugos de naranja .......................................... 22 4.4.1. Determinación de pH ...................................................................................... 22 4.4.2. Determinación de acidez total ........................................................................ 22 4.4.3. Determinación de sólidos solubles ................................................................. 23 4.4.4. Determinación de polifenoles totales ............................................................. 23 4.4.5. Determinación de ácido ascórbico y vitamina C ............................................ 23 4.5. Evaluación del crecimiento de A. acidoterrestris en cinco jugos de naranja seleccionados .................................................................................................................... 23 4.5.1. Cepa utilizada para la inoculación de los jugos .............................................. 23 4.5.2. Preparación del inóculo .................................................................................. 23 4.5.3. Tratamiento de las muestras y su inoculación ................................................ 24 4.5.4. Muestreos periódicos de A. acidoterrestris en los jugos de naranja .............. 25 4.5.5. Recuento de A. acidoterrestris en los jugos de naranja .................................. 26 4.6. Comparación del efecto de los antimicrobianos seleccionados sobre la sobrevivencia de A. acidoterrestris en jugo de naranja .................................................... 26 4.6.1. Proveedor y concentración de nisina .............................................................. 26 4.6.2. Proveedor y concentración de benzoato de sodio ........................................... 26 4.6.3. Proveedor y concentración de sorbato de potasio .......................................... 26 4.6.4. Tratamiento de las muestras e inoculación ..................................................... 27 4.6.5. Muestreos periódicos y recuentos de A. acidoterrestris en los jugos de naranja con los diferentes preservantes ...................................................................................... 28 4.7. Efecto de la variación en la concentración de nisina sobre el crecimiento de A. acidoterrestris en jugo de naranja..................................................................................... 28 4.7.1. Tratamiento de las muestras e inoculación ..................................................... 28 4.7.2. Muestreos periódicos y recuento de A. acidoterrestris en los jugos de naranja con diferentes concentraciones de nisina ...................................................................... 28 4.8. Diseño Experimental y Análisis Estadístico .......................................................... 29 4.8.1. Análisis Estadístico Aplicado al Objetivo 1 ................................................... 29 4.8.2. Análisis Estadístico Aplicado a los Objetivos 2 y 3 ....................................... 30 vi 5. Resultados y Discusión ................................................................................................. 32 5.1. Objetivo Específico 1: “Determinar las cinéticas de sobrevivencia de A. acidoterrestris en seis jugos de naranja del mercado costarricense” ................................ 32 5.2. Objetivo Específico 2: “Comparar el efecto de diferentes preservantes sobre la sobrevivencia de A. acidoterrestris en jugo de naranja” .................................................. 38 2.1. Objetivo Específico 3: “Estudiar el efecto de la concentración de nisina sobre la sobrevivencia de A. acidoterrestris en jugo de naranja” .................................................. 42 6. Conclusiones ................................................................................................................. 44 7. Recomendaciones .......................................................................................................... 45 8. Bibliografía.................................................................................................................... 46 9. Anexos ........................................................................................................................... 57 vii Índice de Figuras Figura 1. Flujo de proceso de elaboración de jugo de naranja estable a temperatura ambiente a partir de jugo de naranja obtenido de la empresa Natufruit (Worsfold, 2019). ............. 20 Figura 2. Flujo de proceso de elaboración de jugo de naranja estable a temperatura ambiente a partir de naranjas frescas. ............................................................................................... 21 Figura 3. Cinéticas de sobrevivencia de Alicyclobacillus acidoterrestris en seis jugos de naranja del mercado costarricense almacenados a 45 ± 2°C durante 21 días. .................. 35 Figura 4. Cinéticas de sobrevivencia de Alicyclobacillus acidoterrestris en jugo de naranja Tropicana Grovestand con diferentes antimicrobianos durante 22 días de almacenamiento a 45 ± 2°C. ........................................................................................................................ 39 Figura 5. Cinéticas de sobrevivencia de A. acidoterrestris en jugo de naranja Tropicana Grovestand con diferentes concentraciones de nisina durante 22 días de almacenamiento a 45 ± 2°C ............................................................................................................................ 43 Figura 6. Incubadora a (45 ± 2) °C con jugos para el análisis periódico a de A. acidoterrestris. ........................................................................................................................................... 57 Figura 7. Cámara de flujo laminar durante el llenado de botellas de jugo de naranja (objetivo 2). ...................................................................................................................................... 57 Figura 8. Ejemplo de placas luego de una prueba confirmatoria incubadas a 45 ± 2 °C durante 18 – 20 horas. .................................................................................................................... 58 Figura 9. Ejemplo de placas luego de una prueba confirmatoria incubadas a 65 ± 2 °C durante 18 – 20 horas. .................................................................................................................... 58 Figura 10. Recuentos de la dilución 10-1 del día 0 de una repetición del objetivo 3 (tratamientos en orden descendente: nisina (0.006%), nisina (0.003%), nisina (0.0015%), nisina (0.00075%) y control positivo). ............................................................................. 59 Figura 11. Células vegetativas y esporas de A. acidoterrestris vistas a través de un microscopio luego de realizar una tinción de Gram. ........................................................ 60 viii Índice de Cuadros Cuadro I. Nombre, marca, ingredientes, temperatura de almacenamiento y concentración de vitamina C de los jugos de naranja encontrados en el mercado costarricense entre enero y febrero del 2019………………………………………………………………………….16 Cuadro II. Frecuencia con la que se encuentran los jugos de naranja de cinco supermercados diferentes (en dos de sus localidades) de Costar Rica entre enero y febrero del 2019…….18 Cuadro III. Caracterización fisicoquímica de los seis jugos de naranja utilizados en el estudio de sobrevivencia de A. acidoterrestris (valor promedio ± desviación estándar, n = 3)…………………………………………………………………………………………32 Cuadro IV. Población estabilizada y tiempo necesario para alcanzar una población de 5 logaritmos de A. acidoterrestris en cinco jugos de naranja del mercado costarricense almacenados a 45 ± 2°C durante 21 días………………………………………………….36 ix Resumen Gamboa Moreno, Paola María Evaluación del potencial de inhibición de diferentes antimicrobianos sobre el crecimiento de Alicyclobacillus acidoterrestris en jugos de naranja del mercado costarricense Tesis de Licenciatura en Ingeniería de Alimentos. – San José, Costa Rica. Gamboa Moreno, P., 2020. 72 h.: 11 il. – 88 refs. Este trabajo tuvo como propósito analizar el efecto de diferentes antimicrobianos como agentes de inhibición del crecimiento de Alyciclobacillus acidoterrestris en jugos de naranja del mercado costarricense. Se eligieron cuatro jugos comerciales disponibles en diferentes supermercados del país (dos estables a temperatura ambiente y dos pasteurizados refrigerados) y se elaboraron dos jugos, uno a partir de pulpa comercial de naranja y otro a partir de naranjas frescas, ambos estables a temperatura ambiente. Se llenó una botella por cada jugo y para cada punto de muestreo (espacio de cabeza = 40%) y cada una se inoculó con A. acidoterrestris en una población de 102-103 UFC/ml, luego de aplicarle un choque térmico (75°C durante 20 minutos). Todas las botellas se incubaron a (45 ± 2) °C y se realizaron recuentos del microorganismo por el método de vaciado, periódicamente, en placas de Petri con agar YSG (yeast starch glucose) acidificado a un pH de 3,7 ± 0,1. Dichas placas se incubaron a (45 ± 2) °C por 3 días. Además, los jugos se caracterizaron fisicoquímicamente en términos de sólidos solubles (°Brix), pH, vitamina C, acidez total y contenido de polifenoles totales. Posteriormente, se eligió el jugo en el cual el microorganismo creció con mayor rapidez para así comparar el efecto de diferentes antimicrobianos sobre su crecimiento. Se agregó benzoato de sodio (0,1%), sorbato de potasio (0,1%), una mezcla de benzoato de sodio y sorbato de potasio (cada uno al 0,05%) y nisina (0,006%) previo al llenado de las botellas con el jugo y el resto del procedimiento se mantuvo igual. Además, se evaluaron concentraciones de 0,003%, 0,0015% y 0,00075% de nisina. Todos los análisis se realizaron por triplicado y se analizaron estadísticamente. x Se observó el crecimiento de A. acidoterrestris en todos los jugos evaluados, alcanzando una población de hasta siete logaritmos en menos de una semana, excepto en la muestra elaborada a partir de pulpa comercial. Dado que las características fisicoquímicas de todos los jugos son muy similares, se cree que en el jugo de pulpa comercial existe un componente altamente inhibitorio para el microorganismo, el cual aún no se conoce. En el caso de los antimicrobianos, se observó un efecto bacteriostático sobre A. acidoterrestris en todos los tratamientos, luego de comparar las poblaciones iniciales y finales en cada uno de ellos y no encontrar diferencias significativas entre las mismas (P > 0,05). Al reducir la concentración de nisina a 0,003%, 0,0015% y 0,00075%, todas las concentraciones excepto la de 0,003% presentaron diferencias significativas entre sus poblaciones iniciales y finales (0,06%: ( P = 0,0311), 0,0015%: (P = 0,0016), y 0,0075%: (P = 0,0022)). Sin embargo, la tendencia a la disminución de la población en todos los casos fue muy leve y no se obtuvieron diferencias significativas entre las poblaciones finales de A. acidoterrestris en las diferentes concentraciones evaluadas (P = 0,9469 y valor β = 0,82). Con los resultados obtenidos, se demuestra que A. acidoterrestris puede crecer y deteriorar jugos de naranja comúnmente encontrados en el mercado costarricense. Sin embargo, el uso de los antimicrobianos evaluados representa una alternativa para evitar este inconveniente. JUGO DE NARANJA, ANTIMICROBIANOS, INHIBICIÓN, ALICYCLOBACILLUS ACIDOTERRESTRIS PhD. Jessie Usaga Barrientos Escuela de Tecnología de Alimentos xi Abreviaciones y definiciones %: Porcentaje A. acidoterrestris: Alicyclobacillus acidoterrestris AAM: Alicyclobacillus acidocaldarius medium (Medio Alicyclobacillus acidocaldarius) ANDEVA: Análisis de varianza CITA: Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de alimentos COMIECO: Consejo de Ministros de Integración Económica EFJA: European Fruit Juice Association (Asociación Europea de Jugos de Frutas) FAO: Food and Agriculture Organization (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura) g: gramo HCl: Ácido clorhídrico ICMSF: International Commission on Microbiological Specifications for Foods (Comisión Internacional de Especificaciones Microbiológicas para Alimentos) JFJA: Japan Fruit Juice Association (Asociación Japonesa de Jugos de Frutas) kg: kilogramo mg: miligramo ml: mililitro OMS: Organización Mundial de la Salud PROCOMER: Promotora del Comercio Exterior de Costa Rica RTCA: Reglamento Técnico Centroamericano SEPSA: Secretaría Ejecutiva de Planificación Sectorial Agropecuaria UFC/ml: Unidades formadoras de colonia por mililitro UI: Unidades Internacionales USDA: United States Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos) USEPA: United States Environmental Protection Agency (Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos) YSG: Yeast Starch Glucose 1 1. Justificación Los jugos y concentrados de frutas son parte importante de la economía costarricense, dado que en el 2017 aportaron el 2% del total de las exportaciones del país (PROCOMER, 2018). Además, en este mismo año el jugo de naranja se posicionó entre los primeros 20 productos más exportados de la industria agropecuaria (SEPSA, 2018). Debido a que este producto se exporta principalmente a países de la Unión Europea y Estados Unidos, es de suma importancia cumplir con los estándares de calidad exigidos por estas regiones (PROCOMER, 2018). Los jugos, en general, son productos muy estables gracias su alta acidez, que permite eliminar los patógenos y microorganismos acidófilos por medio de tratamientos térmicos (Smit et al., 2011; Steyn et al., 2011). Hasta la década de 1980 el desarrollo de bacterias formadoras de esporas en productos de alta acidez se consideraba insignificante porque se asumía que bacterias Gram positivas formadoras de esporas no eran capaces de germinar y crecer en medios de pH menor a 4,5. Sin embargo, en 1982 ocurrió la primera contaminación a gran escala con A. acidoterrestris en jugo de manzana (pH = 3,15) pasteurizado en Alemania (Cerny, et al., 1984). Posteriormente, surgieron casos similares en diferentes partes del mundo como Japón, Estados Unidos y Australia. Por lo tanto, desde hace dos décadas el deterioro de jugos por parte de Alicyclobacillus sp. se ha convertido en un tema de relevancia para la industria productora de jugos (Chang y Kang, 2004; Walker y Phillips, 2008a; Smit et al., 2011; Steyn et al., 2011; Tianli et al., 2014). Alicyclobacillus acidoterrestris posee la capacidad de formar esporas termorresistentes que le permiten sobrevivir a los tratamientos térmicos normalmente aplicados a los jugos (Steyn et al., 2011; Tianli et al., 2014). Además, sus esporas pueden germinar en medios con sólidos solubles menores a 18° Brix, puede crecer en ambientes con un pH entre 2,5 y 6,0 y temperaturas entre 25 y 60°C (Sinigaglia et al., 2003; Bevilaqua et al., 2008a). Todas estas son condiciones que podrían encontrarse en jugos de naranja. Además, es fácil que este microorganismo pueda llegar a contaminar este tipo de jugos ya que esta bacteria normalmente se encuentra en la tierra (Chang y Kang, 2004). De hecho, se han encontrado esporas de Alicyclobacillus sp. en naranjas que se han muestreado en diferentes industrias procesadoras de jugo de naranja (Parish y Goodrich, 2005). Entonces, 2 la insuficiencia de los tratamientos térmicos aplicados en jugos para eliminar las esporas de esta bacteria, las características fisicoquímicas del jugo de naranja idóneas para su crecimiento y la posibilidad de que las naranjas se contaminen desde su cosecha hacen que esta matriz sea de especial interés en relación con este microorganismo. Por esta razón, previo a esta investigación se ha estudiado la viabilidad del crecimiento de esta bacteria en jugos de naranja y se ha comprobado la posibilidad de su desarrollo (Pettipher et al., 1997; Eiroa et al., 1999; Komitopoulou, 1999; Sinigaglia et al., 2003; Gocmen et al., 2005; Rivera, 2009; Pérez-Cacho, 2011; Kakagianni et al., 2018). Esto reafirma la importancia del estudio del comportamiento de este microorganismo en jugos de naranja comercializados en Costa Rica, enfocado específicamente en estrategias potenciales que podrían inhibir su desarrollo en esta matriz alimentaria. El deterioro causado por A. acidoterrestris es particularmente difícil de detectar de forma visual, ya que el jugo suele parecer normal. Algunas veces puede observarse un leve sedimento, pero la principal evidencia del deterioro es un olor desagradable descrito como medicinal. Esto es consecuencia de la producción de guayacol, 2,6-dibromofenol y 2,6- diclorofenol por parte de la bacteria, siendo el guayacol el más importante de los tres (Gocmen et al., 2005, Kumar et al., 2013). Según Pettipher y otros (1997), a partir de una concentración de 2 µg/l de guayacol, se detectaron cambios en el sabor de jugos de naranja y manzana, para lo cual se necesitó una población de 1 x 105 UFC/ml de A. acidoterrestris. Lo mismo se reportó en otro estudio realizado con jugo de toronja, naranja y manzana, en los cuales luego de alcanzarse una población de 1 x 105 UFC/ml se detectaron cambios sensoriales (Komitopoulou et al., 1999). En ambos estudios la detección del deterioro se realizó de manera cualitativa. Sin embargo, en un estudio realizado con un panel sensorial entrenado se confirmó que el umbral de reconocimiento para el olor del guayacol en jugo de naranja es de 2 µg/l (Pérez-Cacho et al., 2011). Por lo tanto, aunque no se realice la cuantificación de guayacol en los jugos, posiblemente si se alcanzan poblaciones iguales o mayores a 1 x 105 UFC/ml, estos presentarán cambios sensoriales indeseables. En cuanto a los factores que afectan el crecimiento de A. acidoterrestris, se ha observado que jugos con mayor cantidad de polifenoles, como el jugo de uvas rojas, 3 presentan un efecto inhibitorio en el desarrollo de esta bacteria (Splittstoesser et al., 1994). Además, se ha determinado que a partir de una concentración de sólidos solubles de 18 °Brix se inhibe su crecimiento y que al aumentar la concentración de sólidos solubles, la fase de adaptación de la bacteria se torna más larga (Splittstoesser et al., 1994; Peña et al., 2011). Por otra parte, según el pH del medio, su crecimiento es más o menos pronunciado (Kakagianni et al., 2018). Es por esto que es importante conocer todas estas características de los jugos estudiados, de manera que se pueda hacer un análisis más profundo y valioso de los resultados obtenidos en relación con el comportamiento de la bacteria. Como respuesta al deterioro de esta bacteria en jugos de naranja, la presente investigación evaluó el efecto del uso de antimicrobianos para la inhibición del crecimiento de A. acidoterrestris. El benzoato de sodio y sorbato de potasio son sales que al disociarse en medios ácidos actúan sobre las paredes celulares e inhiben la actividad de enzimas que participan en la fosforilación oxidativa de los microorganismos (Belitz et al., 2009). Previamente se ha estudiado su efecto sobre A. acidoterrestris en caldo extracto de malta y en jugo de manzana y se ha observado un efecto bacteriostático en concentraciones entre 500 y 1000 ppm (Bevilacqua et al., 2008b; Walker y Phillips, 2008b). Sin embargo, no se ha encontrado un estudio de estos antimicrobianos o de una mezcla de ambos en jugo de naranja propiamente. Por su parte, existen tendencias actuales a consumir productos con menos aditivos sintéticos, por lo que también se consideró relevante estudiar el potencial efecto inhibitorio de la nisina (Bevilacqua et al., 2008b). Este compuesto es una bacteriocina, que se define como un péptido producido por bacterias que tiene un efecto antimicrobiano (Cleveland et al., 2001). En el Reglamento Técnico Centroamericano (RTCA) y en el CODEX Alimentarius se ha regulado su uso en varios productos, sin embargo, en jugos aún no (COMIECO, 2012; FAO y OMS, 2018), pese a que algunas casas comerciales proveedoras del antimicrobiano proporcionan recomendaciones de uso del aditivo en jugos y bebidas a base de frutas. Por lo tanto, los resultados obtenidos podrían ser de utilidad para su aprobación y regulación en este tipo de productos. En este caso, sí se ha estudiado el efecto de la nisina sobre A. acidoterrestris en jugo de naranja y se ha encontrado que logra inhibir su crecimiento (Komitupoulou et al., 1999; Yamazaki et al., 2000; Peña y Rodriguez, 2006). https://onlinelibrary-wiley-com.ezproxy.sibdi.ucr.ac.cr/doi/full/10.1111/j.1365-2621.2006.01427.x#b57 https://onlinelibrary-wiley-com.ezproxy.sibdi.ucr.ac.cr/doi/full/10.1111/j.1365-2621.2006.01427.x#b57 4 Sin embargo, uno de los objetivos de este proyecto es comparar su efectividad en relación con la del benzoato de sodio y el sorbato de potasio que son los preservantes más comúnmente utilizados en la industria alimentaria, de manera que los productores de jugos puedan tener una mejor referencia para elegir entre estas tres alternativas. Además, resulta importante identificar si la concentración sugerida por proveedores comerciales podría reducirse y aún observase un efecto inhibitorio. A la fecha no se encuentra información en la literatura sobre la incidencia de A. acidoterrestris en jugos y bebidas costarricenses. Sin embargo, en el marco de un trabajo final de graduación ejecutado previo a este estudio, Worsfold (2019) reportó un comportamiento interesante en jugos de naranja analizados, dado que la bacteria creció considerablemente en un jugo de naranja comercial pero no así en un jugo de naranja elaborado propiamente para el estudio y a nivel de planta piloto. Lo anterior señala la posibilidad de que el comportamiento de esta bacteria varíe según las diferentes características del jugo de naranja y justifica, por ende, continuar el estudio de su comportamiento en jugos de naranja del mercado costarricense. 2. Objetivos 2.1. Objetivo General • Analizar el efecto de diferentes antimicrobianos como agentes de inhibición del crecimiento de Alicyclobacillus acidoterrestris en jugos de naranja del mercado costarricense. 2.2. Objetivos Específicos • Determinar las cinéticas de sobrevivencia de Alicyclobacillus acidoterrestris en seis jugos de naranja del mercado costarricense. • Comparar el efecto de diferentes preservantes (benzoato de sodio, sorbato de potasio, una mezcla de ambos y nisina) sobre la sobrevivencia de Alicyclobacillus acidoterrestris en el jugo de naranja analizado que haya presentado un mayor potencial de deterioro. 5 • Estudiar el efecto de la concentración de nisina sobre la sobrevivencia de Alicyclobacillus acidoterrestris en el jugo de naranja analizado que haya presentado un mayor potencial de deterioro. 3. Marco Teórico 3.1. Generalidades de los jugos de naranja y su industria 3.1.1. Principales características del jugo de naranja Los jugos se definen como líquidos fermentables, pero no fermentados, obtenidos de partes comestibles de frutas apropiadamente maduras y frescas o mantenidas frescas por medios físicos o tratamientos adecuados (ICMSF, 2005). Normalmente presentan valores de pH menores a 4,0 lo que impide el desarrollo de gran parte de microorganismos excepto mohos, levaduras y bacterias ácido lácticas que son ácido tolerantes. Sin embargo, estos microorganismos y otros que podrían ser patógenos son fáciles de eliminar con los tratamientos térmicos moderados normalmente aplicados en la industria alimentaria (Smit et al., 2011; Walker y Phillips, 2008a; Steyn et al., 2011). En el caso de los jugos de frutas, normalmente se aplican dos tipos de tratamientos térmicos. Los tratamientos térmicos que le permiten al jugo ser estable a temperatura ambiente y los tratamientos térmicos que aseguran la ausencia de microorganismos patógenos, pero requieren de otra barrera como la refrigeración para alargar su vida útil. Los primeros son más severos y pueden involucrar una mayor pérdida de nutrientes, pero su costo de comercialización es menor dado que no requieren ser refrigerados (Petruzzi et al., 2017). Por lo tanto, las cualidades buscadas en el producto final determinan el tipo de tratamiento térmico que se aplica a cada jugo. El jugo de naranja se puede obtener a partir de diferentes variedades de esta fruta. Sin embargo, esto no incide considerablemente en las variaciones de las características fisicoquímicas de los jugos. En un estudio realizado con jugos elaborados a partir de naranjas de siete variedades distintas, se determinó que estos poseían valores de pH entre 3,81 y 4,31, sólidos solubles entre 8,7 y 10,8° Brix y acidez titulable entre 5,12 y 7,04 g de ácido cítrico/l de jugo (Niu et al., 2008). En el caso de los jugos de naranja reconstituidos a partir de jugos concentrados, la Norma General del Codex para Zumos (Jugos) y Néctares de Frutas 6 (CODEX STAN 245-2005) establece que los mismos deben poseer una concentración de sólidos solubles entre 11,2 y 11,8 grados Brix. A su vez, la Administración de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos (USDA) (2019) define los jugos de naranja a partir de concentrado como el alimento preparado al mezclar agua con jugo de naranja concentrado congelado, jugo de naranja concentrado o ambos, al cual se le pueden agregar jugo de naranja, jugo de naranja concentrado, jugo de naranja pasteurizado, aceite esencial de naranja, pulpa de naranja y uno o más endulzantes y cuya concentración de sólidos solubles es de mínimo 11,8 ° Brix. A diferencia de jugos como el de manzana, el jugo de naranja no necesita de una clarificación o filtración ya que es un jugo que su turbidez es deseada por el consumidor. Las variaciones en la cantidad de pulpa se ajustan con despulpadoras o por centrifugación según sea la cantidad deseada (Cautela et al., 2010). Sin embargo, enzimas como la pectinmetilestearasa actúan sobre la pectina presente en jugo, formando pectatos de calcio insolubles que desestabilizan la matriz y propician una separación de las fases del jugo. La inactivación de esta enzima se logra con tratamientos térmicos, que varían según la variedad de la naranja (Sentandreu et al., 2011). Este jugo es reconocido por sus propiedades nutricionales, ya que se ha observado que el consumo de jugo de naranja 100% se relaciona con una menor cantidad de colesterol y de lipoproteínas de baja densidad, además de reducir el riesgo de obesidad y el aumento en la prevalencia del cumplimiento de la cantidad necesaria de nutrientes claves en la dieta (O’ Neil et al., 2012). Además, es una fuente importante de vitamina C, la cual es un importante compuesto bioactivo. Dicha vitamina se degrada fácilmente, sin embargo, se han estudiado y modelado los diferentes factores que aceleran este proceso (Zhang et al., 2016). De manera que se puede adicionar al jugo vitamina C para suplir estas pérdidas y a su vez se pueden minimizar estos factores. 3.1.2. Industria nacional e internacional de jugo de naranja Normalmente el jugo de naranja se produce como concentrado para ser exportado. Los mayores productores de jugo de naranja concentrado (65° Brix) a nivel mundial son Brasil, México y Estados Unidos, en ese orden. Brasil es el claro dominante, al producir más del doble de lo que produce Estados Unidos. En los últimos cinco años, no se ha encontrado 7 una tendencia hacia el aumento o disminución de la producción mundial, sino que ha estado aumentando y disminuyendo sin seguir un patrón (USDA, 2019). Los principales consumidores de jugo de naranja a nivel mundial son los países de la Unión Europea, Estados Unidos y China. Sin embargo, se ha dado una tendencia a la disminución en su consumo en los últimos cinco años, con un leve aumento en el 2019 (USDA, 2019). Se atribuye esta disminución a que una parte de los consumidores buscan bebidas que perciben como menos calóricas y más saludables, por ejemplo: aguas saborizadas (EFJA, 2018). De igual forma, por las cualidades nutricionales mencionadas previamente y por sus características sensoriales, es el jugo de naranja el jugo de frutas más consumido en Unión Europea (EFJA, 2018). En cuanto a la situación en Costa Rica, los jugos y concentrados de frutas aportaron el 2% del total de las exportaciones en el año 2017 (PROCOMER, 2018). Dichas exportaciones se dirigieron en su mayoría a Holanda (33%), Estados Unidos (32%) y Bélgica (9%) (PROCOMER, 2018). A su vez, estos países se encuentran en las zonas en las que son más consumidos este tipo de productos, como se señaló previamente. Además, el jugo de naranja se posicionó entre los primeros 20 productos más exportados de la industria agropecuaria de este mismo año (SEPSA, 2018). 3.2. Generalidades sobre Alicyclobacillus acidoterrestris y su efecto en jugos 3.2.1. Principales características de A. acidoterrestris Alicyclobacillus acidoterrestris es una bacteria Gram positiva, catalasa positiva y aerobia que tiene forma de bacilo y forma parte del género Alyciclobacillus. Se han encontrado más de 20 especies pertenecientes a dicho género, como A. acidiphilus, A. herbarius y A. pommorum (Smit et al., 2011; Tianli et al., 2014). Sin embargo, A. acidoterrestris es la especie más común asociada con el deterioro de productos alimentarios. Todas las especies se han aislado del suelo, de jugos de frutas deteriorados o de ambientes con condiciones extremas (Bevilaqua et al., 2008a). Inicialmente se clasificó como una bacteria del género Bacillus sp. Sin embargo, por estudios taxonómicos y la presencia de los ácidos grasos ω-ciclohexano y ω-cicloheptano característicos de su membrana celular, se determinó que pertenecía a un nuevo género 8 denominado Alicyclobacillus sp. Estos ácidos grasos, a su vez, le otorgan resistencia al ácido y a las altas temperaturas (Wisotzkey et al., 1992). A. acidoterrestris posee la capacidad de formar esporas termorresistentes cuando las condiciones no son favorables para su desarrollo. Se ha reportado que el valor D95°C de estas esporas se encuentra entre 0,06 y 5,3 minutos por lo que sobrevivirían a los tratamientos térmicos normalmente aplicados en jugos, que suelen ser de 90°C a 95°C durante 30 a 60 segundos (Steyn et al., 2011; Tianli et al., 2014). Además, crece en alimentos con valores de aw mayores a 0,984 y se ha encontrado que sus esporas germinan a menos de 18 grados Brix (Sinigaglia et al., 2003). Su pH óptimo de crecimiento es de 4,0 a 4,5 pero puede crecer de 2,5 a 6,0 y en cuanto a temperatura, puede crecer en un rango entre 25 y 60°C con una temperatura óptima de 40 a 45°C (Bevilaqua et al., 2008a). A. acidoterrestris es un microorganismo no patógeno. Se ha estudiado previamente su efecto en ratones al ingerir esporas y en conejillos de indias al ingerir jugo contaminado con una población de 5 x 106 UFC/ml de A. acidoterrestris sin presentar ningún síntoma extraño. Además, ninguno de los animales murió durante el experimento (Walls y Chuyate, 1998). Esta bacteria se clasifica como de deterioro debido a que, dentro de su metabolismo, produce guayacol, 2,6-dibromofenol y 2,6-diclorofenol, compuestos que dan como resultado olores desagradables que se describen como medicinales y que provocan el rechazo por parte del consumidor (Gocmen et al., 2005, Kumar et al., 2013). En el caso del guayacol, a pesar de ser un compuesto que da el olor característico a productos como el café y la malta, en jugos es el principal de los tres metabolitos asociado con su deterioro. El mismo se origina a partir del ácido vanílico, derivado de la lignina, que forma parte de las membranas celulares de las frutas. Además, puede formarse a partir de la tirosina, la cual se encuentra en el jugo de naranja en concentraciones de 3-13 µg/l (Chang y Kang, 2004). 3.2.2. Alicyclobacillus acidoterrestris en la industria de jugos y bebidas A. acidoterrestris se encontró por primera vez en 1982, cuando en Alemania se dio el deterioro de un jugo de manzana y se determinó que este microorganismo fue el causante (Cerny et al., 1984). Anteriormente, se pensaba que el deterioro de jugos por parte de esta bacteria era esporádico. Sin embargo, en 1998 la Asociación de Productores de Alimentos de 9 Estados Unidos (FPA, por sus siglas en inglés), realizó una encuesta en la que el 35% de los productores mencionaron que habían experimentado deterioro, sin confirmar pero consistente, producto de la presencia de microorganismos acidófilos formadores de esporas (Kumar et al., 2013). Además, se ha dado el deterioro de jugos por parte de Alicyclobacillus sp. en países como el Reino Unido, Alemania, Australia, Japón y Estados Unidos (Chang y Kang, 2004). Son muchos factores los que hacen que la presencia de esta bacteria en jugos sea posible, por ejemplo, su presencia en la tierra posibilita la contaminación de las frutas durante la cosecha (Chang y Kang, 2004). Como prueba de esto se han encontrado esporas de Alicyclobacillus sp. en más de un tercio de naranjas muestreadas en industrias procesadoras de jugo de naranja en Florida, Estados Unidos (Parish y Goodrich, 2005). Además, se ha aislado la misma especie de Alicyclobacillus de jugos de cítricos contaminados y el agua de lavado de empresas procesadoras y se ha encontrado que esta bacteria puede encontrarse en los condensados procedentes de los evaporadores de la industria de jugos que luego se reutilizan como aguas de lavado (McIntyre et al., 1995; Steyn et al., 2011). En cuanto a los jugos y bebidas como tal, Eiroa y otros (1999) encontraron que 14,7% de 75 jugos de naranja de productores brasileños contenían bacterias del género Alicyclobacillus sp. En el año 2010, Durak y otros aislaron específicamente bacterias de la especie A. acidoterrestris de 61 diferentes jugos y concentrados tanto de Estados Unidos como de otros países. De los anteriores, 24 eran de manzana, 19 de cítricos y 21 de otros jugos y concentrados. También se ha aislado A. acidoterrestris de concentrados de frutas que fueron utilizados para elaborar una bebida carbonatada que presentaba olores desagradables (Walker y Phillips, 2005). Además, en un estudio realizado a 180 concentrados de frutas tropicales y subtropicales, incluyendo 10 tipos de concentrados de 10 diferentes países, se encontró que el 6,1% (11/180) estaban contraminados con Alicyclobacillus sp. De estos 11, se determinó que 9 correspondían a la especie A. acidoterrestris (Danyluk et al., 2011). 3.3. Principales factores que afectan el crecimiento de A. acidoterrestris 3.3.1. Temperatura de almacenamiento Se ha estudiado que las temperaturas de refrigeración (4°C) evitan el crecimiento de A. acidoterrestris y la producción de guayacol tanto en jugo de naranja como de manzana en 10 un período de almacenamiento de hasta 21 días (Pettipher et al., 1997). Sin embargo, no es necesario que los jugos se mantengan a temperaturas tan bajas, dado que Spinelli y otros (2009) afirman que luego de inocular jugo de naranja estable a temperatura ambiente con A. acidoterrestris y almacenarlo a una temperatura 20°C, la población del microorganismo no alcanzó las 104 UFC/ml, población considerada como crítica, según dicha investigación, para la producción de guayacol. Es decir, se puede controlar el crecimiento de esta bacteria al reducir la temperatura de almacenamiento sin llegar a temperaturas de refrigeración, pero no es posible utilizar la temperatura ambiente como temperatura de almacenamiento dado que esta podría exceder los 20°C con facilidad. Por su parte, se ha evidenciado que en matrices como jugo de naranja es viable el crecimiento de esta bacteria en temperaturas entre los 35°C y los 50°C, en tan solo dos días. También se determinó que a 45°C es posible que este microorganismo crezca en una serie de jugos como manzana, piña, pera, tomate y durazno durante el mismo lapso de tiempo (Sinigaglia et al., 2003). Esto coincide con el rango de temperatura óptima de crecimiento de la bacteria señalada por otros autores (Wisotzkey et al., 1992, Bevilaqua et al., 2008a). 3.3.2. pH Existen pocos estudios sobre el efecto del pH en la geminación de las esporas y crecimiento de las células vegetativas de A. acidoterrestris en jugos. La mayoría se enfocan únicamente en el efecto de esta característica fisicoquímica sobre la resistencia de la bacteria a los tratamientos térmicos (Silva et al., 1999; Bahҁeci y Acar, 2007). Sin embargo, recientemente, Hu y otros (2020) estudiaron el efecto del pH sobre el crecimiento de A. acidoterrestris en caldo YSG suplementado con sacarosa. Como resultados se obtuvieron los siguientes: inhibición del crecimiento bacteriano al utilizar un pH de 6,7, crecimiento acelerado en los tratamientos con valores de pH de 3,7 y 4,7 y crecimiento más retardado para el caldo con un pH de 2,7. Esto concuerda con un estudio realizado previamente, en un medio compuesto de extracto de malta y peptona, en el cual se concluyó que el mejor crecimiento de A. acidoterrestris se daba para los tratamientos con valores de pH entre 3,5 y 4,5 (Sinigaglia et al., 2003). 11 3.3.3. Contenido de sólidos solubles (grados Brix) En pruebas realizadas en un medio compuesto de extracto de malta y peptona, cuyos sólidos solubles se ajustaron con sacarosa, se observó que el crecimiento óptimo de A. acidoterrestris se dio para el tratamiento con 12,5 °Brix. Este a su vez era el tratamiento con la menor concentración de sólidos solubles. Por el contrario, al aumentar la concentración de sacarosa hasta 38,7 °Brix, aunque se tuvieran las condiciones óptimas de temperatura y pH para el crecimiento de la bacteria, se redujo considerablemente su viabilidad. Este parámetro fisicoquímico también fue estudiado por Peña y otros (2011) pero en este caso en jugo de manzana. Al poseer las condiciones de pH y temperatura favorables para el desarrollo de A. acidoterrestris, únicamente en jugos con una concentración de sólidos solubles de alrededor de 18°Brix se estimó una probabilidad de crecimiento cercana a cero. Como se mencionó previamente, los valores de sólidos solubles en jugos de naranja se encuentran entre 8,7 y 10,8 °Brix para jugos no reconstituidos y entre 11,2 – 11,8 °Brix para jugos a partir de concentrado (FAO y OMS, 2005; Niu et al., 2008). Por lo que, inhibir el crecimiento de esta bacteria por medio de la variación de esta característica fisicoquímica en esta matriz requeriría de un cambio considerable en su composición. 3.3.4. Espacio de cabeza y oxígeno disponible Walker y Phillips (2005) estudiaron el efecto del espacio de cabeza en jugo de manzana sobre el crecimiento de A. acidoterrestris. Para esto, inocularon el microorganismo en este jugo y seguidamente lo colocaron en botellas con espacios de cabeza de 0%, 25%, 50% y 75%. Luego de incubarlo a 35°C por 11 días observaron que durante este lapso de tiempo se dio crecimiento del microorganismo en todos los tratamientos excepto en el que poseía un espacio de cabeza del 0%. Por lo tanto, se evidenció que una reducción considerable del espacio de cabeza podía inhibir el crecimiento de este microorganismo, lo cual se asocia con su naturaleza aerobia. Kinouchi y otros (2014), por otra parte, decidieron variar el contenido total de oxígeno en recipientes con caldo YSG y en recipientes con jugo de manzana. La diferencia en este caso radica en que no sólo se tomó en cuenta el oxígeno como parte del espacio de cabeza, sino también el oxígeno disuelto en el medio. Como resultado se observó una alta correlación positiva entre la cantidad de oxígeno disponible y el crecimiento de A. acidoterrestris en el 12 tratamiento con caldo YSG (R2 = 0,9329) y una correlación más baja en el tratamiento con jugo de manzana (R2 = 0,5604). En el caso del jugo de manzana, este resultado se atribuyó a que el crecimiento de la bacteria fue menor que en el caldo YSG para todas las concentraciones de oxígeno, lo que se asoció a su vez con la presencia de agentes reductores (principalmente ácido ascórbico) que pudieron haber reaccionado con el oxígeno, disminuyendo su disponibilidad para que este pudiese ser utilizado por la bacteria. Sin embargo, en términos generales, se concluyó que una reducción en la concentración de oxígeno disponible podría contribuir a evitar el crecimiento de A. acidoterrestris en jugos. 3.4. Uso de antimicrobianos en jugos para inhibir el crecimiento de A. acidoterrestris 3.4.1. Benzoato de sodio y su efecto sobre A. acidoterrestris El benzoato de sodio es una sal procedente del ácido benzoico, que al disociarse en un medio ácido, actúa sobre la pared celular de los microorganismos facilitando la entrada de protones al interior de la célula. Esto provoca que la célula deba dirigir su energía a reestablecer su pH óptimo, lo que a su vez afecta el transporte de aminoácidos. Adicionalmente, inhibe las enzimas que participan en el ciclo del ácido cítrico y en la fosforilación oxidativa. Por esta razón, resulta ser un preservante muy efectivo en alimentos de pH bajo, como los jugos. Además, es de bajo costo, fácil de aplicar y no afecta el color del alimento, lo que hace que sea muy utilizado en la industria (Schmidl y Labuza, 2000; James et al., 2005; Belitz et al., 2009). Se ha observado que al agregar 500 mg/l de este compuesto a caldo extracto de malta acidificado con 103 esporas/ml de A. acidoterrestris, se inhibe por completo la germinación de dichas esporas durante trece días. Por otra parte, si se reduce su concentración a 100 mg/l esta inhibición disminuye a un rango entre 51-62% (Bevilacqua et al., 2008b). También se estudió el efecto de este preservante en jugo de manzana almacenado a 30°C sobre una población de 104 UFC/ml de A. acidoterrestris y se determinó que concentraciones de 500 mg/l, 1000 mg/l y 1500 mg/l inhiben su crecimiento por completo. Estas mismas concentraciones lograron reducir significativamente la cantidad de esporas en el jugo el día 29 (3,5 logaritmos), al compararse con el día 1 (5,2 logaritmos) (Walker y Phillips, 2008b). Por último, Cai y otros (2015) también estudiaron el efecto de este antimicrobiano sobre A. 13 acidoterrestris (106 UFC/ml) en caldo AAM (medio A. acidocaldarius) y determinaron que su crecimiento se inhibe a partir de una concentración de 585 mg/l. 3.4.2. Sorbato de potasio y su efecto sobre A. acidoterrestris El sorbato de potasio es una sal que se origina a partir del ácido sórbico, que al igual que el benzoato de sodio, al disociarse puede inhibir el crecimiento de ciertos microorganismos. Su efecto es muy similar al del benzoato de sodio, ya que también actúa sobre las membranas celulares de dichos microorganismos, afectando el transporte de nutrientes, e inhibe la actividad enzimática (Paulus, 2005). Es menos dependiente del pH, en relación con el benzoato de sodio y posee una toxicidad muy baja. En concentraciones de 0,3% o menos, no posee efecto sobre el color o sabor de los alimentos en los que se añade (Belitz et al., 2009). El sorbato de potasio ha sido menos estudiado que el benzoato de sodio. Sin embargo, en el mismo estudio realizado por Cai y otros (2015) se observó que la concentración mínima necesaria para inhibir el crecimiento de A. acidoterrestris en caldo AAM es de 673 mg/l. Asimismo, se ha evaluado su efecto en jugo de manzana inoculado con 104 UFC/ml de A. acidoterrestris e incubado a 30°C. En este caso se observó que concentraciones de 500 mg/l, 1000 mg/l y 1500 mg/l inhiben su crecimiento por completo, dado que la población de este microorganismo se mantuvo constante a lo largo de 29 días después de su inoculación (Walker y Phillips, 2008b). 3.4.3. Nisina y su efecto sobre A. acidoterrestris La nisina es una bacteriocina (péptido antimicrobiano) producida por algunas cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis (Tyfa et al., 2015). Esta actúa sobre sus células blanco formando poros en sus membranas celulares y así alterando el gradiente de pH entre el medio que las rodea y su líquido intracelular (Cleveland et al., 2001). Se ha observado que posee un efecto inhibitorio considerable sobre patógenos y bacterias Gram positivas formadoras de esporas, pero poco efecto sobre bacterias Gram negativas, mohos y levaduras (Yamazaki et al., 2000). La nisina es estable en medios con valores de pH bajos y resiste altas temperaturas, por lo que es una alternativa para bebidas ácidas como los jugos y puede ser añadida antes de realizar el tratamiento térmico (Tyfa et al., 2015). 14 En relación con su efecto sobre A. acidoterrestris, en 1999 Komitopoulou y otros evidenciaron que al utilizar 5 UI/ml (Unidades Internacionales) de nisina en jugo de naranja y de toronja almacenados a 25°C, luego de 5 días, su población se redujo de 4 x 102 UFC/ml hasta por debajo del límite de detección de 5 x 101 UFC/ml. Sin embargo, para lograr este mismo efecto a 44°C, en jugo de naranja se tuvo que aumentar la concentración de nisina a 100 UI/ml. También se ha evaluado su efecto inhibitorio en placas de agar mYPGA (agar levadura-peptona-glucosa modificado) sobre diferentes cepas de A. acidoterrestris. La cepa más resistente (AB-5) necesitó de 50 UI/ml de nisina para ser inhibida a un pH de 3,4 y de 100 UI/ml para ser inhibida a un pH de 4,2. Con esta misma cepa se observó que luego de 12 días, la población de A. acidoterrestris se mantuvo constante en jugo de naranja al utilizar concentraciones de nisina de 50 UI/ml y 100 UI/ml y en una bebida de frutas al utilizar 100 UI/ml de nisina. Sin embargo, en ninguna de estas concentraciones se logró inhibir el crecimiento de esta bacteria en el jugo de manzana (Yamazaki et al., 2000). El uso de nisina se ha estudiado en combinación con otros de los factores que afectan el crecimiento de A. acidoterrestris, como concentración de sólidos solubles, pH y temperatura de almacenamiento para modelar su comportamiento en jugo de naranja. Como resultado se obtuvo que una concentración de 70 UI/ml de nisina a un pH de 4,4 y una temperatura de almacenamiento de 37°C inhibe su crecimiento hasta por 47 días. Además, se comprobó que al reducir la temperatura de almacenamiento y el pH del jugo se necesita una menor concentración de este compuesto para mantener su efecto inhibitorio o, por el contrario, que al aumentar la concentración de nisina, se pueden alcanzar mayores valores de temperatura y pH en el jugo, sin que el microorganismo pueda crecer en el mismo (Peña y Rodriguez, 2006). 4. Materiales y Métodos 4.1. Localización La sección experimental del proyecto se llevó a cabo en las instalaciones del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CITA) y en la Escuela de Tecnología de Alimentos. La elaboración de jugos de naranja, se hizo en la planta piloto del CITA. Las determinaciones de componentes y características fisicoquímicas de los jugos se llevaron a cabo en los laboratorios de química del CITA y de la Escuela de Tecnología de Alimentos y 15 los análisis microbiológicos en el laboratorio de microbiología del CITA. Todas estas instalaciones se ubican en la Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, en San Pedro de Montes de Oca, San José, Costa Rica. 4.2. Selección de los jugos del mercado costarricense por analizar Se realizaron visitas a cinco supermercados de Costa Rica, en dos localidades diferentes cada uno, desde el 7 de enero del 2019 hasta el 12 de febrero del 2019. Se eligieron los siguientes supermercados: Automercado, Walmart, Perimercados, Más x Menos y Vindi. En los cuadros I y II se pueden observar tanto las características como la disponibilidad de cada jugo en cada supermercado. Se decidió trabajar con los jugos Dos Pinos 100% de concentrado, Dos Pinos 100% natural exprimido, Del Valle de concentrado y Tropicana Grovestand, además de dos jugos control elaborados en planta piloto (descripción detallada se provee en la sección 4.3. de este documento). Para elegir los jugos comerciales para el estudio, primero se decidió trabajar con jugos de naranja que tuvieran la menor cantidad de ingredientes, además de jugo de naranja y agua. Además, se quiso trabajar con jugos que provinieran de diferentes compañías procesadoras y se decidió tomar en cuenta al menos un jugo que no fuese estable a temperatura ambiente. Luego, fue un factor determinante la frecuencia con la que se encontraban los productos en los diferentes supermercados visitados, como un indicador indirecto de disponibilidad, tasa de consumo y rotación de los productos. Por esta razón, jugos como el de la marca Hortifruti y la marca Vegetales Fresquita se descartaron ya que sólo se encontraban en un único supermercado. En el caso del jugo Tropicana Grovestand este se eligió por ser el jugo importado que se encontró en la mayor cantidad de supermercados visitados. 16 Cuadro I. Nombre, marca, ingredientes, temperatura de almacenamiento y concentración de vitamina C de los jugos de naranja encontrados en el mercado costarricense entre enero y febrero del 2019. Nombre Marca Ingredientes Temperatura de Almacenamiento Concentración de vitamina C (mg/l) Jugo de naranja 100% de concentrado Dos Pinos Agua, jugo concentrado de naranja. Ambiente 128 Jugo de naranja enriquecido con vitamina C Dos Pinos Agua, concentrado natural de naranja, azúcar, vitamina C. Ambiente 420 Jugo de naranja fuente de vitamina C Dos Pinos Agua, jugo concentrado de naranja, azúcar, vitamina C, betacaroteno como colorante natural, ácido sórbico y benzoato de sodio (0,01%) como preservantes. Refrigeración 240 Jugo de naranja 100% natural exprimido Dos Pinos Jugo de naranja. Refrigeración No reportada en la etiqueta Jugo de naranja azucarado Dos Pinos Agua, concentrado de naranja, azúcar (6,5%), ácido cítrico como regulador de acidez, sorbato de potasio y benzoato de sodio como preservantes, ácido ascórbico, betacaroteno como colorante natural. Ambiente 48 100 % jugo de naranja a partir de concentrado Del Valle Jugo de naranja y saborizantes. Ambiente 132 Jugo de naranja de concentrado Tropical Agua, jugo concentrado de naranja, azúcar, sabor de naranja, benzoato de sodio y sorbato de potasio (como conservantes). Ambiente 240 Jugo de naranja Vegetales Fresquita Jugo de naranja. Refrigeración No reportada en la etiqueta 17 Continuación del Cuadro I. Nombre Marca Ingredientes Temperatura de Almacenamiento Concentración de vitamina C (mg/l)* Jugo de naranja Hortifruti Jugo de naranja. Refrigeración No reportada en la etiqueta Bebida con jugo de naranja Coronado Agua, azúcar, jugo concentrado de naranja, d’ limoneno como enturbiante, sabor a naranja, ácido cítrico como acidulante, goma celulosa, sorbato de postasio (0,016%) como preservante, vitamina C y annato como colorante natural. Refrigeración 100 100% Jugo de naranja sin pulpa (Original) Tropicana 100% jugo de naranja pasteurizado. Refrigeración 300 100% Jugo de naranja con calcio y vitamina D Tropicana 100% jugo de naranja pasteurizado, hidróxido de calcio, ácido cítrico, ácido málico y vitamina D3. Refrigeración 300 100% Jugo de naranja con alguna pulpa (Homestyle) Tropicana 100% jugo de naranja pasteurizado. Refrigeración 300 100% Jugo de naranja con mucha pulpa (Grovestand) Tropicana 100% jugo de naranja pasteurizado. Refrigeración 300 100% Jugo de naranja premium con alguna pulpa Florida’s Natural Jugo de naranja pasteurizado. Refrigeración 300 100% Jugo de naranja premium sin pulpa Florida’s Natural Jugo de naranja pasteurizado. Refrigeración 300 100% Jugo de naranja premium con calcio y vitamina D Florida’s Natural Jugo de naranja pasteurizado, citrato de tricalcio y vitamina D3. Refrigeración 300 Jugo de naranja Light Florida’s Natural Agua, jugo de naranja, citrato de potasio, ácido cítrico, pectina, ácido ascórbico, extracto de hojas de Stevia y betacaroteno. Refrigeración 250 *Valor reportado en la etiqueta. 18 Cuadro II. Frecuencia con la que se encuentran los jugos de naranja de cinco supermercados diferentes (en dos de sus localidades) de Costa Rica entre enero y febrero del 2019. Nombre y marca del jugo de naranja Lugar Automercado Los Yoses Automercado Calle Vieja Más x Menos Desamparados Más x Menos Concepción de Tres Ríos Walmart Desamparados Walmart Pinares Perimercados San Francisco Perimercados Centro Comercial del Sur Vindi San Francisco Vindi Concepción de Tres Ríos Jugo de naranja 100% de concentrado (Dos Pinos) X X X X X X X X X Jugo de naranja enriquecido con vitamina C (Dos Pinos) X X X X X X X X X Jugo de naranja fuente de vitamina C (Dos Pinos) X X X X X X X X Jugo de naranja 100% natural exprimido (Dos Pinos) X X X X X X X Jugo de naranja azucarado (Dos Pinos) X X X X X X Jugo de naranja 100% de concentrado (Del Valle) X X X X X X X X X Jugo de naranja de Concentrado (Tropical) X X X X X X X Jugo de naranja (Vegetales Fresquita) X Jugo de naranja (Hortifruti) X X 19 Continuación del Cuadro II. Nombre y marca del jugo de naranja Lugar Automercado Los Yoses Automercado Calle Vieja Más x Menos Desamparados Más x Menos Concepción de Tres Ríos Walmart Desamparados Walmart Pinares Perimercados San Francisco Perimercados Centro Comercial del Sur Vindi San Francisco Vindi Concepción de Tres Ríos Jugo de naranja (Coronado) X X X X 100% Jugo de naranja sin pulpa tipo Original (Tropicana) X X X X X 100% Jugo de naranja con calcio y vitamina D (Tropicana) X X X X X X 100% Jugo de naranja con alguna pulpa tipo Homestyle (Tropicana) X X X X X 100% Jugo de naranja con mucha pulpa tipo Grovestand (Tropicana) X X X X X X 100% Jugo de naranja premium con alguna pulpa (Florida’s Natural) X X 100% Jugo de naranja premium sin pulpa (Florida’s Natural) X X X 100% Jugo de naranja premium con calcio y vitamina D (Florida’s Natural) X X X X Jugo de naranja light (Florida’s Natural) X 20 4.3. Elaboración de jugos de naranja en planta piloto Además de los jugos de naranja comerciales, se elaboró un lote de jugo de naranja como control, con base en los resultados descritos por Worsfold (2019) (Figura 1). En dicha investigación se preparó un jugo que no permitió el crecimiento de la bacteria y se desea replicar en este proyecto dado que permitiría comparar los resultados entre los jugos comerciales y uno de elaboración propia en el que se sabe que la bacteria no presenta crecimiento. Este jugo se obtuvo de la empresa Natufruit, la cual produce jugos de naranja a partir de concentrado, y se le aplicó un tratamiento térmico a nivel de planta piloto para que fuera estable a temperatura ambiente. Figura 1. Flujo de proceso de elaboración de jugo de naranja estable a temperatura ambiente a partir de jugo de naranja obtenido de la empresa Natufruit (Worsfold, 2019). De igual forma se elaboró un jugo a partir de naranjas frescas como materia prima y no de jugo de naranja concentrado (Figura 2). Esto para tener como tratamiento un jugo que 21 no se hubiese sometido a una etapa de concentración, la cual podría tener un efecto en el jugo que a su vez afectara el desarrollo de A. acidoterrestris. Figura 2. Flujo de proceso de elaboración de jugo de naranja estable a temperatura ambiente a partir de naranjas frescas. Para la operación de desinfección se utilizaron los parámetros de tiempo y concentración recomendados por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (USEPA, por sus siglas en inglés) (2015) para el ácido peracético. Además, se sabe que el pH del jugo de naranja suele encontrarse entre 3.2 y 3.9 (Eiroa et al., 1999; Komitopoulou et al., 1999). Por 22 lo tanto, el tratamiento térmico establecido (81 °C durante 3 minutos) en conjunto con un llenado en caliente y la inversión del envase fueron diseñados considerando el valor máximo de pH reportado (Padilla-Zakour, 2008), asegurando con esta medida la esterilidad comercial del jugo. Además, se mantuvieron las Buenas Prácticas de Manufactura y se lavaron y desinfectaron los envases y sus respectivas tapas antes del llenado correspondiente. Este tratamiento térmico no asegura que A. acidoterrestris se elimine del jugo, por lo tanto, como se explica en la sección 4.5.3. al iniciar el experimento se hizo un recuento inicial del microorganismo para garantizar su ausencia. Es importante señalar que se mantuvo un espacio de cabeza de alrededor del 10% del volumen total, tal y como lo realizó Worsfold (2019) y este se mantuvo en todos los envases lo más uniforme posible. Esto porque se ha comprobado que el espacio de cabeza posee un efecto sobre el crecimiento de Alicyclobacillus sp. ya que el microorganismo es aerobio y en un mayor espacio de cabeza hay mayor cantidad de oxígeno disponible (Walker y Phillips, 2005). 4.4. Caracterización fisicoquímica de los jugos de naranja Varios autores han señalado el efecto de diferentes factores fisicoquímicos sobre el desarrollo de A. acidoterrestris en jugos. Por lo tanto, se eligieron los siguientes cinco parámetros para contrastar con los resultados obtenidos en los tres objetivos del presente proyecto. De cada jugo se tomaron tres muestras de lotes diferentes para cada análisis, representando cada lote una repetición. 4.4.1. Determinación de pH Se determinó el pH de cada muestra siguiendo el procedimiento del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (2016a) “P-SA-MQ-012” basado en el método número 981.12 de la AOAC (2005). 4.4.2. Determinación de acidez total Se determinó la acidez total de cada muestra siguiendo el procedimiento del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (2018a) “P-SA-MQ-011” basado en el método número 942.15 de la AOAC (2005). 23 4.4.3. Determinación de sólidos solubles Se determinó la concentración de sólidos solubles, expresada como Brix, de cada muestra siguiendo el procedimiento del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (2015) “P-SA-MQ -046” basado en el método número 932.12 de la AOAC (2012). 4.4.4. Determinación de polifenoles totales Se determinó la concentración de polifenoles totales de cada muestra siguiendo el procedimiento del Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (2016b) “P-SA- MQ-048” basado en los métodos de Slinkard y Singleton (1977) y Georgé y Brat (2005). 4.4.5. Determinación de ácido ascórbico y vitamina C Se determinó la concentración de vitamina C (ácido ascórbico y ácido dehidroáscorbico) siguiendo el procedimiento Centro Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (2018b) “P-SA-MQ-024” basado en los métodos de Hernández y cols. (2006), Lykkesfeldt (2000), Mertz (2009) y Wechtersbach (2007). Este método permite obtener ambos resultados. De los procedimientos anteriores, los descritos en las secciones 4.4.4. y 4.4.5. fueron llevados a cabo por el Laboratorio de Química del CITA. 4.5. Evaluación del crecimiento de A. acidoterrestris en cinco jugos de naranja seleccionados Se tomó como base el procedimiento que utilizó Worsfold (2019), el cual se detallará a continuación: 4.5.1. Cepa utilizada para la inoculación de los jugos Se utilizó una cepa comercial aislada de una muestra de tierra de Alemania: Alicyclobacillus acidoterrestris ATCC 49025. La bacteria se mantuvo a una temperatura de -20 ± 3 °C en viales con glicerol y caldo papa dextrosa o caldo infusión cerebro corazón, para asegurar su viabilidad durante la fase experimental del proyecto. 4.5.2. Preparación del inóculo De la cepa señalada en punto 4.5.1. se preparó un cultivo rayado en placas con agar YSG (Yeast Starch Glucose) acidificado a un pH de 3,7 utilizando ácido clorhídrico 1 N, el cual se incubó durante mínimo 5 días a 45 °C (IFFJP, 2007; Oteiza et al., 2015). De esta placa, se tomó una colonia aislada con un asa estéril y se colocó en un tubo con 10 ml de 24 agua peptonada estéril al 0,1%. Seguidamente dicho tubo se sometió a un choque térmico de 75 °C por 20 minutos en un baño de agua para inactivar las células vegetativas y activar las esporas (Gocmen et al., 2005). Esto contribuyó además a evitar subestimar el número de microorganismos inoculados en el jugo (IFFJP, 2007). Una vez que transcurrieron los 20 minutos, el inóculo se llevó a una temperatura de 40-45 °C antes de ser utilizado. Para cada una de las repeticiones del experimento, se preparó un inóculo independiente. 4.5.3. Tratamiento de las muestras y su inoculación De los dos jugos control de elaboración propia (sección 4.3.) y los cuatro jugos comerciales, se tomaron 133 ml de cada uno y se colocaron independientemente en una botella de 225 ml previamente esterilizada y cubierta con papel aluminio. Esto para simular un espacio de cabeza de alrededor de un 40%, el cual se sabe que promueve el crecimiento de la bacteria (Gocmen et al., 2005). Es importante señalar que se preparó una botella para cada tiempo de muestreo para reducir la probabilidad de contaminación y los efectos que podría tener en los resultados el cambio de volumen al tomar las muestras. Adicionalmente, se tuvo una botella con el jugo sin inocular, como control negativo, para asegurar la ausencia del microorganismo en la muestra durante el tiempo de muestreo en las condiciones de incubación seleccionadas. Para la inoculación, se tomó 1 ml del inóculo preparado según la sección 4.5.2. manteniendo la técnica aséptica. De esta forma se obtuvo una carga inicial de 102-103 UFC/ml en el jugo. Esta carga fue la utilizada por Worsfold (2019), quien a su vez se basó en otros estudios que señalaban que este valor es el de los recuentos de la bacteria que se encuentran comúnmente en frutas (Spinelli et al., 2010; Oteiza et al., 2015). Es importante señalar que antes de inocular los jugos, se hizo un recuento del microorganismo de interés con la metodología que se explicará seguidamente, para asegurar su ausencia antes de iniciar el experimento. En ninguno de los jugos utilizados se encontró A. acidoterrestris. Luego, se hicieron recuentos en el jugo inoculado para determinar la carga inicial exacta de la bacteria de interés en el jugo. Para esto, se tomó 1 ml del jugo y se realizaron diluciones seriadas en agua peptonada estéril al 0,1%. Después se utilizó la técnica de vaciado (JFJA, 2003) para colocar las diluciones en placas de Petri (cada dilución por duplicado) utilizando agar YSG acidificado a un pH de 3,7 ± 0,1 y se incubaron a 45° C durante 3 días 25 (IFFJP, 2007). En el caso del jugo sin inocular, se analizó la muestra sin realizar dilución alguna, ya que se esperaba la ausencia del microorganismo. El conteo de las colonias se realizó de forma visual utilizando un contador de Quebec. Conociendo el número de colonias (promedio de colonias de las dos placas de la dilución contable) y la dilución correspondiente, se aplicó el inverso del factor de dilución y el valor obtenido se redondeó a dos cifras significativas. Para este conteo se tomaron en cuenta solamente las diluciones con 25 - 250 unidades formadoras de colonia en sus respectivas placas. En caso de ser más de una, a cada una se le aplicó su factor de dilución y se promediaron los valores que ya poseen dos cifras significativas (Camacho et al., 2009). Finalmente, para confirmar el crecimiento de A. acidoterrestris se tomó una muestra del recuento final de cada lote de jugo y se siguió el método de crecimiento diferenciado por temperatura reportado en la metodología japonesa The Unified detection method of thermoacidophilic bacteria in raw materials of fruit juice (Japan Fruit Juice Association, 2003). Este consiste en inocular una asada de colonias sobre dos placas de agar YSG, las cuales se deben incubar una a 45 ± 1 °C y la otra a 65 ± 1 °C por 18-20 horas. Para que se confirme la presencia de A. acidoterrestris, el crecimiento solo debe haberse dado en la placa incubada a 45 °C. El resto de los jugos inoculados se homogenizaron agitando manualmente y se almacenaron por un máximo 21 días a 45 °C, temperatura que favorece el desarrollo de A. acidoterrestris (Yokota et al., 2007; IFFJP, 2007). El jugo control también se almacenó para realizar un recuento de este microorganismo el último día del estudio. Lo anterior corresponde a una repetición del experimento, el cual se repitió dos veces más para un total de tres repeticiones. 4.5.4. Muestreos periódicos de A. acidoterrestris en los jugos de naranja Se tomaron muestras de cada uno de los jugos en los días: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 17 y 21 de almacenamiento. El último día del estudio, se tomó una muestra de su respectivo control negativo para comprobar la ausencia de A. acidoterrestris. Todas las muestras se tomaron de manera aséptica. 26 4.5.5. Recuento de A. acidoterrestris en los jugos de naranja Cada vez que se realizó el muestreo (según la sección 4.5.4.), se homogenizó la muestra de forma manual y luego se tomó 1 ml de la misma para seguir el procedimiento descrito en la sección 4.5.3. Una vez que se tuvieron los resultados, para reportar la población microbiana se siguieron los pasos también mencionados en dicha sección. Sin embargo, se añadió un paso adicional, ya que al número de colonias reportado con dos cifras significativas se le aplicó el logaritmo para reportar dicha población como log10 UFC/ml como resultado final (Camacho et al., 2009). 4.6. Comparación del efecto de los antimicrobianos seleccionados sobre la sobrevivencia de A. acidoterrestris en jugo de naranja 4.6.1. Proveedor y concentración de nisina Se utilizó el producto comercial “NisinZTM” producido por Handary (Bruselas, Bélgica) y se siguieron las recomendaciones e instrucciones de uso que reporta su ficha técnica obtenida por medio de la empresa Asesoría en Alimentos Alfa, S.A. (ASEAL). Esta señala que la cantidad necesaria en jugos de frutas para el control de A. acidoterrestris es de 30-60 mg/kg. En este caso se utilizó la concentración de (58 ± 1) mg/kg dado que se quería probar la máxima concentración sugerida por el fabricante. 4.6.2. Proveedor y concentración de benzoato de sodio Se utilizó benzoato de sodio grado alimenticio producido por Kerry (Pavas, Costa Rica) y se siguieron las recomendaciones e instrucciones de uso señaladas en la ficha técnica obtenida gracias a la empresa Maltho Foods, S.A. Este se añadió al jugo de naranja de manera que su concentración en el mismo fuese de (965 ± 17) mg/kg, dado que, la cantidad máxima permitida en el RTCA 67.04.54:10 y el CODEX Alimentarius es de 1000 mg/kg y se quería probar una concentración cercana a este límite (COMIECO, 2012; FAO y OMS, 2018). 4.6.3. Proveedor y concentración de sorbato de potasio Se utilizó sorbato de potasio granular grado alimenticio producido por Kerry (Pavas, Costa Rica) y se siguieron las recomendaciones e instrucciones de uso señaladas en la ficha técnica obtenida gracias a la empresa Maltho Foods, S.A. Este se añadió al jugo de naranja de manera que su concentración en el mismo fuese de (965 ± 15) mg/kg, dado que al igual que en el caso del benzoato de sodio, la cantidad máxima permitida en el RTCA 67.04.54:10 27 y el CODEX Alimentarius es de 1000 mg/kg y se quería probar una concentración cercana a este límite (COMIECO, 2012; FAO y OMS, 2018). 4.6.4. Tratamiento de las muestras e inoculación Con base en los resultados del primer objetivo, se eligió el jugo con mayor potencial de deterioro. A este se le agregaron los antimicrobianos previamente mencionados, de manera independiente. Adicionalmente, se tuvo un tratamiento que tuviera tanto benzoato de sodio como sorbato de potasio en partes iguales para una concentración total de (965 ± 15) mg/kg de ambos. Esto porque en este caso también se quería probar una concentración cercana al límite máximo permitido que es de 1000 mg/kg para dicha mezcla (COMIECO, 2012; FAO y OMS, 2018). Finalmente, se evaluó otro tratamiento sin preservante, como control positivo. De esta forma se tuvieron cinco tratamientos en total. Cada antimicrobiano se pesó en una balanza analítica dentro de un recipiente estéril. Luego se agregó al jugo, el cual, se encontraba previamente en un beaker con una pastilla de agitación (ambos estériles). Se agitó el jugo con cada antimicrobiano durante 20 minutos, en una plantilla con agitación, a 400 rpm (revoluciones por minuto). Además, se aseguró que todos los tratamientos utilizaran un jugo del mismo lote para evitar la variabilidad asociada con este factor. Cada tratamiento se colocó en botellas de vidrio según el procedimiento señalado en la sección 4.5.3. y también se preparó una botella de cada tratamiento para cada tiempo de muestreo para reducir la probabilidad de contaminación y los efectos asociados al cambio de volumen en las muestras. Seguidamente, se preparó el inóculo con la misma cepa descrita en la sección 4.5.1. y se siguió el procedimiento que se señaló en la sección 4.5.2. También la inoculación de los jugos se hizo igual que en la sección 4.5.3. Como se señala en esta misma sección, se realizó un recuento con el jugo sin inocular para comprobar la ausencia previa del microorganismo en el mismo y otro con el jugo al ser inoculado para conocer la población del inóculo inicial. Además, se tuvo un control negativo el cual no se inoculó con el microorganismo y se realizó un recuento de A. acidoterrestris el último día de muestreo. Por último, estos jugos se incubaron a 45 °C durante todo el experimento. Lo anterior corresponde a una repetición del experimento, esto se repitió dos veces más para un total de tres repeticiones. 28 4.6.5. Muestreos periódicos y recuentos de A. acidoterrestris en los jugos de naranja con los diferentes preservantes Los muestreos para este objetivo se realizaron en los primeros tres días luego de inocular los jugos, luego en el día 5, el día 7, el día 15 y el día 22. Estos se hicieron tal y como se señaló en la sección 4.5.5. 4.7. Efecto de la variación en la concentración de nisina sobre el crecimiento de A. acidoterrestris en jugo de naranja 4.7.1. Tratamiento de las muestras e inoculación Se siguió el mismo procedimiento que con los demás antimicrobianos, como se describió en la sección 5.6.4. Solamente que en este caso los tratamientos fueron los siguientes: Nisina (59 ± 2 mg/kg), nisina (30 ± 1 mg/kg), nisina (15 ± 1 mg/kg), nisina (7,47 ± 0,02 mg/kg) y un control positivo sin nisina. La nisina utilizada fue la misma que la señalada en la sección 5.6.1. Estas concentraciones se decidieron con base en las recomendaciones del fabricante y con base en pruebas preliminares. Seguidamente, se preparó el inóculo con la misma cepa descrita en la sección 4.5.1. y se siguió el procedimiento que se señaló en la sección 4.5.2. La inoculación de los jugos se hizo igual que en la sección 4.5.3 incluyendo el recuento en el jugo sin inocular para comprobar la ausencia previa del microorganismo en el mismo y otro con el jugo al ser inoculado para conocer la población del inóculo inicial en la muestra. Además, se tuvo un control negativo, el cual no se inoculó con A. acidoterrestris y se realizó un recuento de este microorganismo el último día de muestreo. Por último, estos jugos se incubaron a 45 °C durante todo el experimento. Lo anterior corresponde a una repetición del experimento, esto se repitió dos veces más para un total de tres repeticiones. 4.7.2. Muestreos periódicos y recuento de A. acidoterrestris en los jugos de naranja con diferentes concentraciones de nisina Los muestreos se realizaron en los primeros tres días luego de inocular los jugos, luego en el día 5, el día 7, el día 15 y el día 22. Los recuentos se hicieron tal y como se señaló en la sección 4.5.5. 29 4.8. Diseño Experimental y Análisis Estadístico Se tuvo un diseño irrestricto aleatorio en el que el tipo de jugo fue la variable independiente. A su vez se tuvieron seis tratamientos en el primer objetivo, cinco en el segundo y cinco en el tercero. Para el primer objetivo los tratamientos fueron cada tipo de jugo utilizado (4 marcas comerciales y 2 de elaboración propia), en el segundo objetivo cada preservante (benzoato de sodio, sorbato de potasio, una mezcla de benzoato de sodio y sorbato de potasio y nisina) y el control positivo sin preservante y en el tercero cada una de las cuatro concentraciones de nisina evaluadas y el control positivo sin nisina. Tal y como se describe en cada apartado, se realizaron tres repeticiones del experimento en cada uno de los tres objetivos. 4.8.1. Análisis Estadístico Aplicado al Objetivo 1 En cuanto a la caracterización fisicoquímica, para cada análisis (pH, acidez total, concentración de sólidos solubles, concentración de polifenoles totales y concentración vitamina C) se calculó el promedio de los valores obtenidos en las tres repeticiones, junto con su desviación estándar. En cuanto al estudio de sobrevivencia, primero, se aplicó un ANDEVA para determinar si existían diferencias significativas entre las poblaciones iniciales de todos los tratamientos evaluados. Luego, se aplicó otro ANDEVA para determinar si existían diferencias significativas entre las poblaciones finales de dichos tratamientos. Seguidamente, para el análisis de resultados en los jugos en los que se dio un crecimiento exponencial del microorganismo, se utilizó un modelo logístico de tres parámetros para modelar su comportamiento, dado que fue el modelo que se ajustó de mejor forma a los resultados obtenidos (Pla et al., 2015). El mismo sigue la ecuación 1: log (𝑝𝑜𝑏𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛) = 𝑐 1 + 𝑒−𝑎(𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜−𝑏) (1) 𝑎: 𝑡𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑏: 𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑓𝑙𝑒𝑥𝑖ó𝑛 𝑐: 𝑎𝑠í𝑛𝑡𝑜𝑡𝑎 Con esta ecuación se calculó, mediante predicción inversa, el tiempo en el que se alcanzaría la población crítica de cinco logaritmos, a partir de la cual se ha señalado que se 30 percibe sensorialmente el deterioro en el jugo (Pettipher et al., 1997). Además, se analizó el parámetro c, que corresponde a la población estabilizada del microorganismo. Se calculó el promedio y la desviación estándar de cada uno de estos parámetros para cada tratamiento y se realizó un ANDEVA para determinar si existían diferencias significativas entre ellos. Al haber diferencias significativas entre los valores del tiempo crítico y la asíntota (c) (P < 0.05), se aplicó la prueba Tukey. En el caso del jugo en el que el comportamiento de la población del microorganismo a través del tiempo tendió a decrecer levemente, se aplicó una regresión lineal simple. Esta sigue la ecuación 2: log (𝑝𝑜𝑏𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛) = 𝑎 + 𝑏 ∗ 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 (2) 𝑎: 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜 𝑏: 𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 Con la ecuación (2), se determinó si la pendiente era o no significativamente diferente de cero. Además, se hizo utilizó la prueba t-student para comparar entre la población y final de A. acidoterrestris en este jugo. Para todos los análisis se utilizó el programa JMP 9 y se estableció un nivel de significancia del 5%. En los casos en los que no se detectaron diferencias significativas luego de aplicar el ANDEVA, se calculó la potencia de la prueba (valor β) según el método descrito por Pearson y Hartley (1951), empleando el número de tratamientos (k) y repeticiones (n) en cada caso, un valor de α de 0.05, una diferencia mínima relevante por detectar (δ) de 1 log UFC/ml y asumiendo como varianza (s2) el error experimental obtenido (CME). 4.8.2. Análisis Estadístico Aplicado a los Objetivos 2 y 3 Se aplicó un ANDEVA para determinar si existían diferencias significativas entre las poblaciones iniciales de todos los tratamientos evaluados. Luego, para los controles positivos se utilizó un modelo logístico de tres parámetros, tal y como se hizo en el objetivo 1, siguiendo la ecuación (1) del punto 4.8.1. Con dicha ecuación se calculó el tiempo para alcanzar la población crítica de 5 logaritmos y la población estabilizada del microorganismo (parámetro c). 31 Para los tratamientos con antimicrobianos, el comportamiento del microorganismo se ajustó a una regresión lineal simple, la cual sigue la ecuación (2) del punto 4.8.1. Por lo que para conocer si sus pendientes eran significativamente diferentes de cero, se utilizó una regresión lineal múltiple. Luego, se aplicó un ANDEVA para determinar si existían diferencias significativas entre las poblaciones finales de estos tratamientos. Una prueba de t-student se aplicó a cada tratamiento para comparar su población inicial con su población final. Para todos los análisis se utilizó el programa JMP 9 y se estableció un nivel de significancia del 5%. En caso de no obtener diferencias significativas, se calculó la potencia de la prueba. En los casos en los que no se detectaron diferencias significativas luego de aplicar el ANDEVA, se calculó la potencia de la prueba (valor β) según el método descrito por Pearson y Hartley (1951), empleando el número de tratamientos (k) y repeticiones (n) en cada caso, un valor de α de 0.05, una diferencia mínima relevante por detectar (δ) de 1 log UFC/ml y asumiendo como varianza (s2) el error experimental obtenido (CME). 32 5. Resultados y Discusión 5.1. Objetivo Específico 1: “Determinar las cinéticas de sobrevivencia de A. acidoterrestris en seis jugos de naranja del mercado costarricense” En el Cuadro III se observa la caracterización fisicoquímica de los jugos en los cuales se evaluó el crecimiento de A. acidoterrestris que se realizó con el fin de conocer las condiciones a las que estuvo sometido este microorganismo y así entender cómo estas pudieron afectar su desarrollo. Cuadro III. Caracterización fisicoquímica de los seis jugos de naranja utilizados en el estudio de sobrevivencia de A. acidoterrestris (valor promedio ± desviación estándar, n = 3). Jugo Característica Fisicoquímica Acidez total (g ácido cítrico/100 g jugo) pH ° Brix Polifenoles totales (mg ácido gálico/100 g jugo) Concentración de Vitamina C (mg / 100 g jugo) Natufruit 0,57 ± 0,04 3,63 ± 0,01 11,3 ± 0,8 19,8 ± 1,1 No detectable (˂ 2,7) Del Valle 0,82 ± 0,01 3,80 ± 0,02 11,1 ± 0,1 34,6 ± 6,0 22,1 ± 2,5 Dos Pinos Estable a Temperatura Ambiente 0,67 ± 0,09 3,79 ± 0,07 10,6 ± 0,1 26,3 ± 9,5 34,9 ± 1,7 Tropicana 0,65 ± 0,06 3,91 ± 0,07 11,0 ± 0,3 30,8 ± 5,4 27,9 ± 4,1 Dos Pinos Refrigerado 1,0 ± 0,1 3,72 ± 0,02 11,8 ± 0,2 27,4 ± 5,7 26,3 ± 3,4 Naranjas Frescas 0,84 ± 0,02 3,76 ± 0,01 10,2 ± 0,8 21,4 ± 2,8 15,6 ± 2,7 Los valores obtenidos de acidez total son similares a otros encontrados en la literatura. Por ejemplo, para jugos a partir de variedades de naranjas comúnmente utilizadas como la 33 Valencia y la Navelina se han obtenido valores de (0,58 – 1,67) g de ácido cítrico/100 g de jugo según el grado de madurez de la naranja (Hours et al., 2005). Sin embargo, este parámetro normalmente no es tan representativo como el pH para analizar la viabilidad de crecimiento de A. acidoterrestris en este tipo de matriz. En el caso de este último, según la variedad se han obtenido valores entre 3,40 ± 0,18 (Valencia) y 3,77 ± 0,31 (Navelina) (Hours et al., 2005), rango dentro del cual se encuentran todos los valores de pH obtenidos experimentalmente. Según Bevilacqua y otros (2008a), A. acidoterrestris puede crecer en un rango de pH entre 2,0 y 6,0. Además, en otros estudios se ha comprobado que medios nutritivos con valores de pH entre 3,5 y 4,5 o entre 3,7 y 4,7 permiten un crecimiento acelerado de este microorganismo (Sinigaglia et al., 2003; Hui et al., 2020). Así que, en términos de acidez y específicamente expresada como pH, se puede decir que todos los jugos evaluados son medios óptimos para el crecimiento de este microorganismo. En el caso del contenido de sólidos solubles (expresados como grados Brix), se hubiese esperado que todos los jugos elaborados a partir de concentrado (Natufruit, Del Valle y Dos Pinos estable a temperatura ambiente) presentaran valores entre 11,2 y 11,8 (CODEX STAN 245-2005). Sin embargo, el jugo Dos Pinos estable a temperatura ambiente presentó un valor menor (10,6 ± 0,1), lo cual no debería ocurrir dado que, al reconstituirse se debería asegurar que sus sólidos solubles alcancen los valores señalados. En el caso de los demás jugos, su contenido de sólidos solubles es similar al de otros jugos que se han obtenido a partir de la fruta fresca, los cuales se encuentran entre 8,7 y 10,8 (Niu et al., 2008). De igual forma, en todos los casos, los valores de sólidos solubles fueron menores a 18, valor mínimo a partir del cual se ha observado un efecto inhibitorio sobre A. acidoterrestris en jugo de manzana, en condiciones óptimas de temperatura (Peña et al., 2011). Por lo tanto, en relación con este parámetro, las condiciones en todos los jugos muestreados son apropiadas para el crecimiento de esta bacteria. Por su parte, los valores de polifenoles totales se asemejan a los encontrados en la literatura, que van de 18,58 a 50,25 mg de ácido gálico / 100 g de muestra (Stella et al., 2011). En este caso, solamente se ha observado inhibición del crecimiento de A. acidoterrestris en jugo de uvas rojas asociado no solo con su alto contenido de polifenoles, sino con la presencia de polifenoles neutros como el catequín-galato y las antocianinas (Splittstoesser et al., 1994). 34 En el caso del jugo de naranja, el contenido de polifenoles es mucho menor y son otros polifenoles como los flavanona glucósidos (ej. Hesperidina) los que se encuentran presentes (Burin et al., 2010; Rangel-Huerta et al., 2015). Por lo tanto, no se esperaría ningún efecto inhibitorio por parte de este componente en los jugos evaluados. Por último, en cuanto a la concentración de vitamina C, los valores experimentales obtenidos también coinciden con los encontrados en la literatura para jugo de naranja (Stella et al., 2011). Una excepción fue el caso del jugo Natufruit, el cual ni siquiera presentó una concentración detectable de este compuesto. Esto es posiblemente porque este jugo recibió dos tratamientos térmicos, uno por parte de la empresa que lo procesó inicialmente y otro realizado en la planta piloto del CITA para lograr que fuese estable a temperatura ambiente. Dado que esta vitamina es termosensible, dicha exposición al calor pudo haberla degradado considerablemente (Zhang et al., 2016). En relación con el efecto de este compuesto sobre A. acidoterrestris, la única información encontrada en la literatura que se refiere a este parámetro indica que en jugo de manzana, concentraciones de 5 a 10 mg de ácido ascórbico/100 ml de jugo promueven el crecimiento de A. acidoterrestris, mientras que concentraciones de 15 mg de ácido ascórbico/100 ml de jugo lo inhiben (Bahaҁeci & Acar, 2007). Sin embargo, este no se considera un parámetro de referencia para jugo de naranja, dado que se sabe que las concentraciones de este compuesto suelen ser mayores en esta matriz y a pesar de esto, el crecimiento de A. acidoterrestris en este jugo ya ha sido comprobado (Pettipher et al., 1997; Eiroa et al., 1999; Komitopoulou, 1999; Gocmen et al., 2005; Stella et al., 2011; Kakagianni et al., 2018). Con base en lo discutido previamente y en los resultados de otras investigaciones en las que se ha observado el crecimiento de A. acidoterrestris, se esperaba este mismo comportamiento en los jugos de naranja evaluados en este estudio (Pettipher et al., 1997; Eiroa et al., 1999; Komitopoulou, 1999; Sinigaglia et al., 2003; Gocmen et al., 2005; Rivera, 2009; Pérez-Cacho, 2011; Kakagianni et al., 2018), no solo porque las características fisicoquímicas de los jugos eran apropiadas para el crecimiento de este microorganismo, sino porque además se ajustó el espacio de cabeza y la temperatura de almacenamiento para dar las condiciones idóneas para su desarrollo (Sinigaglia et al., 2003; Gocmen et al., 2005). Esto se comprobó experimentalmente, como se muestra en la Figura 3. Sin embargo, en la presente 35 investigación dicho crecimiento no ocurrió en todos los jugos, dado que en el jugo Natufruit la población tuvo una tendencia a una leve disminución. Figura 3. Cinéticas de sobrevivencia de A. acidoterrestris en seis jugos de naranja del mercado costarricense almacenados a 45 ± 2°C durante 21 días. Es importante señalar que no se encontraron diferencias significativas entre las poblaciones iniciales de A. acidoterrestris de los jugos evaluados (P = 0,3872 y valor β = 0,91), lo que indica que este factor no causó diferencias en el comportamiento de esta bacteria en los diferentes jugos. Luego, al comparar las poblaciones finales de los seis jugos analizados, se determinó que existen diferencias significativas entre las mismas (P ˂ 0,0001). A su vez, se identificó que la población final de (1,9  0,2) log UFC/ml del jugo Natufruit fue la única diferente a las demás. Entre las poblaciones de los jugos restantes, no se presentaron diferencias significativas (P = 0,2374 y valor β = 0,65) y fueron considerablemente mayores a la población en el jugo Natufruit (P ˂ 0,0001). Específicamente en el caso del jugo Natufruit, se analizó la pendiente de la recta que modela el comportamiento de A. acidoterrestris y se determinó que esta es significativamente diferente de cero (P = 0,0014). Esto comprueba lo observado en la Figura 3, indicando que la población del microorganismo tiende a descender con el paso del tiempo. Sin embargo, esta reducción en la población es muy leve dado que al comparar la población inicial con la 36 final del microorganismo en este jugo no se obtuvieron diferencias significativas (P=0,0960). De igual forma, se esperaba el crecimiento de A. acidoterrestris en este jugo, ya que el mismo no presentó mayor diferencia en su composición en comparación con los demás jugos, excepto por el contenido de vitamina C (ver Cuadro III). La única referencia encontrada en la literatura sobre esta sustancia y su relación con el crecimiento de esta bacteria se mencionó previamente y no hace acotación a un efecto como el ocurrido en este caso (Bahaҁeci & Acar, 2007). Por lo que, se considera posible que este comportamiento se deba a algún compuesto altamente inhibitorio, que se desconozca, se encuentre presente en este jugo. En el caso de los cinco jugos en los que A. acidoterrestris creció con facilidad, se calculó el tiempo crítico requerido para que este microorganismo alcanzara una población de 5 logaritmos (los resultados obtenidos se resumen en el Cuadro IV). Esto porque diferentes estudios han comprobado que a partir de esta población, la producción de guayacol en el jugo es suficiente para que las personas puedan detectar el deterioro del producto (Pettipher et al., 1997; Komitopoulou et al., 1999). Cuadro IV. Población estabilizada y tiempo necesario para alcanzar una población de 5 logaritmos de A. acidoterrestris en cinco jugos de naranja del mercado costarricense almacenados a 45 ± 2°C durante 21 días. Jugo Tiempo crítico para alcanzar población de 5 logaritmos de A. acidoterrestris (días) Población estabilizada de A. acidoterrestris (log UFC/ml) Dos Pinos Refrigerado 3,0 ± 0,6a 7,79 ± 0,05a Dos Pinos Estable a Temperatura Ambiente 1,9 ± 0,1ab 7,4 ± 0,1bc Del Valle 3,1 ± 0,9a 7,6 ± 0,2ab Naranjas Frescas 2,7 ± 0,7ab 7,9 ± 0,1a Tropicana 1,43 ± 0,08b 7,1 ± 0,2c Letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas entre las medias (P < 0,05). El mayor valor obtenido para este parámetro resultó de tan sólo tres días, lo cual es, tanto en el caso de jugos refrigerados como en el de jugos estables a temperatura ambiente, 37 un lapso de tiempo considerablemente menor al de su vida útil (López-Gómez et al., 2010). Este hallazgo es un indicador de la amenaza que representa el microorganismo estudiado para la industria de jugos de naranja del país y a nivel global. Cabe destacar que, al comparar los valores obtenidos para el parámetro calculado con cada uno de los cinco jugos, existen diferencias significativas entre estos (P = 0,0202). En el Cuadro IV se puede observar como el jugo Tropicana, el jugo de naranjas frescas y el jugo Dos Pinos estable a temperatura ambiente alcanzaron una población de 5 logaritmos en el menor tiempo. Esta fue la razón por la que se escogió un jugo de este grupo para evaluar el efecto de diferentes antimicrobianos sobre el crecimiento de A. acidoterrestris en los siguientes objetivos. Los jugos Del Valle y Dos Pinos refrigerado fueron los que más tardaron en alcanzar la población definida como crítica (3,1 ± 0,9 y 3,0 ± 0,6 días, respectivamente). En este caso, se dificulta conocer la razón de las diferencias observadas basándose únicamente en las características fisicoquímicas de los jugos, pues las mismas son muy similares y no se observa un patrón claro que los diferencie unos de otros. Sin embargo, se podría pensar que las diferencias obtenidas podrían radicar en variaciones en las condiciones de procesamient