PORTADA UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO UNA REVISIÓN DE LA LITERATURA ACERCA DE LA HISTOPLASMOSIS: LA MICOSIS DEL VIAJERO Trabajo final de investigación aplicada sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Especialidades en Microbiología para optar por el grado y título de Especialidad Profesional en Micología Médica RAÚL ENRIQUE MATAMOROS SUÁREZ Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2021 ii iii DEDICATORIA A Dios, quien me dio fortaleza para seguir adelante, y a mi madre y mi padre, por nunca dejarme desfallecer en mis sueños, gracias por esto. AGRADECIMIENTOS Agradezco a la Dra. Stefany Lozada Alvarado por supervisar esta revisión, al Dr. Allan Valverde Vindas y al personal docente de la Especialidad de Micología Médica de la Universidad de Costa Rica, por todo el conocimiento transmitido a través del transcurso de dicho posgrado. iv HOJA DE APROBACIÓN v TABLA DE CONTENIDOS PORTADA _______________________________________________________ i DEDICATORIA __________________________________________________ iii AGRADECIMIENTOS _____________________________________________ iii HOJA DE APROBACIÓN __________________________________________ iv RESUMEN ______________________________________________________ vii LISTA DE CUADROS ____________________________________________ viii LISTA DE FIGURAS ______________________________________________ ix LISTA DE ABREVIATURAS ________________________________________ xv 1-GENERALIDADES _______________________________________________ 1 1.1-Definición ___________________________________________________ 1 1.2-Sinonimia ___________________________________________________ 4 1.3-Historia _____________________________________________________ 4 2-ETIOLOGÍA ____________________________________________________ 9 2.1-Descripción de los agentes etiológicos _____________________________ 9 2.2-Aspectos genéticos ___________________________________________ 15 2.3-Dimorfismo _________________________________________________ 23 3-ECOLOGÍA ____________________________________________________ 26 4-ASPECTOS VETERINARIOS ______________________________________ 28 5-EPIDEMIOLOGÍA _______________________________________________ 43 5.1-Distribución Geográfica ________________________________________ 43 5.2-Frecuencia _________________________________________________ 46 5.3-Fuentes de Infección y vías de entrada ___________________________ 59 5.4-Etnia, sexo y edad ___________________________________________ 62 5.5-Período de incubación ________________________________________ 62 5.6-Factores predisponentes ______________________________________ 63 6-PATOGÉNESIS ________________________________________________ 68 6.1-Historia natural de la enfermedad ________________________________ 68 6.2-Factores de Virulencia ________________________________________ 70 7-RESPUESTA INMUNE ___________________________________________ 97 7.1-Inmunología de la histoplasmosis ________________________________ 97 vi 7.2-Vacunas e Inmunización Pasiva ________________________________ 121 8-MANIFESTACIONES CLÍNICAS __________________________________ 126 8.1-Histoplasmosis capsulati o Histoplasmosis Americana _______________ 129 8.2-Histoplasmosis duboisii o Histoplasmosis Africana__________________ 147 9-DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL ___________________________________ 150 10-DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO ______________________________ 153 10.1-Diagnóstico micológico ______________________________________ 153 10.2-Diagnóstico histopatológico __________________________________ 162 10.3-Diagnóstico serológico, molecular, detección de antígeno, intradermorreacción y otras técnicas _______________________________ 165 11-TRATAMIENTO ______________________________________________ 187 12-PRONÓSTICO Y PREVENCIÓN _________________________________ 194 13-MODELOS DE INFECCIÓN _____________________________________ 197 14-CONCLUSIONES _____________________________________________ 201 14-REFERENCIAS ______________________________________________ 203 vii RESUMEN La histoplasmosis es una enfermedad fúngica cosmopolita de tipo granulomatosa sistémica producida por un hongo dimórfico termonutricional conocido como Histoplasma capsulatum. A pesar de que la enfermedad se considera autolimitada en pacientes inmunocompetentes, con el aumento de pacientes inmunosupresos en los últimos años, se han reportado nuevos casos de histoplasmosis diseminada, especialmente en paciente HIV positivos en fase SIDA donde la enfermedad se caracteriza por una alta mortalidad y morbilidad. Adicionalmente, la enfermedad es capaz de afectar una gran variedad de animales que incluyen a los animales domésticos como los perros y los gatos por lo que representa también un problema de salud para el ámbito veterinario. Se registran brotes en turistas que visitan países que son endémicos de esta enfermedad o que presentan el hábitat natural del agente etiológico como lo son las cuevas donde habitan murciélagos. Por esta razón, se considera a la histoplasmosis como una de las enfermedades más frecuentes en turistas, siendo está incluida en el Health Information for International Travel Yellow Book, donde se le ha llamado la micosis del viajero. El agente etiológico se divide en tres variedades: Histoplasma capsulatum var. capsulatum que produce la forma clásica de histoplasmosis en el continente americano, Histoplasma capsulatum var. duboisii que es el agente etiológico de la histoplasmosis en el continente africano e Histoplasma capsulatum var. farciminosum causante de la linfangitis epizoótica en caballos en África. Este hongo cuenta con un amplio arsenal de factores de virulencia que le van a permitir sobrevivir en el ambiente intracelular de los macrófagos de modo que es capaz de evadir la respuesta inmunológica del hospedero. En la presente revisión se describirá al agente etiológico, la ecología del hongo, su clasificación taxonómica, la epidemiología y patogenia de la enfermedad, así como los factores de virulencia del hongo y la respuesta inmunológica despertada en el ser humano, el tratamiento y el diagnóstico de la histoplasmosis, entre otros. viii LISTA DE CUADROS Cuadro I. Primers utilizados en la amplificación y detección de las regiones expecíficas del “locus del tipo de apareamiento” MAT1 de Histoplasma capsulatum en la técnica de PCR para la determinación del idiomorfo de los aislamientos (información tomada de Bubnick y Smulian, 2007). _________ 13 Cuadro II. Primers utilizados en la amplificación y detección de la secuencia parcial de cuatro genes de Histoplasma capsulatum en la técnica de PCR, entre otras, para la discriminación entre aislamientos (información tomada de Kasuga et al, 2003 y Sepúlveda et al, 2017). ___________________________________ 18 Cuadro III. Países endémicos de histoplasmosis por región y otros lugares con menor reporte de casos (información tomada de Diaz, 2018; Gómez, 2011; Sánchez et al, 2010 y Teixeira et al, 2016). __________________________ 44 Cuadro IV. Casos publicados de histoplasmosis en la población de Costa Rica (total de 116 casos). ________________________________________________ 49 Cuadro V. Células fagocíticas involucradas en la inmunidad innata contra Histoplasma capsulatum, y algunos de los receptores involucrados en el reconocimiento de los antígenos fúngicos (información tomada de Ray y Rappleye, 2018). ______________________________________________ 99 Cuadro VI. Primers utilizados en la amplificación y detección de los diferentes blancos moleculares de Histoplasma capsulatum en la técnica de PCR anidado para el diagnóstico de histoplasmosis (información tomada de Dantas et al, 2018). _____________________________________________________ 177 Cuadro VII. Tratamiento para diferentes cuadros clínicos de histoplasmosis según la condición del paciente (Información tomada de Chander, 2018; Chang y Rodas, 2012; Diaz, 2018 y Sánchez et al, 2010). ____________________ 188 ix LISTA DE FIGURAS Figura 1. Fase teleomorfa de Histoplasma capsulatum conocida como Ajellomyces capsulatus observada en lactofenol azul, reproducida en el experimento de la Dra. Kwon Chung en 1972. A) Cleistotecio, las flechas indican hifas enrolladas en la periferia de la estructura (300X). B) Ascocarpo donde se observa tres hifas ascógenas enrolladas (485X). C) Racimo de ascas jóvenes (750X). D) Ascas maduras con ascosporas (1250X) (imagen tomada de Kwon Chung, 1972). 11 Figura 2. Distribución geográfica de los clados y linajes de Histoplasma capsulatum a partir del estudio de Kasuga et al (2003) en 17 aislamientos provenientes de 25 países (imagen tomada de Vite et al, 2014). ______________________ 19 Figura 3. A-B) Nódulos en puente nasal, C) pápulas en el pabellón de la oreja y D) lesión crónica en la zona radial de la pata izquierda (imagen inferior derecha) de una gata con histoplasmosis (imagen tomada de Larsuprom et al, 2017). 31 Figura 4. Levaduras intracelulares en macrófagos vistas en biopsias al teñir preparaciones en PAS, 100X (imagen tomada de Larsuprom et al, 2017). __ 32 Figura 5. A) Pápulas en el área dorsal del cuello y B) encía eritematosa e hinchada al día 20 de la infección (imagen tomada de Ortiz et al, 2015). ___________ 34 Figura 6. Levaduras intracelulares en macrófagos epitelioides vistas en aspirado submandibular tomado con agua fina y teñido con tinción Diff-Quick®, 1000X (imagen tomada de Ortiz et al, 2015). ______________________________ 34 Figura 7. A) Múltiples lesiones correspondientes a nódulos de inflamación granulomatosa en pulmones de un gato doméstico con histoplasmosis diseminada. B) Levaduras intracelulares en una célula gigante multinucleada en muestra de bazo teñida en hematoxilina eosina (600X). C) Micelio hialino septado y macroconidias tuberculadas de Histoplasma capsulatum visto en lactofenol azul (100X) (imagen tomada de Alfaro et al, 2019). ___________ 36 Figura 8. A) Lesiones nodulares y ulcerosas de un caballo con linfangitis epizoótica en Etiopía. B) Nódulos con un patrón en cadena en rostro (imagen tomada de Guillot et al, 2018). _____________________________________________ 41 Figura 9. A) Lesiones cutáneas en extremidad anterior y B) cabeza en un burro, C) donde se observa levaduras de Histoplasma capsulatum var. farciminosum, en el examen directo del exudado purulento de las lesiones al teñir en Gram (imagen tomada de Powell et al, 2015). ____________________________ 42 Figura 10. Distribución geográfica de Histoplasma capsulatum var. capsulatum (áreas moradas) e Histoplasma capsulatum var. duboisii (áreas sombreadas) alrededor del mundo. Los círculos indican los casos reportados de histoplasmosis en pacientes HIV positivos en fase SIDA autóctonos de cada país (imagen tomada de Bahr et al, 2015). __________________________ 43 x Figura 11. Ciclo de vida de Histoplasma capsulatum en el ser humano, se observa de color rojo las microconidias (forma infectante) y macroconidias, donde las primeras logran ingresar a vías respiratorias al ser inhaladas e invaden neutrófilos y macrófagos (representado de color verde en la imagen) (imagen tomada de Bonifaz, 2020). _______________________________________ 68 Figura 12. Conformación de las α-glucanas, donde se observa la estructura de la D-glucosa unida por enlaces de tipo α-1,4-glucosil en este caso (imagen tomada de Lara et al, 2014). ____________________________________________ 75 Figura 13. Conformación de las β-glucanas, compuesta por unidades repetidas de D-glucosa, donde se observa la estructura de la D-glucosa unida por enlaces de tipo β-1,3-glucosil con ramificaciones que se unen a la cadena principal mediante enlaces de tipo β-1,6-glucosil (imagen tomada de Lara et al, 2014). ____________________________________________________________ 76 Figura 14. La imagen A de la izquierda se observa la composición de la pared y la membrana celular de Histoplasma spp. en fase micelial y la imagen B a la derecha corresponde a la fase levaduriforme del quimiotipo II (imagen tomada de Lara et al, 2014). ____________________________________________ 77 Figura 15. Evasión de los mecanismos microbicidas de la fagocitosis por parte de las levaduras de Histoplasma capsulatum. La máscara de α-glucanas y la endoglucanasa disminuye el reconocimiento de las β-glucanas por parte de la Dectina-1 por tanto el desarrollo de una respuesta proinflamatoria. La Sod3 y CatB protegen al microorganismo de las especies reactivas de oxígeno producto del complejo NADPH oxidasa celular (Phox) de los fagocitos. También las levaduras expresan la Cpb1 ante bajas concentraciones de calcio para quelarlo y ponerlo a disposición del hongo (imagen tomada de Shen y Rappleye, 2017). ______________________________________________________ 88 Figura 16. Respuesta de Histoplasma capsulatum ante la deprivación de hierro y zinc intracelular e hipoxia. Producto del IFN-γ y el GM-CSF producidos en la respuesta inmune tardía, se genera en el macrófago activado una disminución de receptores de transferrina en el fagocito y una redistribución de zinc hacia el aparato de Golgi y metalotioneínas, por lo que el hongo expresa sideróforos para adquirir hierro y el transportador de zinc Zrt2, para adquirir zinc. También ante la hipoxia, la levadura produce el factor de transcripción Srb1 para expresar genes HRG de sobrevivencia ante hipoxia (imagen tomada de Shen y Rappleye, 2017). ______________________________________________________ 91 Figura 17. Reconocimiento antigénico de Histoplasma capsulatum por parte de los fagocitos profesionales de la inmunidad innata. Se observa el reconocimiento de la Hsp60 por parte del macrófago mediante el CR3, de las β-1,3-glucanas mediante la Dectina-1 y la Yps3 mediante el TLR-2, con la subsecuente cascada de señalización que puede o no permitir el control de la infección. También se evidencia el reconocimiento de las células dendríticas mediante los mismos xi receptores que el macrófago, pero adicionalmente mediante el receptor VLA-5, lo que constituye una vía alternativa que sí logra el control de la infección promoviendo una respuesta TH1. Adicionalmente, se ve que las células dendríticas reconocen también las mananas mediante la Dectina-2 y que los TLR-7 y TLR-9 podrían promover la respuesta inmune al reconocer ácidos nucleicos de las levaduras producto de su destrucción. Los neutrófilos al igual que los demás polimorfonucleares reconocen el patógeno, pero opsonizado (por ejemplo, por el C3bi o por anticuerpos) mediante receptores como el CR1, CR3 y FCγRIII, en donde la respuesta desencadenada tampoco es capaz de controlar la infección, pero media un efecto fungistático gracias a la secreción de sus gránulos azurófilos (imagen tomada de Ray y Rappleye, 2018). ___ 102 Figura 18. Interacción entre los receptores de tipo CLR, Dectina-1 y Dectina-2 para desencadenar la activación del inflamasoma NLRP3/Caspasa 1, con la consecuente maduración de la IL-1β (imagen tomada de Salazar y Brown, 2018). _____________________________________________________ 107 Figura 19. Clasificación del cuadro clínico causado por las diferentes variedades de Histoplasma capsulatum (información tomada de Sánchez et al, 2010). __ 128 Figura 20. Paciente con histoplasmosis diseminada aguda donde se evidencia organomegalia (imagen tomada de Sánchez et al, 2010). _____________ 132 Figura 21. Lesiones orales en pacientes con histoplasmosis en un adulto (A) y un niño (B) (imagen tomada de Bonifaz, 2015). ________________________ 133 Figura 22. Lesiones nodulares en el rostro de paciente HIV positivo en fase SIDA con histoplasmosis diseminada (A y B) (imagen tomada de Chang y Rodas, 2012). _____________________________________________________ 139 Figura 23. Lesiones con aspecto de pápulas en el rostro de pacientes HIV positivos en fase SIDA con histoplasmosis diseminada (A y B). La imagen B muestra lesiones papulares un poco más hiperqueratócicas (imagen tomada de Chang y Rodas, 2012). ______________________________________________ 139 Figura 24. Lesiones con aspecto similar a molluscum contagiosum en rostro (A) y brazo (B) de paciente HIV positivo en fase SIDA con histoplasmosis diseminada (imagen tomada de Chang y Rodas, 2012). ________________________ 140 Figura 25. Lesiones con aspecto de placas hemorrágicas en rostro de paciente HIV positivo en fase SIDA con histoplasmosis diseminada (imagen tomada de Chang y Rodas, 2012). ________________________________________ 141 Figura 26. Estudio post mórtem de un paciente HIV positivo en fase SIDA con histoplasmosis diseminada e histoplasmoma en mesencéfalo. En la imagen A se evidencia la zona de inflamación granulomatosa con tejido necrótico (marcado con una flecha). En las imagenes B y C se observan levaduras semejantes a Histoplasma capsulatum (1000X) (B en GSM y C en hematoxilina eosina) (imagen tomada de Azizirad et al, 2007). ____________________ 142 xii Figura 27. Segmento de intestino delgado con áreas hemorrágicas y perforación con aspecto infiltrativo e inflamación, extraído de un paciente HIV positivo con histoplasmoma ileal (imagen tomada de Inocente et al, 2012). __________ 144 Figura 28. Paciente HIV positivo habitante de Senegal con recuento de células CD4+ de 4 células/mm3, que presenta lesiones papulonodulares, necróticas, ulceradas y umbilicadas diseminadas con afectación oral, y fiebre que evidencia presencia de levaduras extracelulares grandes (10 µm de diámetro) de doble contorno al examen directo de las lesiones, confirmado con cultivo (macroconidias tuberculadas) e histopatología (levaduras intracelulares en células gigantes multinucleadas) como histoplasmosis africana (imagen tomada de Ndiaye et al, 2011). _________________________________________ 148 Figura 29. Paciente agricultor de 22 años inmunocompetente habitante de Senegal. A) Presenta lesiones polimórficas en piel, principalmente lesiones papulonodulares umbilicadas (la flecha amarilla indica un nódulo carnoso) y linfadenopatía no inflamatoria. B) Geodo óseo (señalado con la flecha amarilla) en extremidad superior izquierda visto en la radiografía que demuestra desmineralización ósea. Confimado por histoplasmosis africana mediante la observación de levaduras grandes de doble contorno (10-12 µm de diámetro) al examen directo de biopsia de piel y ganglios linfáticos, y mediante cultivo en Agar Sabouraud Glucosado. El paciente fallece por cuadro de sepsis debido a la inaccesibilidad de la Anfotericina B como tratamiento en el país (imagen tomada de Diadie et al, 2016). ___________________________________ 149 Figura 30. Levaduras ovaladas y elongadas con septo central (señalada con una flecha) de Talaromyces (Penicillium) marneffei. Muestra teñida en Hematoxilina Eosina (100X) (imagen tomada de Kradin, 2017). ____________________ 152 Figura 31. Levaduras intracelulares en un examen directo con Blanco de Calcofluor a partir de una muestra de lavado bronquioalveolar (100X) (imagen de autoría propia)._____________________________________________________ 153 Figura 32. Levaduras intracelulares en un macrófago. Muestra teñida en Hematoxilina Eosina (120X) (imagen tomada de Bonifaz, 2015). ________ 154 Figura 33. Levaduras intracelulares en un neutrófilo. Muestra teñida en tinción de Wright (100X) (imagen cortesía del Dr. Allan Valverde Vindas, Especialista en Micología Médica). ____________________________________________ 154 Figura 34. Levaduras intracelulares en un histiocito. Muestra teñida en Giemsa(1000X) (imagen tomada de McCullough y Leslie, 2018). ________ 155 Figura 35. Levaduras intracelulares en un macrófago. Muestra teñida en PAS (1000X) (imagen tomada de Diaz, 2015). __________________________ 156 Figura 36. Levaduras intracelulares en un macrófago. Muestra teñida en GMS (1000X) (imagen tomada de Diaz, 2015). __________________________ 156 xiii Figura 37. Levaduras de Histoplasma capsulatum var. duboisii en una muestra de esputo teñido con tinción de Metanamina de Plata de un paciente con histoplasmosis africana (800X) (imagen tomada de Diaz, 2018). ________ 157 Figura 38. En la imagen A se observan dos tubos con colonias filamentosa de Histoplasma capsulatum con morfología de tipo B y en la imagen B se observa un tubo incubado a 25 °C con una colonia filamentosa y un tubo incubado a 37 °C con una colonia levaduriforme, ambas de Histoplasma capsulatum con una morfología de tipo A (imagen tomada y modificada de Bonifaz, 2015 y Chander, 2018). _____________________________________________________ 159 Figura 39. Colonia levaduriforme de Histoplasma capsulatum obtenida al inocular Agar Infusión Cerebro Corazón e incubar a 35 °C durante 28 días (imagen tomada de Ortiz et al, 2015). ____________________________________ 160 Figura 40. Micelio hialino septado y macroconidias tuberculadas de Histoplasma capsulatum (800X) (imagen tomada de Diaz, 2018). __________________ 161 Figura 41. Biopsia obtenida por aspirado transtorácico de aguja fina en paciente con histoplasmoma paratraqueal y paraesofágico. En la imagen A se observa tejido granulomatoso con zonas de necrosis (teñido en hematoxilina eosina, 100X) y en la imagen B se observa una levadura similar a Histoplasma capsulatum señalada con una flecha (teñido en GSM, 1000X) (imagen tomada de Richmond et al, 2013). ______________________________________ 163 Figura 42. Infiltrado histiocitario, con linfocitos, plasmocitos y macrófagos parasitados con microorganismos intracelulares, en paciente HIV positivo con histoplasmoma ileal. Preparación teñida con hematoxilina eosina (40X) (imagen tomada de Inocente, 2012). _____________________________________ 164 Figura 43. Estructuras fúngicas redondas pequeñas de pared gruesa con halo claro, visto en una biopsia de piel teñida con Hematoxilina Eosina (100X) (imagen de autoría propia). ______________________________________________ 164 Figura 44. Levaduras homogéneas, con una célula madre más grande que la célula hija, y base de implantación angosta, visto en una biopsia de piel teñida en Grocott (100X) (imagen de autoría propia). _________________________ 165 Figura 45. Banda de precipitación H y M, producto de la interacción de los anticuerpos presentes en el pocillo con suero del paciente y los antígenos de la histoplasmina depositados en el pocillo central, mediante la técnica de inmunodifusión en gel de Ouchterlony (imagen tomada de Arenas, 2015). 168 Figura 46. En la imagen A se observa la radiografía del tórax de un paciente con histoplasmosis primaria donde se evidencia lesiones micronodulares. En la imagen B se observa el TAC del paciente donde se ven los infiltrados nodulares (imagen tomada de Bonifaz, 2015). _______________________________ 183 xiv Figura 47. En la imagen A se observa la radiografía del tórax de un paciente con un histoplasmoma calcificado señalado con la flecha. En la imagen B se observa el TAC de tórax del paciente con el nódulo calcificado y adenopatías hiliares (imagen tomada de Fraser et al, 2006). ____________________________ 184 Figura 48. En la imagen A se observa la radiografía del tórax de un paciente con histoplasmosis miliar es decir que las lesiones diseminaron a todo el pulmón. En la imagen B se observa el TAC de tórax de un paciente con neumonía por histoplasmosis donde se ve el patrón característico de infiltrados nodulares miliares conocido como “patrón en tormenta” (imagen tomada de Bonifaz, 2015 y Diaz, 2018). ________________________________________________ 185 xv LISTA DE ABREVIATURAS BPI: Bactericidal Permeability Increasin Protein. CDC: Centers for Disease Control and Prevention. EIA: Enzyme Immunoassay. ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay. EPA: Environmental Public Health. EPOC: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica. HAART: Terapia Antirretroviral de Gran Actividad. HIV: Human Inmunodeficiency Virus. HRG: Hipoxia Responsive Genes. HS: genes Heat Shock HSP: Heat Shock Protein IDR: Intradermoreacción. IRIS: Inmune Reconstitution Inflammatory Syndrome. MIF: Macrophage Migration Inhibitory Factor. PAMP: Pathogen Associated Molecular Patterns. PAS: Periodic Acid Schiff. PCR: Polymerase Chain Reaction. PHD: Pulmonary Histoplasmosis Disseminated. POHS: Presumed Ocular Histoplasmosis Syndrome. POHS: Presumed Ocular Histoplasmosis Syndrome. PRR: Pattern Recognition Receptor. RAPD: Random Amplification of Polymorphism. RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism. ROI: Reactive Oxygen Intermediates. ROS: Reactive Oxygen Species. SIDA: Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida. SREBP: Sterol Regulatory Element Binding Protein. TNF-α: Tumor Necrosis Factor Alpha. WGA: Wheat Germ Agglutinin. 1 1-GENERALIDADES 1.1-Definición La histoplasmosis es una enfermedad micótica del tipo granulomatosa sistémica producida por Histoplasma capsulatum, un hongo dimórfico termo nutricional con tropismo por el sistema reticuloendotelial del hospedero (Colombo et al, 2011), para el cual las microconidias son la fase infectante y tras su inhalación, produce inicialmente un cuadro pulmonar o infección primaria pulmonar que puede diseminar hacia otros órganos y producir una infección cutánea aguda o crónica entre otras formas diseminadas (Sánchez et al, 2010). El aire es capaz de transportar las conidias en kilómetros por lo que individuos no expuestos al sitio de riesgo pueden llegar a infectarse (Colombo et al, 2011) considerándose al viento como el principal medio de diseminación ambiental del hongo (Chang y Rodas, 2012). En pacientes sanos, la histoplasmosis se considera una infección moderada o autolimitada, sin embargo, hay brotes en turistas que visitaron zonas endémicas como cuevas en Nicaragua, para los cuales se han reportado anormalidades pulmonares radiográficas a pesar de que eran pacientes inmunocompetentes (Sánchez, 2009). Pese a que la histoplasmosis no es una enfermedad de reporte obligatorio, se ha visto que presenta elevadas tasas de morbilidad y mortalidad en pacientes inmunocomprometidos, especialmente los pacientes HIV positivos (por sus siglas en inglés de Human Inmunodeficiency Virus) (Teixeira et al, 2016). Se estima que la mortalidad es cercana al 50 %, y entre los afectados también se registran pacientes trasplantados y con enfermedades inflamatorias crónicas. Los pacientes inmunosupresos han contribuido con el aumento de casos de histoplasmosis diseminada en los últimos años. En los pacientes HIV positivos en fase SIDA (Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida) que viven en zonas endémicas la diseminación ronda del 2-25 % de los casos (Gómez, 2011 y Teixeira et al, 2016). Se estima que en América Latina alrededor del 30 % de los pacientes HIV positivos en fase SIDA podrían morir de histoplasmosis (Teixeira et al, 2016). También se cree que, en países de Centroamérica, el 15 % de pacientes HIV positivos en fase 2 SIDA y con histoplasmosis, tendrán tuberculosis. Pero en países endémicos, incluyendo a Estados Unidos, se sabe que del 2-25 % de pacientes HIV positivos padecen de histoplasmosis (Diaz, 2018). En Colombia, el índice de mortalidad es del 37 % en pacientes HIV positivos en fase SIDA que reciben terapia antirretroviral HAART (por sus siglas en inglés de Highly Active Antiretroviral Therapy) y si padecen una histoplasmosis diseminada, el índice de mortalidad aumenta a 39 % dentro de los 3 meses posterior al diagnóstico, de lo contrario los pacientes que no reciben este tratamiento, mueren. En Guatemala se registra un índice de mortalidad similar, del 40 % en pacientes con histoplasmosis pulmonar diseminada (Gómez, 2011). En otro estudio retrospectivo, se ha registrado una mortalidad del 17 % de la histoplasmosis diseminada para pacientes inmunocompetentes (Colombo et al, 2011). Debido a la globalización, esta enfermedad figura también un problema para los turistas, así lo demuestra el sistema de vigilancia GeoSentinel (que está conformado por 25 clínicas para viajeros alrededor del mundo) quienes reportaron entre 1998 al 2002 que la histoplasmosis representaba más del 70 % de las micosis sistémicas adquiridas por viajeros alrededor del mundo, siendo de las más frecuentes junto a la coccidioidomicosis, por lo que están incluidas en las enfermedades relacionadas a viajes en el Health Information for International Travel Yellow Book (Sánchez, 2009). La mayoría de viajeros afectados son norteamericanos que visitaron zonas endémicas de Norteamérica (por ejemplo los valles del río Ohio, Mississippi y Missouri) o países de América Latina (como Martinica, Perú, Costa rica, Ecuador, Dominica, Belice, México, Nicaragua, Guatemala y el Salvador), donde el principal origen de la infección fue por visita a cuevas (brotes desde el año 1995 hasta el 2007) (Negroni, 2011 y Sánchez, 2009). En zonas endémicas de Estados Unidos, se ha informado de un total de 105 brotes entre 1938 al 2013 involucrando 2850 casos en 26 estados, incluyendo Puerto Rico, siendo el común exponente el contacto con gallineros y edificios en demolición o remodelación, donde en más del 77 % de casos se observó la presencia de aves, 3 murciélagos o el guano, además se estimó que del 15-27 % de personas infectadas requirieron hospitalización por sintomatología respiratoria con un 1 % de casos fatales por neumonía debida a histoplasmosis aguda (Diaz, 2018). Es curioso observar que de estos brotes, 9 fueron asociados a visitas de cavernas que pertenecían a lugares más hacia el sur de Estados Unidos, incluyendo Florida, Texas y Puerto Rico considerados como sitios no endémicos (Diaz, 2018). Además, se ha reportado brotes por la visita de otros ambientes, como por ejemplo el brote en un hotel en remodelación en Acapulco, México donde resultaron afectados 250 estudiantes norteamericanos, en el cual la fuente de la infección fue la tierra de macetas por lo que se sugiere que en zonas endémicas, los lugares con la presencia de guano no son necesarios para adquirir la infección (Sánchez, 2009). También se ha reporta un brote en viajeros españoles que participaron en la rehabilitación de una escuela en Guatemala (García et al, 2005). Otro brote asociado más bien a actividades laborales donde se facilitó la exposición a material contaminado es el ocurrido en la renovación de campos de Golf en Alberta, al Oeste de Canadá que incluía actividades como el corte de césped y árboles. La exposición y disrupción del suelo resultó en la generación de polvo, por tanto, en la inhalación de las microconidias del hongo, afectando a 4 personas que presentaron sintomatología sugerente y que fueron confirmados por histoplasmosis mediante la técnica de inmunodifusión ante la presencia de las bandas H y M, y la técnica de fijación del complemento. Es interesante recalcar que no se evidenció la presencia de guano de aves y murciélagos en el campo de golf (Anderson et al, 2006). Otros ejemplos de actividades relacionadas a brotes en zonas urbanas son la demolición en un parque en Iowa, Estados Unidos y la construcción de un complejo de tenis y la excavación para construir una piscina en Indiana, Estados Unidos. Hechos ocurridos entre las décadas de 1970 y 1980 (Anderson et al, 2006). 4 1.2-Sinonimia Se le conoce como enfermedad de Darling, histoplasmosis americana, histoplasmosis clásica, citomicosis, retículoendoteliosis, enfermedad de los murciélagos, enfermedad de las cuevas, fiebre de las cavernas y minas, enfermedad de los mineros y espeleólogos, fiebre de Tingo María, enfermedad del valle de Ohio, la micosis del viajero, tuberculosis fúngica (debido a la similitud del cuadro clínico pulmonar) y sífilis fúngica (por sus diversas manifestaciones clínicas) (Bonifaz, 2015; Chang y Rodas, 2012; Sánchez, 2009 y Sánchez et al, 2010). 1.3-Historia En el año 1873, Sebastiano Rivolta, un veterinario y bacteriólogo italiano, observó levaduras en caballos con linfagitis epizoótica por lo que creyó que el agente etiológico pertenecía al género Cryptococcus sp. (Rivolta y Micellone, 1883). Pero no es hasta el año 1905 que se describe por primera vez el agente etiológico en el ser humano por el médico patólogo norteamericano Samuel Darling, al realizar un estudio en Panamá a un paciente proveniente de Martinica que era obrero de la construcción del canal de Panamá, muerto por una presuntiva leishmaniasis sistémica. El obrero presentaba hepatoesplenomegalia, inflamación del bazo y daño pulmonar. Darling observó en las biopsias numerosos cuerpos intracelulares semejantes a amastigotos que carecían de quinetonúcleos y que estaban rodeados por un halo transparente semejante a una cápsula, por lo que clasificó al agente como un protozario y lo llamó Histoplasma capsulata. Actualmente se le ha asignado el nombre de Histoplasma capsulatum, proveniente de histiocitos (Histo-) y plasmodium (plasma) ya que Darling además observó organismos intracelulares dentro de los histiocitos que asemejaban a Plasmodium sp., y que parecían tener cápsula (capsulata). Para este mismo año, la linfangitis epizoótica causada por Histoplasma capsulatum var. farciminosum es introducida a Inglaterra mediante la importación de caballos provenientes de Asia y África (Chander, 2018; Gómez, 2011; Guillot et al, 2018, Sánchez et al, 2010 y Villalobos y Rodríguez, 2014). En el año 1913, Henrique da Rocha Lima (médico patólogo e infectólogo brasileño) sospechó que el microorganismo aislado por Darling era más bien una levadura al 5 comparar secciones de caballos con linfangitis epizoótica con el material obtenido por Darling proveniente del paciente con presuntiva leishmaniasis (Chang y Rodas, 2012 y Chander, 2018). En 1926 se reportó el primer caso de histoplasmosis humana en Estados Unidos por Riley y Watson (Guillot et al, 2018), por lo que se dejó de pensar que la enfermedad era endémica solo de países tropicales ya que solo se habían reportado casos post mórtem en lugares de origen tropical evidenciados por cortes histológicos (Bonifaz, 2015). Para el año 1929, Katherine Dood y De Mombreum de la Universidad de Vanderbilt de Tennessee, Estados Unidos, lograron aislar el patógeno de una niña que padecía una histoplasmosis diseminada al lograr cultivar el microorganismo, continuando los estudios hasta cumplir con los postulados de Koch (Bonifaz, 2015). Además, en 1934, De Mombreum demostró el dimorfismo de Histoplasma capsulatum y postuló que probablemente la fase saprofítica de este hongo existía en la naturaleza (Chander, 2018). Para este año, Cryptococcus farciminosum nombrado por Rivolta, es clasificado como Histoplasma farciminosum por Radaelli y Ciferri (Guillot et al, 2018). En 1945, Amos Christie y Peterson describieron una infección pulmonar primaria que en ocasiones diseminaba, y expresaron que la enfermedad por el hongo no era rara debido a la frecuencia con que se presentaba estas infecciones pulmonares (Chander, 2018 y Sánchez et al, 2010). En 1947 se reportó por primera vez un brote de histoplasmosis, el cual se dio en Oklahoma, Estados Unidos y años posteriores muchas epidemias serían reportadas tanto en Estados Unidos como en Suramérica (Guillot et al, 2018). En 1948, se registró el primer caso de histoplasmosis felina en Estados Unidos, por lo que quedó claro que la enfermedad también representaba un problema para los animales domésticos (Guillot et al, 2018). En el año 1949, Chester Wilson Emmons (micólogo norteamericano) realizó el primer aislamiento de Histoplasma capsulatum a partir del suelo proveniente de las 6 cercanías de la entrada de una madriguera de ratas debajo del borde de un gallinero, donde además se reportaron otros aislamientos de suelos de minas y cavernas (Bonifaz, 2015 y Guillot et al, 2018). En el mismo año, Perrín y Matínez Báenz reportaron los primeros casos de histoplasmosis en México mediante histopatología (Bonifaz, 2015). En 1952, Dubois y colaboradores describieron por primera vez la histoplasmosis en África por lo que se le llamó al cuadro clínico histoplasmosis duboisii o histoplasmosis africana y al agente etiológico Histoplasma duboisii (Dubois et al, 1952). En 1954, se reportó el primer caso de histoplasmosis en Kolkata, en la India, descrito por Panja y Sen, demostrando que la enfermedad también estaba presente en países orientales (Chander, 2018). En 1955, Ajello y Lazarus aislaron Histoplasma capsulatum de la Cueva de las Lechuzas en Tingo María Huanuco en Perú, de ahí que se le conociera al cuadro ocasionado por el patógeno como fiebre de Tingo María debido al atractivo turístico nacional e internacional que representa la cueva (Sánchez et al, 2010). En 1958, Emmons observó por primera vez la asociación que existe entre el hábitat de los murciélagos y la presencia de Histoplasma capsulatum. En 1959, el síndrome de histoplasmosis ocular fue definido por Woods, del cual se le conoce como Síndrome de Presunta Histoplasmosis Ocular o POHS (por sus siglas en inglés de Presumed ocular histoplasmosis syndrome) (Chander, 2018 y Guillot, 2018). En 1961 se indicó el primer caso de histoplasmosis en un tejón, en Europa, debido a Histoplasma farciminosum (Guillot et al, 2018). En 1963, en Malasia, se aísla Histoplasma capsulatum a partir del suelo por primera vez en un país asiático (Bahr et al, 2015). En 1970, se reportaron 30 casos autóctonos de histoplasmosis en India, Malasia, Indonesia, Singapur, Tailandia, Vietnam y Japón (Bahr et al, 2015). 7 A raíz de que en 1967, Ajello y Cheng habían identificado erróneamente el cleistotecio producido por un hongo no patógeno en un cultivo mixto como la fase sexual de Histoplasma capsulatum, la Dra. Kwon Chung (bióloga y bacterióloga surcoreana) intentó reproducir la fase sexual de Histoplasma capsulatum a partir de 12 aislamientos del hongo provenientes de palomares de Arkansas, Estados Unidos. Al cultivarlos en pares con 144 posibles combinaciones en Medio agar con Alphacel y extracto de levadura, encontró en 70 combinaciones los cleistotecios después de 3 semanas de incubación a 25 °C que asemejaban a los cleistotecios de Ajellomyces dermatitidis (teleomorfo de Blastomyces dermatitidis). Por lo que, en 1972, Kwon Chung y en 1979 McGinnis y Katz, identificaron el estado teleomórfico de Histoplasma capsulatum el cual se le conoció como Emmonsiella capsulata que en la actualidad fue renombrado como Ajellomyces capsulatus propuesto por McGinnis y Katz en 1979. (Bonifaz, 2015; Chander, 2018 y Kwon Chung, 1967). En 1983, varios reportes en Estados Unidos de pacientes HIV positivos en fase SIDA con histoplasmosis diseminada fueron registrados, provenientes de la zona hiperendémica de histoplasmosis en Indiana, y también de otras zonas donde la enfermedad es menos común como Michigan y Texas, y en otras donde antes no había reportes como por ejemplo Nueva York y Colorado. Dichos reportes fueron en incremento tanto en zonas endémicas como no endémicas de Estados Unidos. También para este año se reportaron casos en países donde no se habían reportado la enfermedad o donde los casos eran raros como por ejemplo Trinidad, Tailandia y la República Democrática del Congo (Bahr et al, 2015). Debido a las diferencias en las manifestaciones clínicas, distribución geográfica y morfología de las levaduras, en 1983, Ajello proponió dividir en variedades a Histoplasma capsulatum descrito por Darling (1905) y a Histoplasma duboisii descrito por Dubois (1952), proponiendo a Histoplasma capsulatum var. capsulatum y a Histoplasma capsulatum var. duboisii, respectivamente (Ajello, 1983). En 1985, la tercera variedad observada por Rivolta que había sido colocada dentro del género por Ciferri y Redaelli en 1934, también es propuesto como Histoplasma capsulatum var. faciminosum por Weeks y colaboradores (Weeks et al, 1985). 8 Para el año 1990, se reportan más de 100 casos de histoplasmosis en pacientes HIV positivos en fase SIDA provenientes de Indiana, Estados Unidos, y otros provenientes de zonas fuera de las áreas endémicas tradicionales, donde la mayoría de los casos sintomáticos eran debidos a una histoplasmosis diseminada progresiva contrario al cuadro pulmonar que presentan generalmente los pacientes HIV negativos. El aumento de casos de pacientes HIV positivos en fase SIDA permitió identificar nuevas zonas endémicas de histoplasmosis debido a que anteriormente los casos presentados eran en su mayoría asintomáticos por lo que existía un subregistro en estas zonas (Bahr et al, 2015). 9 2-ETIOLOGÍA 2.1-Descripción de los agentes etiológicos Pertenecen al Reino Fungi, Subreino Dikarya, phylum Ascomycota, Clase Eurotiomycetes, orden Onygenales y familia Onygenaceae, de la cual actualmente se sugiere que podrían pertenecer más bien a la familia Ajellomycetaceae gracias a estudios efectuados en 6 loci: 18S, 5.8S y 28S en genes del ARNr, EF1 (Factor de Elongación 1) y RPB1 y RPB2 (subunidad 1 y 2 de la polimerasa de ARN respectivamente) (Chander, 2018). El agente etiológico se divide en tres subespecies o variedades basado en sus características fenotípicas o morfológicas, distribución geográfica y patogenicidad: Histoplasma capsulatum var. capsulatum que produce la forma clásica de histoplasmosis en el continente americano, Histoplasma capsulatum var. duboisii que es el agente etiológico de la histoplasmosis en el continente africano donde afecta a primates y al ser humano, e Histoplasma capsulatum var. farciminosum causante de la linfangitis epizoótica en caballos y mulas en el norte y medio este de África (Gómez, 2011; Sánchez et al, 2010 y Teixeira et al, 2016). Histoplasma capsulatum var. farciminosum también se ha aislado a partir de caballos y mulas en Europa, India y sur de Asia (Kasuga et al, 2003; Teixeira et al, 2016 y Guillot et al, 2018). Histoplasma capsulatum var. duboisii causa manifestaciones clínicas similares a Histoplasma capsulatum var. capsulatum, y conviven en ecosistemas similares en África (Diaz, 2018). Pero Histoplasma capsulatum var. duboisii a diferencia de Histoplasma capsulatum var. capsulatum, está restringido a las áreas tropicales de África causando en el ser humano micosis cutáneas, subcutáneas y lesiones en hueso (Teixeira et al, 2016). En general las levaduras del género Histoplasma tienen forma redonda, son de pared gruesa y son producidas por el hongo al ser cultivado en Agar sangre enriquecido con cisteína o en Agar Infusión Cerebro Corazón incubados a 37 °C o en tejidos infectados en modelos in vivo. Este hongo no crece a pH menor a 5.0 ni a pH mayor a 10.0, o al incubar a temperaturas mayores a 40 °C. Histoplasma 10 capsulatum es un hongo heterotálico que puede completar su ciclo sexual en presencia de hifas complementarias donde se produce la estructura estromática fértil conocida como el ascocarpo producto de la constricción de hifas complementarias que se enrollan entre sí hasta formar dicha estructura, que es específicamente del tipo cleistotecio (estructura redonda cerrada con esferas adentro que cubren las ascas con ascosporas compuestas de pseudoparénquima y prosénquima), conociéndose su fase teleomorfa como Ajellomyces capsulatus (teleomorfo de Histoplasma capsulatum sensu stricto), el cual constituye una forma dicariótica y diploide que eventualmente forma las ascosporas haploides después del proceso de reducción meiótica (ver Figura 1) (Bonifaz, 2020; Colombo et al, 2011; Muniz et al, 2014; Ortiz et al, 2015 y Teixeira et al, 2016). Cabe destacar que la forma teleomórfica o sexual de Histoplasma capsulatum solo se ha logrado reproducir en condiciones de laboratorio, por lo que nunca se ha observado en la naturaleza, entonces, se desconoce la magnitud que tiene el proceso de recombinación sexual del hongo en este entorno (Sepúlveda et al, 2017). 11 Figura 1. Fase teleomorfa de Histoplasma capsulatum conocida como Ajellomyces capsulatus observada en lactofenol azul, reproducida en el experimento de la Dra. Kwon Chung en 1972. A) Cleistotecio, las flechas indican hifas enrolladas en la periferia de la estructura (300X). B) Ascocarpo donde se observa tres hifas ascógenas enrolladas (485X). C) Racimo de ascas jóvenes (750X). D) Ascas maduras con ascosporas (1250X) (imagen tomada de Kwon Chung, 1972). Esta reproducción sexual va a ser entonces el resultado de la unión de los dos tipos de apareamiento, es decir, entre el tipo (+) o MAT1-1 y el tipo (-) o MAT1-2, y este proceso va a estar regulado por una región genómica especializada conocida como “el locus del tipo de apareamiento” (MAT1 por sus siglas en inglés de mating-type locus) que contiene uno o más genes que codifican para factores de transcripción con motivos estructurales (Muniz et al, 2014). Cuando un aislamiento de Histoplasma capsulatum que contiene un idiomorfo del locus MAT1 (MAT1 contiene dos regiones idiomórficas) que puede ser MAT1-1 o 12 MAT1-2 (ambos idiomorfos difieren en secuencias codificantes para factores de transcripción) se encuentra con su complementario, se produce el apareamiento, ya que un idiomorfo codifica el dominio caja HMG (por sus siglas en inglés de high mobility group) de un factor de transcripción (idiomorfo MAT1-2), mientras que el otro idiomorfo codifica para el dominio caja alfa de otro factor de transcripción (idiomorfo MAT1-1), confiriendo ambos dominios la identidad sexual a la célula haploide (Muniz et al, 2014). Debido a estos descubrimientos, en el 2007, Bubnick y Smulian, desarrollaron un PCR con primers específicos para la identificación de ambas regiones MAT1-1 y MAT1-2 del locus MAT de los aislamientos de Histoplasma capsulatum (ver Cuadro I) (Bubnick y Smulian, 2007). Este evento de recombinación entre dos cepas puede generar una cepa nueva con una virulencia mayor a las cepas progenitoras, por lo que la reproducción sexual en Histoplasma capsulatum es un evento de especial interés para futuros estudios (Bubnick y Smulian, 2007). Curiosamente, al cultivar las cepas continuamente en el laboratorio, causa que pierdan su fertilidad natural o su capacidad de aparearse, por lo que autores como Medeiros et al (2014), sugieren que la presión selectiva ejercida por el hábitat natural del hongo ayuda a mantener su fecundidad (Muniz et al, 2014). 13 Cuadro I. Primers utilizados en la amplificación y detección de las regiones expecíficas del “locus del tipo de apareamiento” MAT1 de Histoplasma capsulatum en la técnica de PCR para la determinación del idiomorfo de los aislamientos (información tomada de Bubnick y Smulian, 2007). Idiomorfo Primers Secuencia Tamaño aproximado de la secuencia (pb) MAT1-1 Primer sentido 5' CGTGGTT AGTTACGGAGGCA 3' 440 Primer antisentido 5' TGAGGATGCGAGTGATGGG A 3' MAT1-2 Primer sentido 5' ACACAGTAGCCCAACCTCT C 3' 528 Primer antisentido 5' TCGACAATCCCATCCAATACCG 3' El PCR se efectua en condiciones estándar con una temperatura de “annealing” de 60°C y utiizando como control del idiomorfo MAT1-1 la cepa ATCC 26032 y como control del idiomorfo MAT1-2 la cepa ATCC 22635, ambas de Histoplasma capsulatum (Bubnick y Smulian, 2007). En aislamientos clínicos se ha visto que hay un predominio del idiomorfo (-) o MAT1- 2, en una relación 7:1 del (-):(+), respectivamente, en comparación a los aislamientos de la naturaleza donde más bien se encuentran en una relación 1:1. A pesar de esta diferencia en los aislamientos clínicos, los estudios en modelos murinos han demostrado que ambos idiomorfos poseen la misma virulencia, por lo que se estima que el predominio del idiomorfo (-) o MAT1-2 se debe a que este posee una habilidad incrementada para producir propágulos infecciosos, es decir, que sus hifas tienen una mayor capacidad para pasar a la fase levaduriforme (Muniz et al, 2014). En los brotes de histoplasmosis, también se ha visto predominio del idiomorfo (-) o MAT1-2, como por ejemplo en el estudio efectuado por Kwon Chung et al (1984), donde a partir de 28 aislamientos de un brote de histoplasmosis en Indianápolis, Estados Unidos, entre 1978 y 1979, y entre 1980 y 1981, se encontró en su mayoría este idiomorfo (Kwon Chung et al, 1984). 14 Estudios efectuados por Damasceno et al (2019), en aislamientos clínicos provenientes en su mayoría de pacientes HIV positivos de centros de salud de Ceará, que es un sitio endémico de histoplasmosis en el noreste de Brasil (considerada la zona con mayor mortalidad por histoplasmosis en Suramérica), demostró igualmente predominio del idiomorfo (-) o MAT1-2, pero al efectuar el análisis por clados genéticos por separado a los cuales pertenecían los aislamientos, se encontró el predominio de este idiomorfo solo en el Clado Noreste BR1, en cambio en el Clado Noreste BR2 predominó ligeramente el idiomorfo (+) o MAT1-1, por lo que la tendencia al predominio del idiomorfo (-) o MAT1-2, no siempre se cumple (Damasceno et al, 2019). En otros estudios como el de Rodríguez et al (2013), efectuado en 28 aislamientos del hongo provenientes del suelo, guano de murciélagos y de seres humanos, obtenidos en Brasil y México, se encontró que de los14 aislamientos de México, 10 resultaron ser del idiomorfo (-) o MAT1-2, mientras que todos los 14 aislamientos de Brasil son del idiomorfo (+) o MAT1-1, lo que demuestra una vez más que Histoplasma capsulatum posee una diversidad genética significativa por lo que estos hallazgos pueden variar entre las distintas localizaciones geográficas, por lo que el predominio de un idiomorfo sobre otro podría depender de este factor, que además también se cree que podría asociarse al reservorio natural de este hongo en estos sitios (Rodríguez et al, 2013). El estudio de Damasceno et al (2019), también demostró que en pacientes HIV positivos puede haber infecciones mixtas por ambos idiomorfos de una misma especie filogenética (en este estudio por el Clado Noreste BR1), por lo que se estima que se puede deber a exposiciones repetidas al sitio de infección y que además esta infección mixta se traduce en un mayor riesgo de padecer histoplasmosis diseminada (Damasceno et al, 2019). La reproducción sexual se ha demostrado también en aislamientos provenientes de Norteamérica donde se presume que los eventos de recombinación e intercambio genético podrían permitir que este hongo se adapte a diferentes condiciones que traería el nacimiento de nuevos genotipos más virulentos capaces de infectar 15 nuevos hospederos ya que este hongo se ha caracterizado por poseer una alta variación genética y ser de distribución mundial en comparación con otros patógenos dimórficos pertenecientes al Orden de los Onygenales que están más restringidos geográficamente (Teixeira et al, 2016). 2.2-Aspectos genéticos Variabilidad cromosómica En cuanto a la ploidía o el conjunto de los cromosomas de Histoplasma capsulatum, este cuenta con un número de cromosomas que va de 3 a 7, con un intervalo de tamaño de 0.5 Mb a 5.7 Mb, ya que, como en la mayoría de organismos pertenecientes al Reino Fungi, no van a ser estables, es decir, se puede encontrar variabilidad tanto en el estado haploide como en el estado diploide (recordar que estos son los estadíos cromosomales más comunes en la naturaleza, es decir, los eucariotas duplican su ploidía en el estado sexual y la reducen a la mitad gracias a la meiosis) (Romero et al, 2004). Entonces, este hongo presenta polimorfismo cromosómico, es decir, diversidad en los cromosomas tanto en tamaño como número de cromosomas así como en la secuencia de ciertos genes. Steele et al (1989), demostraron este hecho al estudiar el número de cromosomas en diferentes cepas de Histoplasma capsulatum mediante las técnicas de hibridación con sondas específicas, FIGE (por sus siglas en inglés de Field Inversion Gel Electrophoresis) y CHEF (por sus siglas en inglés de Contour Clamped Homogeneous Electric Field) (ambas técnicas son tipos de electroforesis en gel de campos pulsados o PFGE por sus siglas en inglés de Pulsed Field Gel Electrophoresis, que se les llama diferente de acuerdo a la orientación de los campos eléctricos). Se encontró 8 cromososmas para la cepa Downs (cepa de baja virulencia), 4 cromosomas para la cepa G-186B (cepa virulenta) y 3 cromosomas en la cepa G-217B (cepa virulenta) (Romero et al, 2004 y Steele et al, 1989). También se ha demostrado el polimorfismo en la longitud de los cromosomas o CLP (por sus siglas en inglés de Chromosome Length Polymorphism) en el estudio de múltiples aislamientos de Histoplasma capsultum, es decir que hay diversidad 16 cromosómica o polimorfismo cromosómico y está asociado tanto al tamaño como la movilidad de los cromosomas, pero aún se desconoce la relación que pueda tener con el fenotipo de los aislamientos (Romero et al, 2004). Diversidad Genética Se considera que el género Histoplasma podría tener más bien 6 especies crípticas, basado en la filogenética molecular (Chander, 2018), otros consideran que podría llegar a constituir 11 especies filogenéticas o linajes crípticos (Damasceno et al, 2019). Estudios en la composición en moles por ciento de guanina-citosina (G+C) tanto del ADN de la fase micelial como levaduriforme han arrojado resultados similares (45.6- 49.8 % y 45.4-49.8 %, respectivamente), sin embargo, esta similitud no indica que la especie de este hongo sea homogénea ya que como se mencionó anteriormente, Histoplasma capsultum probablemente esté compuesto de especies crípticas o que más bien representa un complejo de especies y cada especie es un clado que puede agrupar cepas con diferencias biológicas. Este hecho está evidenciado porque se sabe con certeza que los especímenes de este hongo se caracterizan por una diversidad morfológica y fisiológica, así como un elevado polimorfismo (Romero et al, 2004). En la actualidad, el desarrollo de técnicas de biología molecular y el estudio de marcadores moleculares ha constituido un avance útil en la identificación de las especies crípticas del complejo al cual pertenece este hongo ya que la clasificación antes se basaba en criterios morfológicos y biológicos (Vite et al, 2014). Los métodos de genotipificación molecular como el Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción o RFLP (por sus siglas en inglés de Restriction Fragment Length Polymorphism), Hibridación de ADN, ADN Polimórfico Amplificado Aleatoriamente o RAPD (por sus siglas en inglés de Random Amplification of Polymorphic DNA) y la secuenciación de los ITS 1 y 2, así como a partir de la secuencia parcial de cuatro genes o loci: ARF (factor de ribosilación de ADP), H- ANTI (precursor de antígeno H), OLE1 (Delta 9 desaturasa de ácido graso) y TUB1 17 (tubulina-α) (ver Cuadro II), han permitido demostrar una amplia diversidad de Histoplasma capsulatum sensu stricto en asociación geográfica. Por lo que los estudios pioneros de Kasuga et al, en 1999 y en el 2003 en aislamientos clínicos, veterinarios y del suelo provenientes de varios continentes, y más recientemente los estudios efectuados por Teixeira et al (2016), permitieron considerar que esta especie es un complejo compuesto de 8 clados (ver Figura 2): Clado 1 Norteamérica (NAm 1), Clado 2 Norteamérica (NAm 2), Clado A Latinoamérica (LAm A), Clado B Latinoamérica (LAm B), Clado Australia, Clado Países Bajos (Indonesia), Clado África y Clado Eurasia (proveniente de Egipto, India, China, Tailandia e Inglaterra), donde 7 de estos clados son poblaciones genética y geográficamente distintas que podrían ser considerados especies filogenéticas a excepción del Clado Eurasia que no constituye una especie filogenética ya que se origina del Clado A Latinoamérica (LAm A) pero con la diferencia de que son aislamientos homogéneos que provienen del lejano oriente de Europa (Arenas, 2015; Colombo et al, 2011 Gómez, 2011; Kasuga et al, 1999; Kasuga et al, 2003 y Teixeira et al, 2016). En ese mismo estudio de Kasuga et al (2003) sobre el análisis de la relación filogenética de aislamientos de Histoplasma capsulatum provenientes de diferentes lugares del mundo, también se evidenció que algunos de estos no pertenecían a los clados sugeridos para la clasificación de este hongo como por ejemplo el linaje H81 aislado a partir del ser humano en Panamá, entre otros ejemplos (Kasuga et al, 2003). 18 Cuadro II. Primers utilizados en la amplificación y detección de la secuencia parcial de cuatro genes de Histoplasma capsulatum en la técnica de PCR, entre otras, para la discriminación entre aislamientos (información tomada de Kasuga et al, 2003 y Sepúlveda et al, 2017). Gen Primers Secuencia Tamaño aproximado de la secuencia (pb) Tubulina α Primer sentido 5' GGTGGCCAAATCGCAAACTC 3' 278 Primer antisentido 5' GGC AGCTTTCCGTTCCTCAGT 3' Factor de ribosilación de ADP Primer sentido 5' AGAATATGGGGCAAAAAGGA 3' 470 Primer antisentido 5' CGCAATTCATCTTCGTTGAG 3' Precursor de antígeno H Primer sentido 5' CGCAGTCACCTC CATACTATC 3' 412 Primer antisentido 5' GCGCCGACATTAACCC 3' Delta 9 desaturasa de ácido graso Primer sentido 5' TTTAAACGAAGCCCCCACGG 3' 425 Primer antisentido 5' CACCACCTCCAACAGCAGCA 3' 19 Figura 2. Distribución geográfica de los clados y linajes de Histoplasma capsulatum a partir del estudio de Kasuga et al (2003) en 17 aislamientos provenientes de 25 países (imagen tomada de Vite et al, 2014). Cabe destacar que, en la actualidad, la técnica de MLST (por sus siglas en inglés de Multilocus Sequence Typing) se considera el principal método de biología molecular para evaluar la diversidad genética de Histoplasma capsulatum a nivel de especie, mediante la amplificación parcial de las secuencias de ADN de 4 genes nucleares (arf, H-anti, ole1 y tub1), por lo que, estudios recientes efectuados mediante esta técnica han permitido demostrar que en realidad los clados LAm A y LAm B, se dividen en 4 clusters: LAm A1, LAm A2, LAm B1 y LAm B2, además se descubrió dos nuevas especies filogenéticas: RJ (Suroeste de Brasil) y BAC-1 (México, asociado a especies de murciélagos), y 4 clados crípticos y monofiléticos provenientes de Brasil: Noreste BR1, Noreste BR2, BR3 y BR4, por lo que se considera que Latinoamérica posee la mayor diversidad genética de Histoplasma capsulatum en comparación con las demás zonas endémicas, siendo el sitio con 20 mayor diversidad Brasil, además, se cree que es el origen de la dispersión de este hongo en América Latina, muy posiblemente facilitado por hospederos migratorios como las aves y murciélagos (Damasceno et al, 2019 y Rodrigues et al, 2020). Estudios recientes del 2020, efectuados por Rodrigues et al, mediante la técnica de MLST (de 3 genes: arf, H-anti, ole1, además de ITS4 e ITS5) y AFLP (por sus siglas en inglés de Amplified Fragment Length Polimorphism) en 102 aislamientos clínicos y 2 aislamientos veterinarios provenientes de diferentes regiones geográficas de Brasil, sugieren la existencia de otros linajes filogenéticos o Clados, como por ejemplo LAm C, LAm D y LAm E, relacionados a la producción de brotes de histoplasmosis en el Noreste de Brasil entre el 2011 y 2015, donde el Clado LAm C se considera el principal causante de la enfermedad en pacientes HIV positivos de esta región del país (Ceará) y el Clado LAm D y LAm E son aislados de pacientes del Sureste del país (Rodrigues et al, 2020). Se cree que la gran diversidad genética del hongo que se da en este país y la alta incidencia de histoplasmosis, se podría deber a la recombinación genética producto de la reproducción sexual (Rodrigues et al, 2020). Es interesante mencionar que Histoplasma capsulatum var. capsulatum se encuentra en todo los clados. El Clado África incluye las tres variedades, en el cual se encuentra Histoplasma capsulatum var. duboisii que está limitado al continente de África. Histoplasma capsulatum var. farciminosum se ubica en 3 de los 8 clados (Clado África, Clado NAm 2 y Clado Eurasia), por lo que se evidencia que la clasificación de este hongo en las tres variedades no tiene sentido desde el punto de vista de la filogenética, entonces, por ejemplo, en el caso de Histoplasma capsulatum var. farciminosum, no es una especie filogenética, sino más bien representa un conjunto de aislamientos pertenecientes a varios clados que comparten la característica de que son capaces de producir enfermedad en los caballos (Kasuga et al, 2003). Debido a que no se ha llegado a la conclusión clara sobre el orden de cómo se ramifican los clados, Kasuga et al (2003) sugieren que Histoplasma capsulatum es 21 un hongo que diseminó en un período de tiempo corto de aproximadamente 3 a 13 millones de años atrás (Kasuga et al, 2003). El problema con la clasificación de Histoplasma capsulatum en especies filogenéticas basado en los 4 loci codificantes (arf, H-anti, ole1 y tub1) es que solo proporciona información parcial a cerca de la diversidad genealógica de este hongo, por lo que resulta limitado, además, en estos grupos genéticos no se logra incluir todos los aislamientos estudiados, como es el caso del linaje Panama/H81 en el estudio de Kasuga et al (2003) que no se identificó dentro de ninguna de las especies filogenéticas ya que estos representan un grupo polifilético (para que todos fueran incluidos en la especie filogenética, los individuos deberían ser un grupo monofilético) (Kasuga et al, 2003 y Sepúlveda et al, 2017). Se sospecha que estas diferencias filogenéticas podrían influir en las manifestaciones clínicas presentes en los pacientes, como por ejemplo se ha visto que los aislamientos de Histoplasma capsulatum pertenecientes al Clado LAm A y Clado LAm B, aislados de Latinoamérica, suelen producir lesiones en piel, en cambio los aislamientos en Norteamérica (NAm 1 y NAm 2) no producen esta manifestación con frecuencia. En un estudio donde se comparó pacientes HIV positivos en fase SIDA con histoplasmosis entre Brasil y Estados Unidos, se observó que los pacientes provenientes de Brasil presentaban más lesiones cutáneas, hallazgos gastrointestinales y mayores índices de muerte, en comparación con los pacientes provenientes de Estados Unidos probablemente debido a las diferencias genéticas entre los clados que predominan en estos países que se evidencia por el dermatotropismo de los clados latinoamericanos (Colombo et al, 2011; Gómez, 2011 y Teixeira et al, 2016). Una infección debida a este hongo puede estar dada por más de un genotipo, como se observó en el estudio de Damasceno et al (2019) donde había población HIV positiva con histoplasmosis causada tanto por aislamientos del Clado Noreste BR1 como por el Clado Noreste BR2, lo que podría ser comparable al concepto de “superinfección” manejada en otras disciplinas como la virología donde un individuo infectado por un genotipo adquiere un segundo genotipo, posiblemente debido a 22 exposiciones diferentes o porque ambos genotipos comparten el mismo nicho ecológico (Damasceno et al, 2019). El reconocimiento de estas infecciones mixtas por dos genotipos diferentes es importante ya que se cree que pueden variar en su tropismo hacia la célula hospedera, mecanismos de evasión de la respuesta inmune, respuesta adaptativa del sistema inmunológico que generan que es importante para la elaboración de vacunas y perfil de susceptibilidad a los antifúngicos, por lo tanto de la progresión de la enfermedad, siendo esto último crítico en los pacientes que padecen la histoplasmosis diseminada (Damasceno et al, 2019). En la actualidad el estudio de Sepúlveda et al (2017), permitió cambiar anteriores linajes evolutivos al nivel de especie. En el estudio se utilizó el análisis del genoma completo y secuenciación de 30 aislamientos provenientes de varios sitios endémicas de histoplasmosis en América, para comprobar que este género está compuesto por varias especies. Se concluyó que estas especies están genéticamente aisladas y raramente se cruzan, y difieren en su virulencia (Sepúlveda et al, 2017). Se encontró suficientes diferencias genéticas y en la estructura polifilética entre los cluster, por lo que se definieron los siguientes linajes evolutivos como 4 especies filogenéticas independientes: Histoplasma capsulatum sensu stricto (anteriormente conocido como el linaje Panama/H81), Histoplasma misissippiense sp. nov. (anteriormente Clado NAm 1), Histoplasma ohiense sp. nov. (anteriormente Clado NAm 2) e Histoplasma suramericanum sp. nov. (anteriormente Clado LAm A) (Sepúlveda et al, 2017 y Rodrigues et al, 2020). Cabe destacar que esta clasificación de especies filogenéticas no evalúa el grado de incompatibilidad reproductiva entre especies, a como lo establece la definición de especie biológica en donde dos individuos de diferentes especies no se pueden reproducir entre sí. Pareciera ser que este hecho solo se ha comprobado en el caso de Histoplasma misissippiense e Histoplasma ohiense, donde la distribución geográfica de ambas especies se traslapa en Norteamérica y aún así se encuentran en sintopía, que también podría ser la misma situación en el caso de Histoplasma 23 suramericanum e Histoplasma capsulatum sensu stricto, donde su distribución geográfica se traslapa en Centroamérica y posiblemente en el Noroeste de Colombia (Sepúlveda et al, 2017). Se cree que Histoplasma suramericanum es un agente etiológico que produce frecuentemente la enfermedad pulmonar aguda con una pronunciada patología pulmonar que desemboca en una alta mortalidad en Centro América y Suramérica, en cambio, Histoplasma misissippiense e Histoplasma ohiense producen más frecuentemente enfermedad pulmonar crónica en Estados Unidos (Rodrigues et al, 2020). Histoplasma misissippiense se considera menos virulento, pero presenta más resistencia a los antifúngicos de uso regular, además cuenta con una actividad proteolítica extracelular considerada como única. Por otro lado, Histoplasma ohiense carece de α-1,3-glucanas en la fase levaduriforme que son consideradas como un factor de virulencia importante, pero posee la adhesina Yps3p (homóloga a la adhesina Bad1p de Blastomyces dermatitidis) que igual le permiten causar patología (Sepúlveda et al, 2017). En el estudio de Sepúlveda et al (2017) también se encontró resultados de aislamientos del Clado África pertenecientes a Histoplasma capsulatum var. duboisii, que sugieren que también constituye una especie, pero por el número reducido de aislamientos (2 aislamientos) en el presente estudio, no se puede llegar a esta conclusión hasta analizar una mayor cantidad de especímenes (Sepúlveda et al, 2017). 2.3-Dimorfismo Histoplasma capsulatum es un hongo dimórfico termonutricional, que expresa su fase saprofítica de micelio, macroconidias tuberculadas y microconidias a temperatura ambiente en medios como el agar Sabouraud glucosado y agar Mycosel o en el medio ambiente, además expresa su forma levaduriforme o parasitaria a 37 °C en medios ricos como gelosa sangre o agar infusión cerebro corazón o en el hospedero, por lo que se considera un patógeno primario (Sánchez, 2009 y Sánchez et al, 2010). 24 Muchos de los cambios fisiológicos en respuesta a cambios ambientales como lo es la temperatura, son debidos a modificaciones en la membrana lipídica de las células (Carratú et al, 1996 y Maresca y Kobayashi, 2000). Durante este cambio de temperatura se activan los genes de choque de calor o HS (por sus siglas en inglés de Heat Shock) donde las membranas se vuelven hiperfluidas, es decir, se desestabiliza la fase lamelar, por lo que es necesario aumentar los ácidos grasos saturados para estabilizar la topología de la membrana (Carratú et al, 1996). En las levaduras (y en células animales), la Acyl CoA desaturasa o Δ9-desaturasa, es la principal enzima que convierte el ácido palmítico y el ácido esteárico que son ácidos grasos saturados a ácido palmitoleico o ácido oleico que son ácidos grasos insaturados. Se cree que esta enzima es responsable de las modificaciones que sufre la membrana celular ante cambios de temperatura o cambios nutricionales (Maresca y Kobayashi, 2000). Para el cambio morfológico, el hongo también requiere de una fuente de grupos sulfidrilos, donde el más importante es la cisteína (Maresca y Kobayashi, 2000). Estudios efectuados sobre el crecimiento de la levadura en cultivo (no del micelio) han evidenciado que necesita adquirir la cisteína gracias a la expresión de una sulfito reductasa dependiente de la temperatura, por lo que sin la enzima es incapaz de incorporar sulfato a partir de compuestos como la cisteína (Garfoot et al, 2014). Histoplasma capsulatum es capaz de sintetizar todas las vitaminas esenciales, a excepción de la tiamina. Además, la levadura dentro del fagosoma tiene limitaciones de riboflavina y pantotenato por lo que necesita la síntesis de novo de estos precursores de cofactores (Garfoot et al, 2014). En 1987, se comprobó que la transcripción de genes de choque de calor (HS) y la acumulación de proteínas de choque de calor o HSP (por sus siglas en inglés de Heat Shock Protein) ocurrían durante la transición de micelio a levadura. Estos estudios fueron efectuados por Caruso et al (1987), donde se encontró la Hsp70 en Histoplasma capsulatum (Caruso et al, 1987 y Maresca y Kobayashi, 2000). 25 Estas proteínas de choque térmico son importantes en el proceso de dimorfismo porque este se da a temperaturas de 37 °C, por lo que se necesita de estas proteínas chaperonas para garantizar que las proteínas involucradas en el proceso de dimorfismo se plieguen correctamente y que los complejos proteicos se transporten y se ensamblen adecuadamente. Además, las HSP protegen el proceso de respiración y el acoplamiento de la síntesis de ATP por lo que uno de los objetivos más probables de estas proteínas sea también la membrana mitocondrial (Boyce y Andrianopoulos, 2015; González et al, 2012; Maresca y Kobayashi, 2000; Ray y Rappleye, 2018 y Sánchez, 2009). 26 3-ECOLOGÍA Histoplasma capsulatum es un hongo geofílico que en su fase saprofítica tiene su hábitat en el suelo o sustratos con alto contenido de nitrógeno y fosfato, alta humedad y pH ácido, en los detritus vegetales y en el guano de aves domésticas como gallinas, pavos y gansos, además de aves migratorias y otras aves como palomas, estorninos, mirlos, gaviotas, cuervos, pavos, gansos y zanates, y en murciélagos (Chang y Rodas, 2012; Diaz, 2018; Sánchez, 2009; Sánchez et al, 2010 y Teixeira et al, 2016). Se cree que Histoplasma capsulatum tiene la habilidad de coevolucionar con el huésped más frecuente que son los murciélagos, ya que la fisiología mitocondrial del murciélago ha evolucionado para tolerar la alta carga de estrés oxidativo lo que le permite ser más tolerante al parasitismo intracelular en comparación con otros mamíferos (Teixeira et al, 2016). Histoplasma capsulatum crece en sitios con temperaturas entre los 18 °C a 28 °C, siendo la temperatura óptima entre 20 °C a 30 °C, humedad constante mayor a 60 % (óptima de 70-90 %) y baja luminosidad (Chang y Rodas, 2012 y Teixeira et al, 2016), pero se desarrolla mejor en suelos calcáreos con temperaturas entre 22 °C a 29 °C con una precipitación anual de 1000 mm a 1200 mm y una humedad relativa de 67-87 %, condiciones que se encuentran principalmente en zonas templadas y tropicales, siendo en verano cuando estas condiciones están más presentes (Chang y Rodas, 2012 ; Gómez, 2011 y Sánchez et al, 2010). Para autores como Ray y Rappleye (2018), el ciclo de vida del hongo no necesita necesariamente la infección de un mamífero para completarse, por lo que se piensa que el ser humano es un huésped accidental el cual presenta una micosis debido al dimorfismo del hongo y su capacidad de sobrevivencia intracelular (Ray y Rappleye, 2018). Las aves y murciélagos pueden infectarse esporádicamente con este hongo por lo que pueden constituir un medio de dispersión ya que muchos de estos reservorios son especies migratorias, principalmente en países endémicos, además el hongo también se ha detectado en otros animales como por ejemplo babuinos, tejones, 27 nutrias marinas, mapaches y animales domésticos como equinos, felinos y caninos, por lo que autores como Teixeira et al (2016) sugieren que los mamíferos también podrían estar involucrados en los complejos mecanismos de especiación y dispersión de este hongo (Teixeira et al, 2016). Además, el hecho de que los murciélagos puedan habitar múltiples sitios como cuevas, edificios ocupados o abandonados, corona de plantas, corteza y rocas en asociación con humedad y microentornos enriquecidos con guano, permite el desarrollo del hongo en varios sitios. Adicionalmente, el hongo al ser capaz de crecer en sustratos con alto contenido de nitrógeno y fosfato como el guano de aves y murciélagos le da una ventaja selectiva sobre otros microorganismos que podrían estar presentes en el medio, ya que el alto contenido de nitrógeno no es necesario para la sobrevivencia del hongo pero si se ha visto que acelera el proceso de esporulación y crecimiento (Ortiz et al, 2015 y Teixeira et al, 2016). Autores como Arenas (2015), describen que en el nicho ecológico de Histoplasma capsulatum, también se ha aislado otros hongos filamentosos como por ejemplo Acremonium sp., Aspergillus terreus, Gymnascella cintrina, Gymnoascus dankaliensis, Penicillium sp., Phoma sp., Aphanoascus fulvescens, y levaduras como Candida catenulata y Rhodotorula sp., así como ácaros micófagos que se alimentan de estos hongos que cohabitan el guano, por lo que se cree que cumplen una función de dispersión de Histoplasma capsulatum mediante mecanismos foréticos (Arenas, 2015). 28 4-ASPECTOS VETERINARIOS Histoplasma capsulatum infecta murciélagos causándoles una infección diseminada, pero hay especies de murciélagos cavernícolas como por ejemplo Leptonycteris curasoae, Desmodus rotundus y Tadarida brasiliensis, que pueden infectarse sin padecer la enfermedad. En el caso de las aves, estas son inmunes a la infección posiblemente por su alta temperatura corporal (Arenas, 2015; Diaz, 2018 y Teixeira et al, 2016). Infección por Histoplasma capsulatum var. capsulatum La forma de transmisión principal en animales para adquirir a Histoplasma capsulatum var. capsulatum es por inhalación de los propágulos, en donde afecta principalmente al animal inmunosupreso o al inmunocompetente que estuvo expuesto a una dosis grande de elementos fúngicos. En animales como los perros y los gatos, también se ha sugerido como medio de transmisión la ingesta de material infectado en donde se explicaría la enfermedad primaria gastrointestinal en estos animales domésticos (Guillot et al, 2018). Además, se cree que otra forma de trasmisión en gatos podría ser la vía transcutánea (Larsuprom et al, 2017). La histoplasmosis es la segunda micosis sistémica más común en gatos en Estados Unidos (Teixeira et al, 2016) y en general es la segunda más reportada después de la criptococosis en estos animales, además, en los animales de compañía la infección por Histoplasma capsulatum var. capsulatum es frecuente observarla en regiones enzoóticas o endémicas de los valles de la Rivera del Mississippi y Ohio en Norteamérica, pero se han reportado casos en perros y gatos en Suramérica, Italia, Grecia, Japón, Australia, Colorado, California, Nuevo México y Texas, curiosamente estas últimas tres localizaciones de Estados Unidos son consideradas no enzoóticas (Guillot et al, 2018 y Larsuprom et al, 2017). En Europa, la histoplasmosis se ha reportado también tanto en animales domésticos como animales salvajes, como, por ejemplo, numerosas investigaciones sugieren que Histoplasma capsulatum es el responsable de las lesiones cutáneas limitadas a piel y nódulos linfáticos subcutáneos, en los tejones eurasiáticos (Meles meles) en Suiza, Dinamarca, Alemania y Austria, que por su estilo de vida omnívoro, su 29 hábitat y su costumbre de hurgar, los predispone potencialmente a la histoplasmosis y la tuberculosis (Guillot et al, 2018). En animales, la enfermedad puede ir desde una infección respiratoria leve o aguda hasta una infección diseminada, que varía debido al tamaño del inóculo y la virulencia de la cepa. En algunos animales, la enfermedad puede mantenerse latente con poca cantidad de levaduras infectantes, y ante una inmunosupresión futura puede desencadenar la infección, por lo que el período de incubación puede ir desde las 2-3 semanas hasta muchos años (Guillot et al, 2018). El hongo se encuentra en nódulos linfáticos pulmonares y órganos del sistema reticuloendotelial como el hígado, bazo y médula óseo, también en piel, sistema nervioso central y tracto gastrointestinal (Guillot et al, 2018). Los signos clínicos en perros y gatos no son específicos, puede ser pérdida de peso, inapetencia, debilidad, deshidratación y fiebre. Puede haber signos respiratorios o pueden estar ausentes en el caso de que haya diseminación a otros órganos que no involucren el sistema respiratorio. La radiografía torácica generalmente revela patrones intersticiales lineares, difusos, nodulares o miliares, y se ha reportado la combinación de patrones intersticiales, bronquiales y alveolares, o la ausencia completa de hallazgos anormales (Guillot et al, 2018). Se cree que las lesiones en pulmón en gatos no son detectables debido al pequeño tamaño de estas (generalmente detectadas post mórtem) ya que el agente etiológico rápidamente disemina a otros órganos una vez inhalado a diferencia del ser humano, por lo que se reporta que, en Europa, generalmente los hallazgos clínicos son cutáneos, pero se podría presentar anemia, pérdida de peso, letargia, fiebre, anorexia y enfermedad del intersticio pulmonar y otros órganos afectados (Larsuprom et al, 2017). Los signos oculares son más o menos frecuentes en gatos (visto en un cuarto de casos) e incluyen coriorretinitis, desprendimiento de la retina, neuritis óptica y uveítis anterior o panoftalmitis. En perros la diarrea debilitante que a veces presenta melena, se evidencia como mucosas pálidas, pérdida de peso y debilidad, es 30 frecuente. Otros signos clínicos reportados en la literatura incluyen nódulos cutáneos, dolor articular, lesiones en lengua, miosis y esplenomegalia (Guillot et al, 2018). La histoplasmosis sistémica en estos animales cursa con tos intermitente, disnea, linfadenopatía, hipertermia, anorexia, pérdida de peso y diarrea, descrito en caballos, ganado y dromedarios. En algunos casos Histoplasma capsulatum var. capsulatum es el responsable de abortos en yeguas debido a lesiones en la placenta (placentitis) con posterior invasión del feto, o también si no hay aborto, la transmisión vertical puede causar la muerte perinatal de potros debido a la severa neumonía granulomatosa y queratitis en caballos (Guillot et al, 2018). Larsuprom et al (2017) reportaron el primer caso de histoplasmosis en gatos en Tailandia, en una gata doméstica de dos años que tenía acceso a áreas exteriores contaminadas con heces de palomas. Presentaba pápulas en las orejas y nódulos en la nariz durante cuatro meses y también heridas crónicas laterales sin signos de infección sistémica (ver Figura 3). Se tomaron hisopados nasales y de las heridas crónicas donde se observó levaduras intracelulares al estudio citológico al igual que al teñir con tinción de Ácido Peryódico de Schiff o PAS (por sus siglas en inglés de Periodic Acid Schiff) las biopsias para el estudio histopatológico (ver Figura 4), lo que se confirmó mediante PCR de tejidos incrustados en parafina donde se amplificó el ADN genómico de la región de ITS utilizando como primers los ITS1 e ITS4 que al comparar con el GenBank BLAST se evidenció 99% de homología con Histoplasma capsulatum (Larsuprom et al, 2017). El tratamiento con Itraconazol (10 mg/kg dos veces por día vía oral) resolvió las lesiones, pero se presentó recurrencia del cuadro por lo que se tuvo que administrar Anfotericina B Desoxicolato (0.5 mg/kg dos veces a la semana) más itraconazol (5 mg/kg vía oral cada 12 horas) lo que disminuyó el número de nódulos pero sin resolución del cuadro, entonces se administró Fluconazol (50 mg vía oral por día) al día 84 sin mejora de los nódulos o pápulas pero sin aparición de nuevas lesiones, pero manteniéndose una condición estable del animal (Larsuprom et al, 2017). 31 Figura 3. A-B) Nódulos en puente nasal, C) pápulas en el pabellón de la oreja y D) lesión crónica en la zona radial de la pata izquierda (imagen inferior derecha) de una gata con histoplasmosis (imagen tomada de Larsuprom et al, 2017). 32 Figura 4. Levaduras intracelulares en macrófagos vistas en biopsias al teñir preparaciones en PAS, 100X (imagen tomada de Larsuprom et al, 2017). En América Latina, es común la infección en animales domésticos que viven en patios o corrales en zonas con clima cálido y húmedo, donde el potencial de riesgo de adquirir la infección es mucho mayor, además es común encontrar hallazgos clínicos como trombocitopenia y lesiones cutáneas sugerentes de diseminación en perros infectados, (Ortiz et al, 2015). Ortiz et al (2015) reportaron un caso en Ecuador de histoplasmosis con linfadenopatía multifocal, lesiones cutáneas y lesiones gingivales en un perro Schnauzer hembra de 4 años que habitaba una zona donde se utilizaba como fertilizante para cultivo el guano de aves, que inició como una diarrea mucosa y sintomatología respiratoria no sugerente de histoplasmosis tratado con hidratación, donde después del día 20, se presentaron pápulas con costras en labios, atrás de la cabeza, nuca, tórax y región lumbar, con presencia de hinchazón de nódulos 33 linfáticos en la zona submandibular, poplítea y la encía maxilar izquierda (ver Figura 5) (Ortiz et al, 2015). Al hemograma se observó trombocitopenia marcada sin anormalidades imagenológicas. La biopsia de las lesiones reveló presencia de granuloma y una celularidad con fondo inflamatorio dada por la presencia de linfocitos, células plasmáticas, neutrófilos, eosinófilos e histiocitos, donde se observaron en los macrófagos epitelioides, numerosas levaduras intracelulares redondas u ovales de 2-4 µm de diámetro rodeadas de un halo claro con un centro púrpura en forma de media luna sugerente de Histoplasma capsulatum (ver Figura 6) (Ortiz et al, 2015). El cultivo en Agar Papa Dextrosa incubado a 25 °C y el Agar Infusión Cerebro Corazón más 5 % de sangre humana incubado a 35 °C (ambos medios con agentes antibacterianos) después 28 días, presentaron colonias filamentosas y levaduriformes, respectivamente, evidenciando el dimorfismo. Al examen microscópico de la colonia filamentosa se observaron macroconidias tuberculadas y microconidias. Mediante PCR de los ITS1 e ITS4 se confirmó la identificación (Ortiz et al, 2015). Como tratamiento, se le administró al perro Cefalexina oral (25 mg/kg cada 12 horas por 21 días) y Ketoconazol (10 mg/kg cada 12 horas por 60 días) presentando recuperación de las lesiones cutáneas y reducción del tamaño de los nódulos linfáticos, recordando que el antifúngico recomendado es el Itraconazol (Ortiz et al, 2015). En Japón, estudios efectuados actualmente en estos animales sugieren que la enfermedad en perros podría tener un origen cutáneo como por ejemplo por heridas quirúrgicas que son contaminadas con el agente etiológico (Larsuprom et al, 2017). 34 Figura 5. A) Pápulas en el área dorsal del cuello y B) encía eritematosa e hinchada al día 20 de la infección (imagen tomada de Ortiz et al, 2015). Figura 6. Levaduras intracelulares en macrófagos epitelioides vistas en aspirado submandibular tomado con agua fina y teñido con tinción Diff-Quick®, 1000X (imagen tomada de Ortiz et al, 2015). 35 En Costa Rica, el Hospital de Especies Menores y Silvestres de la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional, reportó en el 2019, un caso de histoplasmosis diseminada en un gato doméstico macho castrado de 3 años de edad. Este presentaba libre acceso a áreas verdes de Cañas, Guanacaste al noroeste del país. El animal cursaba con rinitis supurativa, anorexia y pérdida de peso progresiva de 4 semanas, con antecedentes de descarga purulenta bilateral que resolvió con antibióticos 5 meses atrás. La serología por el Virus de la Leucemia Felina y el Virus de la Inmunodeficiencia Felina, resultó negativa. Al examen físico reveló hipotermia (36.6 °C), ritmo cardíaco de 200 latidos por minuto, ictericia, estridor pulmonar y taquipnea. El animal falleció, por lo que el diagnóstico se hizo post mórtem, lo que reveló la presencia de nódulos de inflamación granulomatosa en pulmones correspondiente a neumonía granulomatosa bronquio intersticial (ver Figura 7A), además de linfadenopatía, esplenomegalia y hepatomegalia (Alfaro et al, 2019). Se realizaron montajes de tejido pulmonar en Hematoxilina Eosina, Grocott y PAS, observándose macrófagos con levaduras intracelulares de 2x3 µm de diámetro (ver Figura 7B), además, al cultivar el tejido en Agar Sabouraud Dextrosa (Oxoid®, Thermo Fisher Scientific Inc, UK) a 28 °C durante 22 días, se obtuvieron colonias blanquecinas filamentosas, que al realizar el examen microscópico en lactofenol azul reveló la presencia de hifas hialinas septadas, microconidias esféricas y macroconidias tuberculadas o equinuladas identificándose como la fase saprofítica de Histoplasma capsulatum (ver Figura 7C). Se cultivó en Agar Infusión Cerebro Corazón a 37 °C, pero no se logró demostrar el dimorfismo (Alfaro et al, 2019). Cabe destacar que tanto el Laboratorio de Patología como el Laboratorio de Micología de la Escuela Veterinaria de la Universidad Nacional ya han reportado otros casos en gatos y perros, por lo que muy probablemente exista una prevalencia más alta de histoplasmosis en estos animales domésticos en el país que no se está publicando debido al subregistro de casos. Es importante resaltar que el registro de casos en estos animales cobra importancia por el hecho de que constituyen un 36 indicador indirecto del riesgo que corre el ser humano para adquirir la infección debido a la exposición a la fuente de contaminación en común (Alfaro et al, 2019). Figura 7. A) Múltiples lesiones correspondientes a nódulos de inflamación granulomatosa en pulmones de un gato doméstico con histoplasmosis diseminada. B) Levaduras intracelulares en una célula gigante multinucleada en muestra de bazo teñida en hematoxilina eosina (600X). C) Micelio hialino septado y macroconidias tuberculadas de Histoplasma capsulatum visto en lactofenol azul (100X) (imagen tomada de Alfaro et al, 2019). Otros animales que son susceptibles a la infección tanto de la forma levaduriforme como micelial son los cerdos de guinea, roedores (Mus musculus, ratones de pata blanca o Peromyscus leucopus, rata negra o Rattus rattus, rata gris o Rattus norvegicus y ratas espinosas o Proechimys semispynosus), hamsters, didélfidos del 37 género Didelphis sp. o Philander sp., y conejos, por lo que han sido utilizados como modelos de histoplasmosis en estudios in vitro, además para aislar al hongo a partir del suelo, aire y guano de murciélagos y aves. También se pueden infectar vacas, dromedarios, caballos, burros, mulas, primates, erizos, zorros rojos (Vulpes vulpes), osos cafés (Ursus arctos), mofetas rayadas (Mephitis mephitis), zorrillo manchado (Spilogale putorius), tejones (Meles meles) y nutrias marinas (Enhydra lutris) (Chander, 2018 y Guillot et al, 2018). Infección por Histoplasma capsulatum var. duboisii La infección por Histoplasma capsulatum var. duboisii se ha reportado en babuinos (Papio cynocephalus) del oeste de África. Produce infección secundaria en piel, tejido subcutáneo y nódulos linfáticos en forma de pequeñas pápulas y granulomas supurativos, con ausencia de afectación en pulmón y vísceras, debido a que se considera menos virulento que Histoplasma capsulatum var. capsulatum (Guillot et al, 2018). Esta subespecie no se ha encontrado afectando ganado, pero sí en seres humanos y otros mamíferos como murciélagos (Nycteris hispida y Tadarida pumila) y osos hormigueros (Orycteroporus afer) (Guillot et al, 2018). Infección por Histoplasma capsulatum var. farciminosum La histoplasmosis causada por esta variedad es una enfermedad debilitante que se conoce como la histoplasmosis farciminosi o linfangitis epizoótica, en la cual el agente etiológico se considera hospedero específico en caballos, mulas, burros y perros, pero se ha recuperado también de gatos y tejones, y se cree que el ser humano podría llegar a ser afectado eventualmente. La clínica se puede manifestar en cuatro presentaciones: asintomático, ocular, cutáneo y respiratorio, de las cuales puede haber presentaciones mixtas (Chander, 2018 y Guillot et al, 2018). En el continente africano se reporta frecuentemente la histoplasmosis en caballos asociado a Histoplasma capsulatum var. farciminosum, pero se cree que los cuadros en caballos podrían ser causados también por otras variedades del hongo. En los caballos, la enfermedad se distribuye en el medio este del continente 38 africano, así como en Argelia, Angola, Chad, Cameroon, Egipto, Etiopía, Ghana, Marruecos, Nigeria, Togo, Tunisia, Senegal y Sudán, también en Japón, Filipinas, China, India, Indonesia, Iraq, Israel, Pakistán y Siria, y se considera erradicada de Europa. En Centroamérica y Suramérica también se ha informado de casos esporádicos, probablemente importados, pero casi no hay información de su reporte en la literatura (Chander, 2018, Guillot et al, 2018 y Teixeira et al, 2016). La enfermedad es tan severa en los caballos de países como Etiopía que se le ha llamado “el SIDA de los caballos” debido a que genera un impacto económico importante en esta industria de caballos de tiro ya que se ha estimado que produce la pérdida del 50 % de las ganancias diarias (Guillot et al, 2018). Curiosamente, la infección causada por Histoplasma capsulatum var. farciminosum, ya se ha reportado en gatos residentes de Suiza y del este de Francia, en el 2013 y 2014, respectivamente, donde se evidenció que la infección se limitaba a lesiones cutáneas, y el diagnóstico se realizó por histopatología, así como por biología molecular (PCR y MLST) (Guillot et al, 2018). La principal forma de transmisión de Histoplasma capsulatum var. farciminosum en caballos y muy posiblemente en otros animales, es la inoculación, principalmente por la contaminación de heridas de estos animales, pero también puede ser por inhalación o por vía conjuntival. Se ha obtenido resultados inconsistentes al experimentar con el medio de transmisión percutánea al inocular de forma subcutánea o intradérmica pus que contiene levaduras de esta variedad del hongo en caballos. Además, también se ha sospechado de la transmisión directa entre el animal infectado y el sano al contacto durante el apareamiento (Guillot et al, 2018). En África, se cree que las moscas del género Musca sp. y Stomoxys sp. transmiten mecánicamente el agente etiológico entre los animales, esto debido a que se ha aislado la subespecie farciminosum en el tracto digestivo de moscas hematófagas, además se hipotetiza que las pulgas podrían estar también involucradas en esta transmisión,. Las lesiones cutáneas en caballos tienden a atraer más moscas lo que empeora la severidad de la enfermedad (Chander, 2018 y Guillot et al, 2018). 39 Los cambios estacionales podrían tener un efecto importante en la eficacia de la transmisión directa de esta variedad en estos animales, debido a que, en época lluviosa, el lodo en las heridas retrasa su proceso de curación por lo que incrementa el riesgo en los caballos. Además, la contaminación telúrica, es decir la debida a causas naturales y no por el ser humano, como por ejemplo por el curso del agua, podría explicar porque las zonas más afectadas en la infección primaria son zonas expuestas como extremidades, fosas nasales y ojos (Guillot et al, 2018). El cuadro cutáneo está dado por nódulos subcutáneos multifocales piogranulomatosos de 0.5 cm a 3 cm de diámetro, duros e indoloros, aislados o en cadena, además las lesiones pueden progresar a través de las extremidades produciendo cojera debido a que las levaduras y leucocitos infectados con estas pueden diseminar por vasos linfáticos al tejido adyacente (ver Figura 8 y Figura 9). El período de incubación de las lesiones cutáneas es de 1-7 meses (Chander, 2018 y Guillot et al, 2018). En piel, el hongo induce una respuesta inflamatoria caracterizada por granulocitos, macrófagos y células gigantes multinucleadas, además de una reacción fibrosa y edematosa alrededor de los nódulos. Esta tumoración va de 5 cm a 30 cm de diámetro y puede evolucionar a fístulas. Se forman también abscesos que descargan un pus amarillento que contiene las levaduras, así como macrófagos y granulocitos. Cuando el tejido de granulación aparece, se forma las úlceras que son de bordes invertidos con borde activo amarillento con pus que generalmente se presentan en extremidades, tórax, pecho, cuello y cabeza, que pueden ser sobreinfectadas por bacterias (Guillot et al, 2018). Puede haber afectación de órganos genitales y hueso, y no es frecuente que las lesiones en piel se ubiquen también en mucosas (oral, conjuntiva, nasal y epitelio respiratorio) (Guillot et al, 2018). El cuadro respiratorio se caracteriza por la presencia de lesiones piogranulomatosas dentro de la mucosa nasal y el parénquima pulmonar que podrían llegar a desencadenar una infección multisistémica. El periodo de incubación del cuadro respiratorio va de semanas hasta 2 meses (Chander, 2018). 40 Al examen directo se observan levaduras en tejido que son similares a las levaduras de Histoplasma capsulatum var. capsulatum, que al cultivar por ejemplo en Agar Sabouraud Glucosado + 2.5 % glicerol, crece una colonia húmeda, glabra, granular, arrugada, color gris a blanca que tiende a hacerse café, que se desarrolla muy lentamente en alrededor de 3 meses a 25 °C, tendiendo a tener menos micelio aéreo en comparación con las otras variedades, donde se ha observado que en Agar Sabouraud Dextrosa produce micelio aéreo corto, irregular, curvo y ramificado, con cuerpos redondos a ovales rudimentarias, por lo que es necesario inducir la esporulación en Agar Extracto Suelo (Chander, 2018). Como tratamiento se administra Itraconazol en dosis de 200-600 mg por día, y si la infección es diseminada se administra Anfotericina B con remoción quirúrgica de las lesiones cutáneas. Se reportan relapsos aún después de administrado el tratamiento (Chander, 2018). La Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE por sus siglas de su antiguo nombre de Oficina Internacional de Epizootias, actualmente en inglés World Organisation for Animal Health) establece que el antifúngico de elección para el tratamiento de la linfangitis epizoótica es la Anfotericina B (Guillot et al. 2018). Otro tipo de tratamiento aplicados en caballos es el uso de yoduro, mercurio, arsénico e Imidazoles, que se consideraron eficientes, pero duran más en surtir efecto, son relativamente caros y tóxicos, y en combinación con la remoción quirúrgica de la lesión y su cauterización, la recuperación se puede alcanzar en 4 a 6 semanas (Guillot et al, 2018). Como prevención se cree que sacrificar a los caballos infectados y la práctica de normas higiénicas estrictas puede prevenir la diseminación de la enfermedad en estos animales, el problema radica en que no siempre es posible sacrificar los caballos en sitios endémicos donde representan el sustento de muchas familias ya sea para el transporte u otras actividades (Guillot et al, 2018). A raíz de esta situación, recientemente se ha desarrollado una vacuna viva atenuada contra la linfangitis epizoótica, desarrollada y probada en China, que 41 informa de la protección de 75.5 % de los caballos vacunados con una inmunidad generada que persiste por más de 2 años, pero dicha vacuna aún no se encuentra disponible comercialmente ya que aún se encuentra en investigación ciertas reacciones adversas que se han presentado (Guillot et al, 2018). Figura 8. A) Lesiones nodulares y ulcerosas de un caballo con linfangitis epizoótica en Etiopía. B) Nódulos con un patrón en cadena en rostro (imagen tomada de Guillot et al, 2018). 42 Figura 9. A) Lesiones cutáneas en extremidad anterior y B) cabeza en un burro, C) donde se observa levaduras de Histoplasma capsulatum var. farciminosum, en el examen directo del exudado purulento de las lesiones al teñir en Gram (imagen tomada de Powell et al, 2015). 43 5-EPIDEMIOLOGÍA 5.1-Distribución Geográfica La histoplasmosis es una micosis cosmopolita, tanto urbana como rural, reportada en todos los continentes a excepción de la Antártida (Gómez, 2011 y Sánchez et al, 2010). Además, es una enfermedad pulmonar endémica (Diaz, 2018), por lo que se considera de baja endemicidad a Europa y Oceanía, de endemicidad moderada a África y el sur de Asia y de endemicidad elevada a América (ver Figura 10 y Cuadro III), (Teixeira et al, 2016). Figura 10. Distribución geográfica de Histoplasma capsulatum var. capsulatum (áreas moradas) e Histoplasma capsulatum v