UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO ESTUDIO DE METABOLITOS CARACTERÍSTICOS Y POLIFENOLES DE LAS ESPECIES CAPSICUM ANNUUM Y PIPER NIGRUM, CULTIVADAS EN COSTA RICA Tesis sometida a la consideración del Programa de Estudios de Posgrado en Química para optar al grado y título de Maestría Académica en Química LUIS FELIPE VARGAS HUERTAS Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2022 ii DEDICATORIA Y AGRADECIMIENTOS A mi esposa Jacqueline, compañera indiscutible en todo este camino, dándome ánimos e inspirándome para continuar cada día. Su amor, ayuda y apoyo representan para mí más de lo que pueda escribir en estas líneas. Esta Tesis es para ti. A mis padres, quienes me enseñaron el valor del esfuerzo y las recompensas que deja el trabajo bien realizado, para ustedes que lo han dado todo por sus hijos, gracias infinitas. A mi hermano, porque también fue su sacrificio lo que me permitió llegar hasta este momento. A la Dra. Mirtha Navarro, quien no solo me abrió la puerta de BIODESS para aprender y crecer, sino que con paciencia también me motivó y orientó cuando lo necesitaba. A mis compañeras y compañeros en BIODESS, testigos de dichas y tristezas, la ayuda de amigos así nunca será olvidada. A todos los que con su apoyo de una y otra forma contribuyeron a la culminación de este trabajo, gracias. iii “Esta Tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Química de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar al grado y título de Maestría Académica en Química” HOJA DE APROBACIÓN Dr. Juan José Araya Barrantes Representante de la Decana Sistema de Estudios de Posgrado Dra. Mirtha Navarro Hoyos Directora de Tesis Dr. Renato Murillo Masís Asesor M.Sc. Paola Fuentes Schweizer Asesora Dr. Max Chavarría Vargas Director Programa de Posgrado en Química Luis Felipe Vargas Huertas Candidato iv Contenidos DEDICATORIA Y AGRADECIMIENTOS .............................................................................. ii HOJA DE APROBACIÓN .................................................................................................. iii RESUMEN ..................................................................................................................... vi LISTA DE CUADROS ...................................................................................................... vii LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... xi LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................. xvi CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 1 1.1 Perfil y propiedades de las capsaicinas en chile y de las piperamidas en pimienta ..... 2 1.2 Perfil y propiedades de los polifenoles en chile y pimienta ......................................... 8 1.3 Situación y relevancia de estudios fitoquímicos de estos dos cultivos en Costa Rica 11 CAPÍTULO II. MATERIALES Y METODOS ......................................................................... 17 2.1 Equipo, Materiales y Reactivos ................................................................................... 17 2.2 Metodología ................................................................................................................ 19 2.2.1 Características y procesamiento de las muestras ................................................ 19 2.2.2 Proceso de extracción para obtención de amidas ................................................ 21 2.2.3 Caracterización de los extractos de amidas a través de UHPLC-HRMS................ 22 2.2.4 Cuantificación de las amidas por UHPLC-DAD ..................................................... 22 2.2.5 Análisis de perfil de compuestos de pimienta por HPTLC ..................................... 24 2.2.6 Purificación y aislamiento de amidas ................................................................... 25 2.2.7 Proceso de extracción para obtención de polifenoles .......................................... 26 2.2.8 Caracterización de los extractos de polifenoles a través de UHPLC-HRMS .......... 28 2.2.9 Determinación de polifenoles totales por el método Folin-Ciocalteu .................. 28 2.2.10 Análisis de actividad antioxidante con el método de DPPH ............................... 29 2.2.11 Análisis de actividad antioxidante con el método ORAC .................................... 29 2.2.12 Análisis estadístico.............................................................................................. 30 CAPÍTULO III. RESULTADOS .......................................................................................... 31 3.1 Extracción de amidas de chile y pimienta ................................................................... 31 3.2 Caracterización de amidas de chile y pimienta ........................................................... 34 3.3 Cuantificación de amidas de chile y pimienta ............................................................. 41 3.4 Perfil de componentes de pimienta por HPTLC .......................................................... 44 v 3.5 Obtención de piperina ................................................................................................ 47 3.6 Fraccionamiento del extracto de P. nigrum y aislamiento de la guineensina ............ 49 3.7 Fraccionamiento del extracto de C. annuum .............................................................. 59 3.8 Extracción de polifenoles ............................................................................................ 67 3.9 Caracterización de polifenoles por UPLC-HRMS ......................................................... 72 3.10 Determinación de polifenoles totales por Folin-Ciocalteu ....................................... 79 3.11 Determinación de la actividad antioxidante por el método de DPPH ...................... 83 3.12 Determinación de la actividad antioxidante por el método ORAC ........................... 84 CAPÍTULO IV. DISCUSIÓN ............................................................................................. 86 4.1 Caracterización HRMS de amidas de C. annuum y P. nigrum costarricenses ............. 86 4.2 Contenido de amidas de chile y pimienta ................................................................... 97 4.3 Caracterización por HPTLC de compuestos en Piper nigrum costarricense ............. 102 4.4 Obtencion de piperina y de guineensina a partir de P. nigrum costarricense ......... 103 4.5 Fraccionamiento del extracto de C. annuum e identificación por RMN................... 107 4.6 Caracterización HRMS de polifenoles de C. annuum y P. nigrum costarricenses .... 110 4.7 Contenido de polifenoles y actividad antioxidante .................................................. 123 CONCLUSIONES .......................................................................................................... 129 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 131 vi RESUMEN El presente trabajo permitió el análisis de chile picante (Capsicum annuum) y de pimienta negra (Piper nigrum) cultivadas en Costa Rica, a través de diferentes rutas enfocadas en dos tipos de metabolitos secundarios, la primera dirigida a amidas características en estos frutos, los cuales son sustancias de menor polaridad. En la segunda aproximación, el análisis se enfocó en compuestos polifenólicos altamente polares. En C. annuum, el análisis por UHPLC-HRMS permitió la identificación de 12 compuestos, de los cuales se lograron cuantificar las 3 mayoritarias mediante UHPLC-DAD, destacando la capsaicina y la dihidrocapsaicina como mayoritarias. Adicionalmente, con HPLC semipreparativo se logró el aislamiento de dihidrocapsaicina con alta pureza, la cual es de interés como neuroprotector. Un análisis similar en P. nigrum reveló la presencia de 31 amidas, de las cuales se cuantificaron 15 por medio de UHPLC-DAD. Entre estas, la amida mayoritaria, piperina, se aisló mediante cromatografía de columna para su posterior utilización en la producción de materiales orgánicos multicomponentes. Por otro lado, se utilizó HPLC semipreparativo para aislar guineensina, con estudios en el sistema endocanabinoide, con un rendimiento superior al reportado en la literatura. Complementariamente, se utilizó HPTLC en P. nigrum, con el fin de verificar la factibilidad de utilizar esta técnica en la cuantificación de piperina como evaluador de la conformidad en productos comerciales, demostrándose un perfil de composición similar al de las muestras obtenidas en otros países. Para los extractos polares de las muestras, el análisis por UHPLC-HRMS permitió identificar 14 compuestos polifenólicos en C. annuum y también 14 diferentes compuestos en P. nigrum. Estos extractos fueron además cuantificados por el método Folin-Ciocalteu, con resultados dentro de lo reportado en la literatura para ambas muestras. La evaluación de su respuesta antioxidante se realizó con las técnicas DPPH y ORAC, obteniendo resultados para C. annuum en el rango de la literatura, pero con valores inferiores a los reportados en el caso de P. nigrum. Los análisis realizados permitieron una caracterización cualitativa y cuantitativa detallada de las muestras de C. annuum y P. nigrum de Costa Rica, lo que constituye el primer estudio en Centroamérica con este nivel de profundidad para dichas plantas. vii LISTA DE CUADROS Cuadro I. Descripción de las muestras de C. annuum y P. nigrum obtenidas de PROPICA. . 20 Cuadro II. Condiciones y resultados de las extracciones de amidas en el diseño factorial de C. annuum. ..................................................................................................................... 32 Cuadro III. Condiciones y resultados de las extracciones de amidas en el diseño factorial de P. nigrum........................................................................................................................ 34 Cuadro IV. Identificación de amidas en C. annuum por UHPLC-Q-TOF. ............................... 36 Cuadro V. Identificación de amidas en P. nigrum por UHPLC-Q-TOF. .................................. 38 Cuadro VI. Rendimientos porcentuales obtenidos para la extracción de amidas de C. annuum con respecto a la masa de muestra seca. ....................................................... 41 Cuadro VII. Contenido de capsaicinoides en las muestras de C. annuum. Valores en mg Capsaicina Equivalente/100 g muestra seca. ................................................................ 42 Cuadro VIII. Rendimientos porcentuales obtenidos para la extracción de amidas de P. nigrum. .......................................................................................................................... 42 Cuadro IX. Contenido de piperamidas en las muestras de P. nigrum. Valores en mg Piperina Equivalente/100 g muestra seca. .................................................................... 43 Cuadro X. Cuantificación de piperina en las muestras de P. nigrum, por perfil de pico de imagen a 254 nm, y por densitometría a 331 nm. ........................................................ 47 Cuadro XI. Desplazamientos y asignación de las señales de RMN (CD3OD) de la piperina aislada. ........................................................................................................................... 49 Cuadro XII. Rendimientos obtenidos en el fraccionamiento semipreparativo del extracto de P. nigrum................................................................................................................... 50 Cuadro XIII. Desplazamientos y asignación de las señales de los espectros 1H y 13C-RMN de la guineensina aislada, en CDCl3. ................................................................................... 53 viii Cuadro XIV. Desplazamientos y asignación de las señales de los espectros de 1H-RMN y 13C-RMN del compuesto (2E,4E)-N-isobutil-2,4-octadecadienamida, en CDCl3. .......... 55 Cuadro XV. Desplazamientos y asignación de las señales de los espectros de 1H y 13C-RMN del compuesto (2E,4E,13Z)-N-isobutil-2,4,13-octadecatrienamida en CDCl3. .............. 58 Cuadro XVI. Rendimiento de las fracciones de C. annuum obtenidas por cromatografía semipreparativa. ............................................................................................................ 59 Cuadro XVII. Desplazamientos y asignación de las señales de los espectros de 1H y 13C- RMN de la capsaicina en CDCl3. ..................................................................................... 62 Cuadro XVIII. Desplazamientos y asignación de las señales de los espectros de 1H y 13C- RMN de la dihidrocapsaicina en CDCl3. ......................................................................... 64 Cuadro XIX. Desplazamientos de las señales de los espectros de 1H-RMN y 13C-RMN en CDCl3 de la homocapsaicina. ......................................................................................... 66 Cuadro XX. Determinación de Folin-Ciocalteu en muestras de chile con Extracción C-1. ... 67 Cuadro XXI. Determinación de polifenoles totales por Folin-Ciocalteu en Cahpn con Extracciones C-2 y C-3. .................................................................................................. 68 Cuadro XXII. Determinación de polifenoles totales por Folin-Ciocalteu en Cahpn con Extr- C-4. ................................................................................................................................. 68 Cuadro XXIII. Determinación polifenoles totales por Folin-Ciocalteu en Cahpn con Extr-C-5. ....................................................................................................................................... 69 Cuadro XXIV. Determinación de polifenoles totales por Folin-Ciocalteu en las muestras de pimienta con el método Extr-P-1. ................................................................................. 70 Cuadro XXV. Determinación de polifenoles totales por Folin-Ciocalteu en la muestra Pnien, con los métodos Extr-P-2 a Extr-P-5. ............................................................................. 70 Cuadro XXVI. Determinación de polifenoles totales por Folin-Ciocalteu en Pnien con el método Extr-P-6. ........................................................................................................... 71 ix Cuadro XXVII. Identificación por UPLC-ESI-MS usando un Orbitrap XL, de polifenoles presentes en chiles costarricenses. La presencia de cada compuesto en las muestras se representa con una equis (x). ................................................................................... 73 Cuadro XXVIII. Identificación por UPLC-ESI-MS usando un Orbitrap XL de polifenoles presentes en pimientas costarricenses. La presencia de cada compuesto en las muestras se representa con una equis (x). ................................................................... 77 Cuadro XXIX . Rendimientos porcentuales obtenidos para la extracción de polifenoles de C. annuum utilizando el método optimizado Extr-C-5. ..................................................... 79 Cuadro XXX. Valores individuales de polifenoles totales mediante el método Folin- Ciocalteu, obtenidos para los extractos polifenólicos Extr-C-5 de las muestras Cahfo y Cahva. ............................................................................................................................ 80 Cuadro XXXI. Resumen de los valores de polifenoles totales obtenidos para los extractos polifenólicos de las muestras de C. annuum, mediante el método Folin-Ciocalteu. .... 80 Cuadro XXXII. Rendimientos porcentuales obtenidos para la extracción de polifenoles de P. nigrum utilizando el método optimizado Extr-P-6. ....................................................... 81 Cuadro XXXIII. Valores individuales de polifenoles totales mediante el método Folin- Ciocalteu, obtenidos para los extractos polifenólicos Extr-P-6 de las muestras Pnidi y Pnife. .............................................................................................................................. 82 Cuadro XXXIV. Resumen de los valores de polifenoles totales obtenidos para los extractos polifenólicos de las muestras de P. nigrum, mediante el método Folin-Ciocalteu. ..... 82 Cuadro XXXV. Valores de actividad antioxidante para C. annuum obtenidos por el método DPPH. ............................................................................................................................. 83 Cuadro XXXVI. Valores de actividad antioxidante para P. nigrum obtenidos por el método DPPH. ............................................................................................................................. 84 Cuadro XXXVII. Valores de actividad antioxidante para C. annuum obtenidos por el método ORAC. ............................................................................................................................. 84 x Cuadro XXXVIII. Valores de actividad antioxidante para P. nigrum obtenidos por el método ORAC. ............................................................................................................................. 85 Cuadro XXXIX. Valores de los capsaicinoides principales (en mg/100 g muestra seca), reportados en la literatura para Capsicum spp. ............................................................ 99 Cuadro XL . Valores de las piperamidas principales (en mg/100 g muestra seca), reportados en la literatura para P. nigrum. ................................................................ 101 Cuadro XLI. Comparación en la cuantificación de piperina entre las muestras de P. nigrum de Costa Rica, con muestras de otros países y/o tipos de pimienta, por perfil de pico de imagen y por densitometría. .................................................................................. 103 Cuadro XLII. Identificación de piperamidas en las fracciones de la separación semipreparativa de Pnien. ........................................................................................... 104 Cuadro XLIII. Contenido polifenólico total reportado en Capsicum spp, analizado mediante el método Folin-Ciocalteu. .......................................................................................... 124 Cuadro XLIV. Contenido polifenólico total reportado para P. nigrum, analizado mediante el método Folin-Ciocalteu. .............................................................................................. 125 Cuadro XLV. Actividad antioxidante por el método DPPH reportada en Capsicum spp. ... 125 Cuadro XLVI. Actividad antioxidante reportada en P. nigrum mediante el método DPPH. ..................................................................................................................................... 126 Cuadro XLVII. Actividad antioxidante reportada para Capsicum spp por el método ORAC. ..................................................................................................................................... 127 Cuadro XLVIII. Actividad antioxidante por el método ORAC reportada en P. nigrum. ...... 128 xi LISTA DE FIGURAS Figura 1. Diagrama de las familias de compuestos de interés para el proyecto: polifenoles, comunes en ambas plantas; piperina, una piperamida, características en P. nigrum; y capsaicina, un capsaicinoide, característicos en C. annuum. .......................................... 1 Figura 2. Estructura de la capsaicina, el capsaicinoide mayoritario en C. annuum. .............. 2 Figura 3. Estructuras de a) dihidrocapsaicina y b) nordihidrocapsaicina. .............................. 2 Figura 4. Estructura de la piperina, la piperamida más abundante en P. nigrum. ................. 3 Figura 5. Estructura de a) piperlonguminina y b) pellitorina, presentes en P. nigrum. ......... 3 Figura 6. Estructura de a) guineensina y b) retrofractamida A, presentes en P. nigrum. ...... 4 Figura 7. Ventas totales de suplementos nutricionales en los Estados Unidos de América entre 2012 y 2020. Fuente: Smith et al., (2021). .......................................................... 13 Figura 8. Número total de suplementos nutricionales comerciales registrados en los Estados Unidos de América que contienen (a) chile picante, o (b) pimienta negra. Fuente: National Institutes of Health (NIH), 2022. ..................................................................... 14 Figura 9. Curva de calibración de la capsaicina a través de cuantificación por UPLC-DAD a 282 nm. .......................................................................................................................... 31 Figura 10. Curvas de calibración de la piperina a través de cuantificación por UPLC-DAD, a 280 nm (⚫) y 340 nm (). ............................................................................................ 33 Figura 11. Cromatograma de extracción de iones (XIC) del análisis UPLC-Q-TOF para los picos: a) 1, 2, 4, 5 y 7; b) 3, 6 y 8; c) 9, 10, 11 y 12, del extracto de C. annuum. .......... 35 Figura 12. Cromatograma de extracción de iones XIC del análisis UPLC-Q-TOF de extractos de P. nigrum, separado en grupos (a-d) para facilitar su visualización. ........................ 37 Figura 13. Análisis de las muestras Pnien (punto de aplicación 6) y Pnife (punto de aplicación 7) por HPTLC según el método de HPTLC Association. a) Revelado en luz UV a 254 nm, xii b) revelado en luz UV a 366 nm, c) revelado posterior a la derivatización en luz UV a 366 nm, d) revelado posterior a la derivatización en luz blanca. ................................. 45 Figura 14. Análisis de las muestras Pnien (punto de aplicación 9) y Pnife (punto de aplicación 10) para cuantificación de piperina por interpolación en curva de calibración (puntos de aplicación 2-6). Revelado en a) luz UV a 254 nm, b) luz UV a 366 nm, c) posterior a la derivatización en luz UV a 366 nm, d) posterior a la derivatización en luz blanca. .. 46 Figura 15. Espectros: a) 1H-RMN (400 MHz) b) 13C-RMN (100 MHz) de la piperina aislada, en CD3OD. ........................................................................................................................... 48 Figura 16. Cromatogramas obtenidos para a) fracción 6, guineensina; y b) fracción 9, (2E,4E)-N-isobutil-2,4-octadecadienamida. .................................................................. 51 Figura 17. Espectros de guineensina aislada en la fracción 6. a) 1H-RMN, 400 MHz, b) 13C- RMN, 100 MHz. Solvente: CDCl3. ................................................................................... 52 Figura 18. Espectros en CDCl3. a) 1H-RMN (400 MHz), y b) 13C-RMN (100 MHz) de (2E,4E)-N- isobutil-2,4-octadecadienamida, aislada en la fracción 9. ............................................ 54 Figura 19. Cromatograma obtenido para la fracción 8, (2E,4E,13Z)-N-isobutil-2,4,13- octadecatrienamida. ...................................................................................................... 56 Figura 20. Espectros a) 1H-RMN (400 MHz), y b) 13C-RMN (100 MHz) de la fracción 8 en CDCl3, con el compuesto mayoritario (2E,4E,13Z)-N-isobutil-2,4,13-octadecatrienamida. .... 57 Figura 21. Cromatogramas individuales de las fracciones de C. annuum. a) Fracción 3, mayoritariamente capsaicina; b) fracción 5, dihidrocapsaicina; y c) fracción 6, homocapsaicina. ............................................................................................................ 60 Figura 22. Espectros a) 1H-RMN (400 MHz), y b) 13C-RMN (100 MHz) de la fracción 3 en CDCl3, con capsaicina como compuesto mayoritario............................................................... 61 Figura 23. Espectros a) 1H-RMN (400 MHz), y b) 13C-RMN (100 MHz) en CDCl3 de la fracción 5, correspondiente a dihidrocapsaicina. ....................................................................... 63 xiii Figura 24. Espectros a) 1H-RMN (400 MHz), y b) 13C-RMN (100 MHz) de la fracción 6 en CDCl3, homocapsaicina. ............................................................................................................ 65 Figura 25. Cromatograma UPLC-ESI-MS (Orbitrap XL), para el extracto polifenólico de chile. ....................................................................................................................................... 72 Figura 26. Cromatograma UPLC-ESI-MS medido en un Orbitrap XL, para el extracto polifenólico de pimienta. ............................................................................................... 76 Figura 27. Estructura y patrón de fragmentación para la capsaicina, norcapsaicina y nornorcapsaicina. .......................................................................................................... 86 Figura 28. Estructura y patrón de fragmentación para la dihidrocapsaicina, nordihidocapsaicina y nornordihidrocapsaicina. .......................................................... 87 Figura 29. Estructura y fragmentos de homocapsaicina I y homodihidrocapsaicina I. ........ 88 Figura 30. Estructura y fragmentación de la oleamida y la 13-docosenamida. ................... 88 Figura 31. Estructura de la capsiamida. ................................................................................ 89 Figura 32. Estructura de la octadecanamida. ....................................................................... 89 Figura 33. Estructura y principales fragmentos de compuestos con el grupo metilendioxofenilo y cadena lateral de isobutilamina. ................................................. 91 Figura 34. Estructura y fragmentación de metilendioxofenil amidas con cadena lateral de pirrolidina. ..................................................................................................................... 92 Figura 35. Estructura y fragmentación de metilendioxofenil amidas con cadena lateral de piperidina. ...................................................................................................................... 94 Figura 36. Estructura y fragmentación de la piperflaviflorina B. .......................................... 95 Figura 37. Estructura de los compuestos con cadena lineal en el extremo C de la amida. . 97 Figura 38. Estructura de (2E,4E)-N-isobutil-2,4-octadecadienamida, en fracción 9. ......... 105 Figura 39. Estructura de (2E,4E,12Z)-N-isobutil-2,4,12-octadecatrienamida en la fracción 8. ..................................................................................................................................... 105 xiv Figura 40. Estructura de la guineensina. ............................................................................ 106 Figura 41. Estructura de la piperina. ................................................................................... 107 Figura 42. Estructura de la capsaicina. ............................................................................... 108 Figura 43. Estructura de la homocapsaicina II. ................................................................... 109 Figura 44. Estructura de la dihidrocapsaicina. .................................................................... 109 Figura 45. Estructura del ácido quínico y fragmentaciones importantes. ......................... 110 Figura 46. Estructura y fragmentos del ácido sinápico. ...................................................... 111 Figura 47. Estructura y fragmentos principales del vanilloil O-hexosa. ............................. 111 Figura 48. Estructura y fragmentación para coumaroil O-hexosa y feruloil O-hexosa. ..... 112 Figura 49. Estructura y fragmentación del ácido cafeoilquínico. ....................................... 113 Figura 50. Estructura de las apigenina C-glicosiladas con sus fragmentaciones características. ............................................................................................................. 114 Figura 51. Estructura y fragmentación de la luteolina C-hexósido. ................................... 115 Figura 52. Estructura y patrón de fragmentación de la Isoramnetina O-rutinósido. ......... 115 Figura 53. Estructura y principales fragmentos para los compuestos derivados del metilorobol. ................................................................................................................. 116 Figura 54. Estructura y fragmentación principal de la sacarosa. ........................................ 117 Figura 55. Estructura del ácido 4-O-metilglucónico y representación de sus fragmentos principales. .................................................................................................................. 118 Figura 56. Estructura y fragmentos principales de la periplobiosa. ................................... 118 Figura 57. Estructura y fragmentación de los derivados del hidroxitirosol. ....................... 119 Figura 58. Estructura y fragmentos importantes del ácido dihidrofaseico O-hexósido..... 120 Figura 59. Estructura y fragmentación del ácido siríngico. ................................................ 120 xv Figura 60. Estructura y fragmentación los compuestos C-glicosilados de apigenina. ........ 121 Figura 61. Estructura y fragmentación de la luteolina O-desoxihexosil-O-pentosa. .......... 122 Figura 62. Estructura y fragmentación de la apigenina O-apiosil-O-desoxihexósido. ........ 122 xvi LISTA DE ABREVIATURAS %: Porcentaje [M+H]+: Ion molecular cargado positivamente por ganancia de un protón [M-H]-: Ion molecular cargado negativamente por pérdida de un protón °C: Grados Celsius 13C: Isótopo carbono-13 1H: Isótopo de hidrógeno-1 AAPH: diclorhidrato de 2,2'-azobis-2-metil-propanimidamida ABTS: Ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) AcOEt: Acetato de etilo ADN: Ácido desoxirribonucleico AGE: Ácido gálico equivalente ANOVA: Análisis de varianza (por sus siglas en inglés) ARN: Ácido ribonucleico CDCl3: Cloroformo deuterado Da: Dalton DAD: Detector de arreglo de diodos DDA: Análisis dependiente de datos (por sus siglas en inglés) DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo EPR: resonancia paramagnética electrónica (por sus siglas en inglés) ESI: Ionización química por electrospray (por sus siglas en inglés) F254: Indicador de fluorescencia a 254 nm FAAH: Hidrolasa de ácidos grasos (por sus siglas en inglés) FC: Folin-Ciocalteu FRAP: Análisis de potencial reductor férrico (Por sus siglas en inglés) g: gramos xvii h: Horas ha: Hectárea HCC: Carcinoma hepatocelular HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución (por sus siglas en inglés) HPTLC: Cromatografía de capa delgada de alta resolución (por sus siglas en inglés) HRMS: Espectroscopía de masas de alta resolución (por sus siglas en inglés) IC50: Concentración inhibitoria media kV: Kilovoltios L: Litro LC: Límite de cuantificación LD: Límite de detección LD50: Dosis letal media m/z: Relación masa/carga mbar: Milibar CD3OD: Metanol deuterado MeOH: Metanol mg: miligramo MHz: Megahercios min: Minutos mL: Mililitro mm: Milímetro mmol: Milimol MOM: Materiales orgánicos multicomponentes MS: Espectroscopía de masas MSn: Fragmentos de masas de nivel n (con n = 2-5) N.C.: No cuantificable NIH: Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (por sus siglas en inglés) xviii nm: Nanómetros ORAC: Análisis de capacidad de absorbancia de radicales oxígeno (por sus siglas en inglés) pH: Potencial de hidrógeno PLE: Extracción líquida presurizada (por sus siglas en inglés) ppm: Partes por millón PROCOMER: Promotora del Comercio Exterior psi: libra de fuerza por pulgada cuadrada Q-TOF: Detector cuadrupolo-tiempo de vuelo (por sus siglas en inglés) REDIBERO: Red Iberoamericana de Entidades de Promoción de Exportaciones y Atracción de Inversiones RMN: Resonancia magnética nuclear ROS: Especies reactivas de oxígeno (por sus siglas en inglés) s: Segundos TE: Trolox equivalente tR: Tiempo de retención Trolox: Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico UHPLC/UPLC: Cromatografía líquida de ultra-alta resolución (por sus siglas en inglés) USP: Farmacopea de los Estados Unidos (por sus siglas en inglés) UV-VIS: Ultravioleta-visible V: Voltios XIC: Cromatograma de extracción de iones δ: Desplazamiento químico μg: Microgramos μmol: Micromol Yo, Luis Felipe Vargas Huertas , con cédula de identidad 1-1530-0743 , en mi condición de autor del TFG titulado . ESTUDIO DE METABOLITOS CARACTERÍSTICOS Y POLIFENOLES DE LAS ESPECIES CAPSICUM ANNUUM Y PIPER NIGRUM, CULTIVADAS EN COSTA RICA . Autorizo a la Universidad de Costa Rica para digitalizar y hacer divulgación pública de forma gratuita de dicho TFG a través del Repositorio Institucional u otro medio electrónico, para ser puesto a disposición del público según lo que establezca el Sistema de Estudios de Posgrado. SI X NO* *En caso de la negativa favor indicar el tiempo de restricción: ________________ año (s). Este Trabajo Final de Graduación será publicado en formato PDF, o en el formato que en el momento se establezca, de tal forma que el acceso al mismo sea libre, con el fin de permitir la consulta e impresión, pero no su modificación. Manifiesto que mi Trabajo Final de Graduación fue debidamente subido al sistema digital Kerwá y su contenido corresponde al documento original que sirvió para la obtención de mi título, y que su información no infringe ni violenta ningún derecho a terceros. El TFG además cuenta con el visto bueno de mi Director (a) de Tesis o Tutor (a) y cumplió con lo establecido en la revisión del Formato por parte del Sistema de Estudios de Posgrado. FIRMA ESTUDIANTE Nota: El presente documento constituye una declaración jurada, cuyos alcances aseguran a la Universidad, que su contenido sea tomado como cierto. Su importancia radica en que permite abreviar procedimientos administrativos, y al mismo tiempo genera una responsabilidad legal para que quien declare contrario a la verdad de lo que manifiesta, puede como consecuencia, enfrentar un proceso penal por delito de perjurio, tipificado en el artículo 318 de nuestro Código Penal. Lo anterior implica que el estudiante se vea forzado a realizar su mayor esfuerzo para que no sólo incluya información veraz en la Licencia de Publicación, sino que también realice diligentemente la gestión de subir el documento correcto en la plataforma digital Kerwá. Autorización para digitalización y comunicación pública de Trabajos Finales de Graduación del Sistema de Estudios de Posgrado en el Repositorio Institucional de la Universidad de Costa Rica. https://es.wikipedia.org/wiki/Responsabilidad https://es.wikipedia.org/wiki/Responsabilidad https://es.wikipedia.org/wiki/Responsabilidad https://es.wikipedia.org/wiki/Perjurio https://es.wikipedia.org/wiki/Perjurio https://es.wikipedia.org/wiki/Perjurio 1 CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN Los efectos beneficiosos observados en campos variados como la alimentación, la medicina o la agricultura, han generado interés en el estudio de los metabolitos presentes en diferentes plantas. En este contexto, los frutos del chile picante (Capsicum annuum) y la pimienta (Piper nigrum) son conocidos por su uso como especias en gastronomía, cultivadas en Costa Rica con una producción nacional importante, pero donde los estudios realizados se han enfocado en las características físicas y organolépticas, sin enfatizar en su caracterización química. Los principales metabolitos característicos para estas plantas se ilustran en la Figura 1, siendo de interés su caracterización, cuantificación y la medición de su actividad antioxidante en plantas costarricenses. Figura 1. Diagrama de las familias de compuestos de interés para el proyecto: polifenoles, comunes en ambas plantas; piperina, una piperamida, características en P. nigrum; y capsaicina, un capsaicinoide, característicos en C. annuum. 2 1.1 Perfil y propiedades de las capsaicinas en chile y de las piperamidas en pimienta Para Capsicum annuum se encuentra que los capsaicinoides son los metabolitos mayoritarios en el fruto y entre éstos la capsaicina, ilustrada en la Figura 2, es el metabolito principal (Meckelmann et al., 2013). Figura 2. Estructura de la capsaicina, el capsaicinoide mayoritario en C. annuum. Otras amidas importantes son la dihidrocapsaicina y la nordihidrocapsaicina (Meckelmann et al., 2013), ilustradas en la Figura 3. a) b) Figura 3. Estructuras de a) dihidrocapsaicina y b) nordihidrocapsaicina. 3 En el caso de Piper nigrum, conocida como pimienta negra, las piperamidas son las que constituyen los compuestos más importantes y la piperina, ilustrada en la Figura 4, corresponde a la amida principal (Scott et al., 2005). Figura 4. Estructura de la piperina, la piperamida más abundante en P. nigrum. Entre otras amidas de importancia reportadas, como se ilustra en la Figura 5, se encuentran la piperlonguminina y la pellitorina (Scott et al., 2005). a) b) Figura 5. Estructura de a) piperlonguminina y b) pellitorina, presentes en P. nigrum. Otras amidas identificadas en esta especie son la guineensina y la retrofractamida A (Park et al., 2002), ilustradas en la Figura 6. 4 a) b) Figura 6. Estructura de a) guineensina y b) retrofractamida A, presentes en P. nigrum. En cuanto a las propiedades bioactivas de estas amidas, se tiene que la capsaicina, el principal metabolito de C. annuum, actúa como protector del sistema neurológico, por ejemplo, permitiendo reducir reacciones de inflamación neurológica a través de la reducción de neuropéptidos de las terminales nerviosas, y se asocia a alteraciones de metabolismo celular al ser utilizada en altas concentraciones por periodos de tiempo extendidos, incluyendo la supresión de la respiración mitocondrial; también tiene impacto en la patogénesis de carcinoma hepatocelular (HCC), dado el efecto antitumoral sinergético de la capsaicina con sorafenib, el fármaco más conocido y utilizado para el tratamiento de HCC (Scheau et al., 2019). Por otro lado, la capsaicina ha mostrado actividad en el tratamiento de reflejos del sistema respiratorio superior, en la prevención de adipogénesis, en el incremento del metabolismo y la regulación de respuestas inmunes (Huang et al., 2013), mostrando asimismo gran potencial por sus propiedades en el tratamiento del dolor en conjunto con otros analgésicos, así como su aporte en el tratamiento de enfermedades vasculares y sus efectos gastro protectores (Basith et al., 2016). Adicionalmente, se ha reportado que la capsaicina inhibe, tanto in-vitro como in- vivo, el crecimiento en células tumorales de próstata y que induce apoptosis a través de la 5 disipación de potencial interno transmembrana mitocondrial y la activación de la caspasa 3, donde un mecanismo de acción similar ha sido observado en cáncer de colon y de páncreas tratados con capsaicina (Chapa-Oliver & Mejía-Teniente, 2016). Por otro lado, P. nigrum ha sido estudiada por su uso en el tratamiento de afecciones respiratorias como bronquitis, reumatismo o enfermedades intestinales como diarrea (Salehi et al., 2019); así como por propiedades anticancerígenas, analgésicas, anticonvulsivas, antidepresivas y hepato-protectoras, habiéndose reportado su potencial uso terapéutico para tratar problemas de sueño y estados relacionados con la ingesta de cafeína (Yoon et al., 2022). Por su parte, se ha reportado que la piperina, la amida más abundante en P. nigrum, ejerce efectos anti-inflamatorios, neuroprotectores, inmunomodulatorios, cardioprotectores y anticancerígenos (Turrini et al., 2020). Asimismo, aumenta la biodisponibilidad de fármacos y nutrientes, incrementando la absorción intestinal y regulando el metabolismo y transporte (Katarina et al., 2019). Además, los efectos de la piperina asociados a quimioterapias anticáncer tradicionales ha sido objeto de estudios recientes con perspectivas prometedoras del uso de la piperina (Turrini et al., 2020). Adicionalmente, extractos de P. nigrum han mostrado actividad antibacteriana ante C. albicans, E. coli, Aspergillus spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., y Salmonella spp; y también se reporta su potencial contra enfermedades crónicas por sus actividades antiproliferativas, antiinflamatorias y neuro-farmacológicas (Salehi et al., 2019). Por otro lado, las propiedades de estos metabolitos permiten que estas especies sean utilizadas en la agricultura como un reemplazo de los agroquímicos en el control de plagas. En relación con estos efectos, se ha encontrado en la literatura que el extracto metanólico de C. annuum tiene una mortalidad de hasta 45% en el ácaro Tetranychus urticae, con exposición de 24 h, aproximadamente la mitad de la mortalidad del control positivo 2-tridecanona. Además, posee actividad repelente con valores EC50 mínimos de hasta 0.0035 µg/cm2 (Antonious et al., 2006). 6 Asimismo, la capsaicina inhibe el crecimiento de la bacteria Gram positiva Bacillus subtilis en concentraciones de 25 µg/mL (Molina-Torres et al., 1999) y actúa en sinergia con un insecticida organofosforado (pirimifos-metil en concentración final de 2.25 g/L) contra el escarabajo de la papa (Leptinotarsa decemlineata) aumentando la tasa de mortalidad de un 67% para el organofosforado solo, hasta un 92% al aplicar ambos productos juntos, en concentraciones de capsaicina de 10-7 mol/L (Maliszewska & Tęgowska, 2012). Otros estudios muestran que al utilizar un extracto etanólico de P. nigrum se obtiene una mortalidad mayor al 90% sobre los coleópteros Sitophilus oryzae y Callosobruchus maculatus al aplicarlo en una concentración de 6.25 µg/insecto por tres días (H. C. F. Su, 1977). El extracto metanólico, en concentración de 100 μg/mL y exposición de 48 horas, tiene una mortalidad del 100% sobre Culex pipiens pallens, Aedes aegypti y Aedes togoi, donde los principales componentes con actividad insecticida son la pipercida y retrofractamida A, seguido en importancia por la pelitorina, guineensina y por último la piperina, que no se muestra tan efectiva (Park et al., 2002). También contra Callosobruchus maculatus, los componentes aislados de la P. nigrum logran resultados de LD50 de entre 0.25 y 2.18 µg/insecto en machos, y entre 1.43 y 6.70 µg/insecto en hembras, para pelitorina, guineensina y pipercida (H. C. F. Su & Horvat, 1981). Entre estas amidas, la piperina ha sido objeto de aplicaciones y estudios recuentes por sus propiedades de potenciar la solubilidad en plasma de metabolitos naturales o de fármacos a través de la formación de materiales orgánicos multicomponentes (MOM). Así, aumentan los efectos positivos de fármacos como la lovastatina y el ibersartán que se encuentran limitados por su baja solubilidad acuosa y que, adicionalmente, su biodisponibilidad es afectada por el proceso de glucoronidación, ante el que la piperina ha exhibido inhibición; por lo que se ha encontrado que la piperina puede incrementar la biodisponibilidad de estos fármacos (Wilhelm-Romero et al., 2022). Entre los materiales orgánicos multicomponentes, las mezclas eutécticas poseen características que incrementan la solubilidad, por ejemplo, con menor punto de fusión que los compuestos puros, tamaño de partícula reducidos y menores temperaturas de procesos 7 (Vippagunta et al., 2007). En este contexto, es de interés la piperina, por su potencial demostrado en la formación de mezclas eutécticas con estos dos fármacos y con la curcumina, que resultaron en solubilidad acuosa incrementada y velocidad de disolución relacionada con la mayor humectabilidad asociada con el decrecimiento observado en el ángulo de contacto (Wilhelm-Romero et al., 2022). Incluso, extractos de pimienta negra con contenido conocido de piperina se comercializan bajo marcas registradas, por ejemplo, BioPerine®, promovida por sus propiedades para aumentar la biodisponibilidad de nutrientes, habiéndose realizado estudios clínicos en los Estados Unidos de Norte América y otros países, que han evidenciado su seguridad y eficacia para uso nutricional (Sabinsa Corporation, n.d.). Por otro lado, otras amidas de Piper spp. han cobrado interés reciente debido a sus propiedades bioactivas, tal como en inhibidores de captación celular de la anandamida endocanabinoide. En efecto, estudios de estructura-actividad indican la importancia de la longitud de las cadenas alquílicas de moléculas como la guineensina, que inhibe específicamente la captación de endocanabinoides en diferentes líneas celulares independientes de la hidrolasa de ácidos grasos (FAAH por sus siglas en inglés), lo que la convierte en un metabolito de enorme interés por sus implicaciones en estas actividades farmacológicas (Nicolussi et al., 2014). Lo aquí descrito muestra la relevancia del estudio fitoquímico de las amidas de los frutos de estas dos especies cultivadas en Costa Rica, tanto por la adquisición de conocimiento científico como por la relevancia que tienen sus aplicaciones para los productores nacionales, así como para su comercialización dado el potencial bioactivo de estos metabolitos. 8 1.2 Perfil y propiedades de los polifenoles en chile y pimienta En las dos especias ha sido reportado la presencia de polifenoles, donde las metodologías utilizadas en la extracción involucran normalmente el uso de disolventes polares o disoluciones acuosas (McRae et al., 1982; Tomás-Barberán et al., 1992). Los compuestos polifenólicos han generado gran interés en los años recientes, tanto para su investigación como en el consumo de alimentos y bebidas ricos en estos compuestos, principalmente por su acción como sustancias antioxidantes. Esta actividad no es exclusiva para un tipo de molécula oxidante, sino que son funcionales tanto en la neutralización de radicales libres y especies reactivas de oxígeno (ROS por sus siglas en inglés) como el ion hidroxilo (OH-) o el ion superóxido (O2 -), como también actúan de quelantes con metales de transición que están involucrados en la formación de radicales libres (Brglez Mojzer et al., 2016). Este tipo de especies reactivas provoca reacciones no controladas con las biomoléculas de los organismos vivos, incluyendo ácidos grasos de la membrana celular, proteínas, cadenas de ácido ribonucleico (ARN) o incluso con cadenas de ácido desoxirribonucleico (ADN) (Jacob et al., 2013). Estos procesos son parte del estrés oxidativo asociado al envejecimiento y al desarrollo de enfermedades como artritis reumatoide, Alzheimer, Parkinson, enfermades cardiovasculares (Mariani et al., 2005; Pignatelli et al., 2018), o incluso cáncer (Arfin et al., 2021; Reuter et al., 2010). En este sentido, diversos estudios poblaciones y ensayos clínicos han demostrado que los polifenoles tienen efectos benéficos de regulación de los procesos metabólicos y protección celular, reduciendo los cambios asociados al envejecimiento (Leri et al., 2020). Estos resultados se complementan con pruebas in vitro e in vivo, donde se demuestra la actividad antioxidante de los polifenoles vía quelación de metales, estabilización por resonancia de radicales, u oxidación de especies reactivas (Quideau et al., 2011). Sin embargo, los beneficios de los compuestos polifenólicos son más amplios, e 9 incluyen protección contra luz ultravioleta, parásitos o patógenos, así como efectos antiinflamatorios y anticancerígenos con varios tipos de cáncer (Brglez Mojzer et al., 2016; Koch, 2019; Tresserra-Rimbau et al., 2018). Existen diferentes metodologías para cuantificar la actividad antioxidante de extractos o de compuestos específicos. Uno de los métodos de referencia más utilizados lo constituye el análisis de Folin-Ciocalteu (FC) que se utiliza para cuantificar los polifenoles totales y evaluar la capacidad reductiva de moléculas y extractos, a través de un mecanismo de transferencia de electrón y que involucra la oxidación de los grupos fenólicos por acción de sales de tungsteno y molibdeno en medio básico (Platzer et al., 2021; Slinkard & Singleton, 1977). Por otro lado, la capacidad de eliminación de radicales libres se puede realizar a través de uno de los ensayos más utilizados que es el DPPH, en el que se analiza la inhibición por el radical libre estable DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) mediante colorimetría por absorbancia a 540 nm, luego de incubar la muestra junto con el radical (Niki, 2011). Se elabora una curva respecto a la concentración, y se calcula el valor IC50 (concentración a la que se obtiene un 50% de inhibición) tomando el blanco como referencia. Cabe mencionar, que a diferencia del análisis ORAC, que se describe más adelante, en el ensayo de DPPH un incremento en la actividad antioxidante se refleja en una disminución en el valor IC50 (Katsube et al., 2004). Si bien se había considerado anteriormente que el mecanismo podría ser mixto, es decir de transferencia de electrón y de transferencia de hidrógeno, estudios cinéticos para este ensayo han mostrado que la etapa determinante de la velocidad envuelve una transferencia rápida de electrones de los de los aniones fenóxido al DPPH, en solventes orgánicos próticos (Foti et al., 2004). Otro análisis colorimétrico utiliza el ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6- sulfónico) (ABTS) en su forma aniónica (ABTS•-) obtenida al hacer reaccionar el ABTS con persulfato de potasio (Re et al., 1999); el ensayo del anión superóxido (O2 •-) utiliza la autooxidación del pirogalol para determinar la capacidad de la muestra de inhibir éste ion, en un medio con luminol y pH controlado, donde la medición se realiza con resonancia 10 paramagnética electrónica (EPR por sus siglas en inglés) (N. Li et al., 2008) y el análisis de potencial reductor férrico (FRAP por sus siglas en inglés) mide la reducción del hierro (III) a hierro (II) en el complejo tripiridil-triazina por una reacción de óxido-reducción (Borges et al., 2010). Sin embargo, una de las técnicas con ventajas es el análisis de capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC por sus siglas en inglés), que se basa en la eficiencia de la muestra para reducir el efecto de radicales peróxidos liberados por una disolución de AAPH (diclorhidrato de 2,2'-azobis-2-metil-propanimidamida) sobre la fluoresceína, midiendo el decaimiento en la fluorescencia de ésta a través del tiempo. En este análisis ORAC, se realiza una correlación del área bajo la curva contra la concentración de muestra, y se compara con una curva de Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílico) que se utiliza como patrón de referencia. Cuanto mayor sea el resultado mejor es la actividad antioxidante de la muestra, pues evita la descomposición de la fluoresceína por acción de los radicales (Dávalos et al., 2004). En lo referente a la citotoxicidad, el extracto metanólico de C. annuum en concentraciones 500 µg/mL tiene efectos antiproliferativos en las líneas celulares cancerígenas MKN45 (96.8%) y HTC116 (80%), llegando incluso a 70% de inhibición en MCF7 a 50 µg/mL (Jeon et al., 2012). Por otro lado, la piperina, encontrada en P. nigrum, a 50 µmol/L disminuye la resistencia al medicamento anticancerígeno doxorubicina en líneas celulares resistentes, reduciendo los valores de IC50 de 40.5 a 1.26 µmol/L en la línea celular MCF-7/DOX, de 4.43 a 0.28 µmol/L en A-549/DOX, y de 37.72 a 5.41 µmol/L para el medicamento Mitoxantrone en MCF-7/DOX (Sen Li et al., 2011). Con base en lo mencionado, se evidencia la importancia biológica de los metabolitos de las dos especies en estudio, tanto la de sus extractos enriquecidos en amidas como la de sus extractos polares, con contenido polifenólico, donde ambos tipos de compuestos son 11 objeto del presente trabajo, que constituye asimismo el primer estudio a nivel centroamericano de ambas especies. 1.3 Situación y relevancia de estudios fitoquímicos de estos dos cultivos en Costa Rica A nivel mundial, el comercio de Capsicum se da en forma de fruto seco, con una producción mundial de 4.0 millones de toneladas métricas en el año 2020, pero que alcanzó el máximo de 4.4 millones de toneladas en el 2018 trans un aumento sostenido desde el año 2006 (Tridge, 2022a). El principal productor corresponde a India que acapara el 44.2% de la producción mundial con 1.70 mil millones de toneladas, seguido por Tailandia y China con 8.0% y el 7.6% del total respectivamente, siendo que un 73.2% de la producción se concentra en países asiáticos; mientras que el país americano con mayor producción es México con 60.7 mil toneladas equivalentes a 1.5% de la producción global (Tridge, 2022a). En términos económicos, las exportaciones de este producto representaron 6.19 mil millones de dólares en el 2020, con México como principal país exportador abarcando un 23.5% del total, equivalente a 1.46 mil millones de dólares que representa un 56% de aumento desde el año 2015. Estas exportaciones estuvieron dirigidas prácticamente en su totalidad a Estados Unidos, que constituye el principal importador de chile por un total de 1.9 mil millones de dólares. El resto del mercado de exportación durante el año se concentra en España con 1.39 mil millones de dólares, y Países Bajos en el tercer puesto con 1.17 mil millones de dólares, con destinos variados principalmente en el mercado europeo (Tridge, 2022a). En cuanto a la pimienta, el mayor productor durante el año 2020 fue Vietnam con 270 mil toneladas métricas, que comprende un 37.8% de la producción total. El segundo lugar lo ocupa Brasil con 115 mil toneladas, mientras que la tercera posición en este ranking pertenece a Indonesia con 89 mil toneladas. La producción global, de 714 mil toneladas 12 métricas en el 2020, creció un 65% desde el año 2013, luego de un periodo de relativa constancia donde se mantuvo cercano a las 450 mil toneladas métricas anuales en los años 2006-2013 (Tridge, 2022b). Con respecto a las exportaciones mundiales, abarcaron un total de 1.21 mil millones de dólares en 2020, que sin embargo constituye un decrecimiento de alrededor de 60% respecto al año 2015 y que es consecuente con la tendencia durante el quinquenio. En este apartado, Vietnam es el principal país exportador, abarcando un 43.2% del mercado en 2020 por un valor de 522.5 millones de dólares, seguido por Brasil (187.5 millones de dólares) e Indonesia (156.1 millones de dólares) (Tridge, 2022b), donde el principal destino es nuevamente Estados Unidos con un 16.7% del total equivalente a 180 millones de dólares (The Observatory of Economic Complexity (OEC), 2021) En cuanto a la comercialización de estos dos productos en la industria de bioactivos, la tendencia global del mercado de suplementos nutricionales ha mostrado un incremento constante en la última década a nivel internacional, como se aprecia en el gráfico de la Figura 7, para el mercado de los Estados Unidos de América, sobrepasando los 11 mil millones de dólares americanos en el 2020, habiendo duplicado las cifras del 2012 (Smith et al., 2021). 13 Figura 7. Ventas totales de suplementos nutricionales en los Estados Unidos de América entre 2012 y 2020. Fuente: Smith et al., (2021). En este contexto, la base de datos del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (NIH por sus siglas en inglés) compila la información para los registros de productos comerciales de suplementos nutricionales, donde los gráficos de la Figura 8 muestran el número de productos registrados de chile picante y pimienta negra en años recientes. 0 2 4 6 8 10 12 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 V en ta s to ta le s en b ill o n es d e U SD Año 14 a) b) Figura 8. Número total de suplementos nutricionales comerciales registrados en los Estados Unidos de América que contienen (a) chile picante, o (b) pimienta negra. Fuente: National Institutes of Health (NIH), 2022. Como se puede observar, los suplementos nutricionales conteniendo ambos productos han presentado una tendencia creciente, llegando a sobrepasar los 4 mil productos inscritos en el caso de Capsicum spp y los 5 mil productos registrados en el caso de la pimienta negra, remarcando que, en ambos casos, esta cifra representa el doble de los productos registrados en el 2017, dándose en los últimos años un crecimiento promedio 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 To ta l d e p ro d u ct o s Año 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 To ta l d e p ro d u ct o s Año 15 de 25% anual. Por último, cabe mencionar que estos representan el 7.1% del total del mercado estadounidense (National Institutes of Health (NIH), 2022). Lo aquí expuesto, permite apreciar la importancia de ambos productos en el comercio internacional, tanto en su comercialización como producto fresco y seco para la industria alimentaria como en nichos de mercado especializados por su potencial bioactivo, tal como en el sector de los suplementos nutricionales. En cuanto a Costa Rica, el chile picante tiene una producción a nivel nacional de poco más de 3500 toneladas métricas (ton) anuales (Barrientos & Chaves, 2008), de las cuales la fracción que se exporta se hace en forma de salsas mayoritariamente, y genera ingresos por $55 millones en siete meses (PROCOMER, 2015a). Para la especie C. annuum, sin distinción entre las variedades dulces y picantes, se reporta un área de producción de 1085 hectáreas (ha) agrupadas en Alajuela y Cartago principalmente (Instituto Nacional de Estadística y Censos, 2015). Para la pimienta, la producción es cercana a las 1000 ton, provenientes en su mayoría de Sarapiquí y San Carlos (Barrientos & Chaves, 2008), que cubren más del 95% del cultivo nacional cuya extensión se estima en 380 ha (Instituto Nacional de Estadística y Censos, 2015) y genera ingresos por exportación de $1500 millones (PROCOMER, 2015b). Por otro lado, los estudios de estas especias en Costa Rica no ahondan en la caracterización fitoquímica ni la cuantificación de sus componentes, importantes por cuanto los metabolitos se constituyen como buenos descriptores no sólo de la calidad y el valor nutricional del producto, sino también de su valor comercial y la aplicabilidad en otros campos. Como se ha mencionado, el potencial de los metabolitos bioactivos que ha incidido en el incremento de la comercialización de suplementos nutricionales a nivel internacional, ha conllevado también en el país a que la Promotora del Comercio Exterior (PROCOMER) promocione el potencial de productos costarricenses para su introducción en cadenas de valor en el ámbito internacional. 16 Entre estos, PROCOMER incluyó al chile picante en la Feria EXPOCOMER 2018 en Panamá (PROCOMER, 2018), mientras que la pimienta fue promocionada en la Feria FRUITLOGISTICA 2019 en Alemania (PROCOMER, 2019), así como en la Red Iberoamericana de Entidades de Promoción de Exportaciones y Atracción de Inversiones (REDIBERO) con compradores de países europeos, tales como Alemania, España, Francia, Italia y Polonia en marzo del 2021 (PROCOMER, 2021). Los diferentes aspectos descritos en la Introducción muestran la relevancia del estudio fitoquímico de los frutos de chile picante y pimienta negra costarricense, tanto por la importancia del conocimiento científico como por la realimentación de la información con los productores en cuanto a los metabolitos secundarios con sus potenciales bioactividades, que permitan favorecer la comercialización de los mismos en segmentos de mercado especializados, incluyendo productos elaborados de mayor valor agregado, como es el de los suplementos nutricionales. Con esto en cuenta, el objetivo del presente trabajo corresponde al estudio de la composición de los metabolitos secundarios y la actividad antioxidante para las especies Capsicum annuum y Piper nigrum cultivadas en Costa Rica. 17 CAPÍTULO II. MATERIALES Y METODOS 2.1 Equipo, Materiales y Reactivos Los equipos utilizados fueron los siguientes: • Baño Ultrasónico: Branson 5510. • Bomba de vacío Vacuumbrand PC 520 NT. • Cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC) Agilent Infinity1260 con bomba cuaternaria y detector de arreglo de diodos (DAD). • Cromatógrafo líquido de ultra alta resolución (UHPLC) Dionex Ultimate 3000 con bomba cuaternaria, automuestreador, horno de columna y detector de arreglo de diodos DAD, acoplado a un espectrómetro de masas de cuadrupolo simple Thermo Scientific MSQ Plus. • Cromatógrafo líquido de ultra alta resolución (UHPLC) Thermo Scientific Accela con bomba binaria y detector DAD, acoplado a un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap XL. • Cromatógrafo líquido de ultra alta resolución (UPLC) Waters Aquity H Class con bomba cuaternaria acoplado a espectrómetro de masas de alta resolución Xevo G2-XS QTOF. • Equipo de cromatografía de capa delgada de alta resolución (HPTLC) CAMAG con automuestreador ATS 4, cámara automática ADC 2, calentador TLC Plate Heater 3, Derivatizer, TLC Visualizer 2 y TLC Scanner 4. • Espectrofotómetro ultravioleta-visible Thermo Scientific Genesys 10S UV-VIS. • Extractor líquido presurizado Dionex ASE 150. • Fluorómetro Thermo Scientific Fluoroskan Ascent. • Liofilizador Labconco Free Zone Cascade Benchtop. • Rotavapor Büchi R-210 con baño regulador de temperatura Büchi B-491. • Unidad de Resonancia Magnética Nuclear Bruker 400 MHz. 18 En cuanto a materiales y reactivos, se listan a continuación: • Columna HPLC semipreparativa Synergi Polar-RP (150 x 10 mm, 4 μm). • Columnas HPLC analíticas: Phenomenex Luna C18(2) (150 x 4.6 mm, 5 μm), Phenomenex Synergi Polar-RP (150 x 4.6 mm, 4 μm), Thermo FisherScientific Hypersil Gold AQ C18 (200 x 2.1 mm, 1.9 μm). • Cromatofolios TLC (20 x 20 cm) Merck, gel silice 60 F254. • Placas de vidrio para HPTLC Merck Si 60 F254 20x10 cm. • Gel de sílice para cromatografía en columna Sigma Aldrich 70-230 mesh. • Como estándares se utilizan ácido gálico, borneol y piperina (97%) de Sigma-Aldrich, y capsaicina (94.1%) de USP. • Hidróxido de sodio de Riedel-de Haën. • Carbonato de sodio, fluoresceína de sodio, Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílico, AAPH (diclorhidrato de 2,2'-azobis-2-metil- propanimidamida), y DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) son de Sigma-Aldrich. • Sulfato de litio monohidratado de J. T. Baker. • Tierra de diatomeas Thermo Scientific para ASE. • Los disolventes deuterados, metanol-d4 y cloroformo-d, son Sigma-Aldrich. • Los disolventes metanol, acetonitrilo, cloroformo, diclorometano, acetato de etilo, hexano, acetona y ciclohexano; así como el ácido fórmico, áclorhídrico concentrado y ácido fosfórico concentrado; son Sigma-Aldrich, Merck, J. T. Baker o Honeywell. 19 2.2 Metodología Las extracciones de las muestras, separaciones y aislamiento de compuestos, los análisis cuantitativos y los análisis de actividad antioxidante fueron realizados en el laboratorio BioDESS de la Escuela de Química, Universidad de Costa Rica (San José, Costa Rica). El análisis de amidas por UHPLC-HRMS se realizó en el Centro de Investigación y de Servicios Químicos y Microbiológicos del Instituto Tecnológico de Costa Rica (Cartago, Costa Rica). El análsis de polifenoles por UHPLC-HRMS fue realizada en el Methods and Application of Food Composition Laboratory del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (Maryland, Estados Unidos). Los análisis por HPTLC fueron realizados en el laboratorio de CAMAG (Basel, Suiza). 2.2.1 Características y procesamiento de las muestras Las muestras de chile picante (Capsicum annuum) y pimienta negra (Piper nigrum) fueron obtenidas con la colaboración del Ing. Luis Fernando Mora, Gerente de PROPICA, empresa líder en la comercialización y exportación de chile y pimienta costarricense. Se recolectó 1 kg de cada muestra en la empresa PROPICA ubicada en La Tigra de San Carlos, en marzo del 2016, las cuales tenían las características mostradas en el Cuadro I. Las muestras fueron facilitadas en bolsas con cierre hermético, y provenían de los respectivos lotes de producción, de manera que correspondían a productos aptos para la comercialización. 20 Cuadro I. Descripción de las muestras de C. annuum y P. nigrum obtenidas de PROPICA. Muestra Origen Mes de cosecha Código asignado Chile La Fortuna, San Carlos Marzo 2016 Cahfo Chile Pueblo Nuevo, Sarapiquí Marzo 2016 Cahpn Chile Valle Azul, San Ramon Marzo 2016 Cahva Pimienta La Tigra, San Carlos Diciembre 2015 Pnidi Pimienta La Tigra, San Carlos Enero 2016 Pnien Pimienta La Tigra, San Carlos Febrero 2016 Pnife Las muestras de pimienta se recibieron secas y se guardaron debidamente rotuladas y en bolsas de congelar con cierre hermético a una temperatura de -20 °C. Las muestras de chile se recibieron frescas, habiéndose cosechado en su punto de madurez para comercialización. Se procedió a picar en trozos pequeños y congelar a -20 °C, para su posterior liofilización en un equipo Labconco Free Zone Cascade Benchtop, con capacidad de 4.5 L, colector con temperatura de -105 °C sistema de vacío < 133 x 10-3 mbar. El material liofilizado se obtuvo con rendimientos de 10.7%, 10.2% y 10.4% para las muestras Cahfo, Chapn y Cahva respetivamente. El material liofilizado fue preservado en bolsas de congelar con cierre hermético a una temperatura de -20 °C. 21 2.2.2 Proceso de extracción para obtención de amidas La extracción de las amidas en Capsicum spp. se realizó con extracción líquida presurizada (PLE por sus siglas en inglés) a 1500 psi de presión, a partir del material seco y molido. Se utilizó primero un diseño factorial de 23, es decir de 3 factores y 2 niveles, en la muestra Cahfo, a saber: disolventes metanol o acetona, temperatura de 65 °C o 90 °C, y 15 min de extracción distribuidos en 3 ciclos de 5 min o 5 ciclos de 3 min (Chanthai et al., 2012; Thomas et al., 1998). Las 3 muestras, Cahfo, Cahpn y Cahva, fueron extraídas con las condiciones óptimas derivadas del diseño factorial, correspondientes a metanol a 90 °C y 3 ciclos de extracción de 5 min cada uno. Posteriormente se purificó el extracto añadiendo 1 volumen de agua y evaporando el metanol en el rotavapor, la fase acuosa se extrajo con cloroformo y se conservó la fase orgánica, que luego se lleva a sequedad en el rotavapor. En Piper nigrum, la extracción por PLE parte del material molido. El diseño factorial 23 de 3 factores y 2 niveles se realiza con la muestra Pnien, y las condiciones utilizadas corresponden a metanol o acetato de etilo como disolventes, la temperatura en 25 °C o 70 °C, y 30 min totales de extracción distribuidos en 2 ciclos de 15 min o 5 ciclos de 6 min (Lee et al., 2010; Scott et al., 2005). Las mejores condiciones se aplicaron a las 3 muestras: Pnidi, Pnien y Pnife, las cuales corresponden a la extracción con acetato de etilo a 25 °C en 5 ciclos de 6 min cada uno. A estos extractos se les realizó 3 lavados con agua destilada, y la fase orgánica se rotavaporó a sequedad. 22 2.2.3 Caracterización de los extractos de amidas a través de UHPLC-HRMS Tanto en las muestras de chile y como de pimienta, las mediciones fueron realizadas utilizando un equipo UPLC-Q-TOF Waters con cromatógrafo Aquity H Class acoplado al detector Xevo G2-XS QTOF. La ionización química se realizó con el voltaje del capilar en 2 kV, cono de entrada a 20 eV, temperatura de la fuente a 150 °C, temperatura de desolvatación en 450 °C, flujo de gas en el cono en 0 L/h y el flujo de desolvatación en 900 L/h. La detección se realizó en modo positivo en el rango 100-1000 m/z, con tasa de escaneo de 0.5 s y fragmentación en modo de Adquisición Independiente de Datos (IDA por sus siglas en inglés) con rampa de energía de colisión de 20 V a 30 V. La calibración del equipo se realizó en el rango de masa con formiato de sodio, y se utilizó encefalina leucina como referencia interna medida cada 30 s durante la cromatografía. Los resultados fueron procesados en el programa MassLynx V4.2 de Waters. 1 µL de la muestra a 10 mg/mL de concentración se inyectó en una columna Phenomenex Luna C18(2) (150 x 4.6 mm, 5 μm) a 30°C, realizando la elución con agua y ácido fórmico al 0.1% (solvente A), metanol con ácido fórmico al 0.1% (solvente B) y acetonitrilo con ácido fórmico al 0.1% (solvente C) a un flujo de 0.5 mL/min. Para C. spp. se utilizó un gradiente que inicia con 56% B durante 5 min, incrementa hasta 100% durante 15 min y se mantiene constante por 8 min. En el caso de P. nigrum, el gradiente inicia con 40% C e incrementa hasta 100% C a los 30 min, manteniéndose constante por 7 min. 2.2.4 Cuantificación de las amidas por UHPLC-DAD El análisis por UHPLC-DAD se realizó con un equipo Dionex Ultimate 3000 con detector de arreglo de diodos acoplado a un espectrómetro de masas Thermo Scientific MSQ Plus. En C. annuum. la ionización química se realizó en modo positivo con el capilar a 600 °C y 3 KV de voltaje, 80 V de voltaje en el cono y nitrógeno a 75 psi de presión. La detección se realizó en el rango 100-400 m/z con tiempo de escaneo de 0.30 s. Se inyectan 10 μL de la muestra a 10 23 mg/mL en una columna Phenomenex Synergi Polar-RP (150 x 4.6 mm, 4 μm), eluyendo a 1.0 mL/min con agua y ácido fórmico 0.1% (A), y metanol con ácido fórmico 0.1% (B), en un gradiente que inicia con 66% B, incrementa a 70% B en 5 min y luego hasta 100% B en 6 min, donde se mantiene constante por 4 min. Los picos se identifican según su masa nominal [M+H]+, y se integran a 280 nm. La curva de calibración con capsaicina (USP, 94.1%) se realizó con el mismo método anterior, con concentraciones en el rango 5-1900 ppm. Se integraron las áreas de la capsaicina a 280 nm y se graficaron respecto a la concentración, con lo que se obtuvo la ecuación de interpolación Y = 3.6x104 + 5153 * X (LD = 38 ppm y LC = 127 ppm). De los patrones anteriores se extrae un set de datos en el rango 10-50 ppm, con el que se obtiene una nueva ecuación Y = 2.7x103 + 6.30x103 * X (LD = 7 ppm y LQ = 24 ppm) que se utiliza en los picos con menor área. Para P. nigrum, la detección en el espectrómetro de masas se realizó en modo positivo con el voltaje de cono en 80 V, el capilar a 500 °C y 3 kV de voltaje, y el gas nitrógeno a 75 psi. La detección se realiza en el rango 100-500 m/z, con 0.50 s de tiempo de escaneo. 10 μL de la muestra, en concentración 10 mg/mL, se inyectan en una columna Phenomenex Synergi Polar- RP (4.6 x 150 mm, 4 μm) y se eluye a 0.8 mL/min con agua y ácido fórmico 0.1% (A), y acetonitrilo con ácido fórmico 0.1% (B), aplicando un gradiente de 40% B a 70% B en 17 min, hasta 100% B en 7 min y constante por 3 min adicionales. La masa nominal del ion molecular [M+H]+ permite identificar los picos, que luego se integran a 260 nm o 340 nm en el caso de que posean un máximo de absorbancia a esta última longitud de onda. La cuantificación se realizó por interpolación en una curva de piperina (Sigma-Aldrich, 97%) realizada en el rango 10-1000 ppm utilizando el mismo método que las muestras de P. nigrum. Se integró del área a 340 nm y a 260 nm, y se graficó contra la concentración de piperina. La piperilina, piperina, piperlongumina y piperetina tienen un máximo de absorbancia a 340 nm, por lo que se interpolan sus áreas en la curva de piperina a 340 nm con ecuación Y = 1.25x105 + 4.213x104 * X (LD = 18 ppm, LC = 58 ppm); mientras los demás compuestos identificados se cuantifican por interpolación en la curva de piperina obtenida a 260 nm con ecuación Y = -2.10x105 + 1.687x104 * X (LD = 42 ppm, LC = 140 ppm). 24 2.2.5 Análisis de perfil de compuestos de pimienta por HPTLC Se realizó la extracción de las muestras Pnidi y Pnien según lo indicado en el método estandarizado por el Atlas Internacional para la Identificación de Medicamentos Herbales (HPTLC Association, 2018). A saber, se preparó una disolución 100 mg/mL de la muestra seca y molida en metanol, se colocó en ultrasonido por 10 min y se centrifugó para obtener el sobrenadante. 7 μL de la disolución se aplican sobre placas de cromatografía de capa delgada de alta resolución (HPTLC por sus siglas en inglés) Si 60 F254 20x10 cm (Merck Millipore) en una banda de 8.0 mm de longitud a 20 mm del borde inferior. Como referencia se utilizan 3 μL de piperina 0.9 mg/mL y 3 μL de borneol 0.2 mg/mL. La elución se realizó con 20 mL de ciclohexano: acetato de etilo 5:3 en una cámara saturada por 20 min y 33% de humedad, dejando subir el solvente hasta 70 mm desde el borde inferior. La placa fue derivatizada por nebulización con disolución de anisaldehído, preparada a partir de 85 mL de metanol, 10 mL de ácido acético glacial, 5 mL de ácido sulfúrico concentrado y 0.5 mL de anisaldehído. Posterior a la nebulización, se calentó a 100 °C por 3 min. El revelado de la placa se realizó con luz blanca, 254 nm y 366 nm previo a la derivatización, y posterior a la misma se reveló con luz blanca y 366 nm. Para la cuantificación de piperina, se utilizó el extracto obtenido previamente en dilución 1:20, y se preparó una curva de piperina de 0.05-0.25 mg/mL, con aplicación de 2 μL tanto de la muestra como de los estándares. El pico de piperina a Rf = 0.16 se integra por perfil de pico en luz de 254 nm, y por densitometría a 330 nm, y se cuantifica por interpolación en la curva de piperina. 25 2.2.6 Purificación y aislamiento de amidas 2.2.6.1 Cromatografía semipreparativa de amidas de chile 30 g de Cahva se extrajeron siguiendo el método descrito en la sección 2.2.2. El extracto seco se redisolvió en metanol para obtener una concentración de 300 mg/mL. La disolución se separó por HPLC semipreparativo utilizando un equipo Agilent Infinity1260 con bomba cuaternaria y detector DAD, utilizando una columna Phenomenex Synergi Polar-RP 80A (150 x 10 mm, 4 μm) y flujo de 4.5 mL/min que utiliza agua (A) y metanol (B) en un gradiente de 66% B en 0-3 min, 50% a los 5 min que se mantiene constante hasta los 6.5 min, 66% B a los 8 min y constante hasta los 13 min, 100% B a los 14 min y constante hasta los 18 min. La recolección de las fracciones se realizó manualmente según el cromatograma DAD, separando los picos con las áreas más significativas. Posteriormente las fracciones recolectadas se caracterizaron por UHPLC-DAD-MS con el método descrito en la sección 2.2.4, y se complementó con análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) con experimentos de 1H y 13C medidos en cloroformo deuterado (CDCl3), obtenidos en un equipo Bruker de 400 MHz. 2.2.6.2 Obtención de piperina Se extrajeron 14.65 g de la muestra Pnien con el mismo procedimiento descrito en la sección 2.2.2. El extracto seco obtenido se recristalizó disolviendo primero en éter etílico frío y evaporando a sequedad en el rotavapor a 20 °C, posteriormente se adicionan 3 mL de éter etílico frío y se agita en baño de hielo (Shingate et al., 2013). El sólido remanente se separa por filtración, y se comprueba que está enriquecido con piperina mediante cromatografía de capa delgada (TLC por sus siglas en inglés) con placas de sílica gel 60 con indicador F254 (Merck Millipore), eluyendo con hexano: acetona 2:3. El sólido anterior se sometió a una purificación posterior por cromatografía de columna (25 x 2.5 cm), preparada con sílica gel 60 Å 70-230 mesh (Sigma-Aldrich), aplicando la muestra 26 en una cabeza de columna, y eluyendo con un gradiente que incluye 2 volúmenes de hexano: acetona 2:1, 1 volumen de hexano acetona 1:1, 4 volúmenes de hexano: acetona 2:3, 2 volúmenes de hexano: acetona 1:4 y finalmente 2 volúmenes de acetona pura. Se recogieron fracciones de 10 mL, y se analizaron por TLC con las mismas condiciones descritas anteriormente. Las fracciones 10-14 presentaron una mancha correspondiente a la piperina, por lo que se unieron y se llevaron a sequedad en el rotavapor. La piperina purificada se analizó por 1H-RMN y 13C-RMN medidos en un equipo Bruker de 400 MHz, con metanol deuterado (CD3OD) como disolvente. 2.2.6.3 Cromatografía semipreparativa y obtención de la guineensina Se extrajeron 20 g de la muestra Pnien con el mismo procedimiento de extracción descrito para las piperamidas en la sección 2.2.2. Se obtuvieron 1.7028 g de extracto seco, del cual se redisolvió 1.00 g en metanol para obtener una concentración de 100 mg/mL. La disolución se separó por HPLC semipreparativo utilizando un equipo Agilent Infinity1260 con columna Phenomenex Synergi Polar-RP 80A (150 x 10 mm, 4 μm), eluyendo con flujo de 3.8 mL/min y un gradiente de agua (A) y acetonitrilo (B) que inicia con 50% B, incrementa a 62.4% B a los 7 min, 70% B a los 13 min y 80% B a los 20 min. La recolección de las fracciones se realizó manualmente según el cromatograma DAD, separando el pico correspondiente a guineensina y otros picos de con área semejante. La identificación de la guineensina y las demás fracciones se realizó con UHPLC-DAD-MS con el método descrito en la sección 2.2.4, y se complementó con 1H-RMN y 13C-RMN medidos en un equipo Bruker de 400 MHz, medidos en CDCl3. 2.2.7 Proceso de extracción para obtención de polifenoles Para las muestras de chile, se realizó un primer procedimiento de extracción (Extr-C-1), que consiste en colocar el material seco y molido con acetona 80% en proporción 1:6 y dejar 27 por 30 min en ultrasonido. La mezcla se filtró y el residuo se extrajo con hidróxido de sodio 4 mol/L en proporción 1:4 con agitación por 1 h. El extracto básico se separó y acidificó con ácido clorhídrico concentrado hasta pH 2, para luego extraer con acetato de etilo (Oboh & Rocha, 2007). Otros procedimientos de extracción (Extr-C-2, Extr-C-3) se realizaron utilizando el método de extracción liquida presurizada (PLE por sus siglas en inglés), partiendo del material seco molido y extrayendo con metanol: agua 8:2 (Extr-C-2) o metanol puro (Extr-C-3) con una presión de 1500 psi, 40°C de temperatura y 5 ciclos de 5 min de tiempo estático cada uno para un total de 25 min de tiempo total de extracción (Alvarez-Parrilla et al., 2011; Castro-Concha et al., 2014). Se repitieron las condiciones de Extr-C-3 pero variando la temperatura de extracción a 80 °C para obtener el extracto Extr-C-4 (Shan et al., 2005). Un quinto proceso de extracción (Extr-C-5) se realizó manteniendo las condiciones de Extr-C-3 pero con un proceso de purificación que consiste en la adición de 1 volumen de agua al extracto metanólico, la evaporación del metanol en el rotavapor y el posterior lavado de la fase acuosa con éter etílico (Jeong et al., 2011). En cuanto a las muestras de pimienta, en el primer procedimiento de extracción se utilizó el material molido en metanol: agua 8:2 con ultrasonido por 30 min. El extracto obtenido se colocó en el rotavapor para eliminar el metanol, y la fase acuosa resultante se extrajo con acetato de etilo y posteriormente con n-butanol. Este último extracto se llevó a sequedad en el rotavapor para obtener el extracto Extr-P-1 (Bandyopadhyay et al., 1990; Chatterjee et al., 2007). Luego se realizaron extracciones en PLE a 1500 psi y 40 °C, P-2, P-3, P-4 y P-5 variando el número de ciclos y el tiempo estático de cada uno para completar 30 min de tiempo total de extracción. El extracto Extr-P-2 se realizó con metanol: agua 8:2 y 2 ciclos de 15 min, mientras en el extracto Extr-P-3 se utilizó el mismo solvente, pero 5 ciclos de 6 min. En el extracto Extr- P-4 se cambió el disolvente a acetona: agua 1:1, manteniendo la extracción en 2 ciclos de 15 min. Un extracto adicional (Extr-P-5) se obtuvo también con acetona: agua 1:1, pero con 5 ciclos de 6 min (L. Su et al., 2007a). 28 Finalmente se realizó el procedimiento de Extr-P-6 con una extracción previa en PLE con hexano a 40 °C, 2 ciclos de 5 min, seguido de la extracción con las condiciones de Extr-P-5 pero aumentando la temperatura a 70 °C. El extracto obtenido se rotavaporó para eliminar la acetona y la fase acuosa se lavó con éter etílico. La fase acuosa se llevó a sequedad en el rotavapor (Giraldo Aricapa, 2012). 2.2.8 Caracterización de los extractos de polifenoles a través de UHPLC-HRMS Las muestras, tanto de C. annuum. como de P. nigrum, fueron analizadas utilizando un sistema cromatográfico Thermo Scientific Accela con bomba binaria y detector DAD, acoplado a un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap XL. 1 μL de la muestra se separa en una columna Thermo FisherScientific Hypersil Gold AQ C18 (200 x 2.1 mm, 1.9 μm) con flujo de 0.3 mL/min. Los disolventes utilizados corresponden a agua con ácido fórmico 0.1% (A) y acetonitrilo con ácido fórmico 0.1% (B), en gradiente de 4% B a 20% B en 20 min, hasta 35% B en 10 min, aumenta a 100% B en 1 min y se mantiene constante por 4 min adicionales. La ionización química se realizó en modo negativo, con el voltaje de nebulización en 4.8 kV, el capilar a 300 °C y 15 V, y el lente a 70 V. El rango de masa utilizado fue 100-2000 uma con intervalo de escaneo de 0.50 s. Se utilizó análisis dependiente de datos (DDA por sus siglas en inglés) para obtener la fragmentación MS2 a MS5 a partir del ion más abundante. 2.2.9 Determinación de polifenoles totales por el método Folin-Ciocalteu El reactivo Folin-Ciocalteu se preparó siguiendo una adaptación del método descrito previamente (Slinkard & Singleton, 1977). El análisis se llevó a cabo con 0.500 mL del extracto obtenido en el punto 2.2.8 y redisuelto en metanol, 0.500 mL del reactivo Folin-Ciocalteu y 10.00 mL de disolución de carbonato de sodio 7.5%, aforando a 25.00 mL con agua destilada. Se dejó en reposo por 1 h en oscuridad, y se midió la absorbancia a 750 nm contra un blanco. 29 Los resultados fueron interpolados en una curva de ácido gálico preparada en el rango 50-700 ppm, y se expresan como mg ácido gálico equivalente (AGE)/g de muestra. 2.2.10 Análisis de actividad antioxidante con el método de DPPH Se realizó según un método desarrollado en el laboratorio, en el que se adicionó una alícuota de 1.00 mL del extracto polifenólico (2.2.8) a diferentes concentraciones en balones aforados de 5.00 mL, se añadieron 2.00 mL de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) 0.25 mmol/L, se aforó con metanol y se incubó en la oscuridad por 30 min. Posteriormente se midió la absorbancia a 517 nm, y se calculaó el porcentaje de inhibición de la muestra respecto a la absorbancia obtenida por el blanco. Para calcular la concentración inhibitoria media (IC50) se graficó el porcentaje de inhibición contra la concentración final de la muestra, y se calculó la concentración a la que se obtiene el 50% de inhibición. 2.2.11 Análisis de actividad antioxidante con el método ORAC El análisis de capacidad de absorbancia de radicales oxígeno (ORAC por sus siglas en inglés) sigue el procedimiento adaptado a partir de (Dávalos et al., 2004). En una placa para fluorescencia de 96 pocillos se colocó el extracto polifenólico (2.2.8) en diferentes concentraciones o Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico) 1-8 μmol/L, con fluoresceína de sodio (concentración final 70 nmol/L). La mezcla se incubó por 15 min a 37 °C, y posteriormente se adicionó AAPH (diclorhidrato de 2,2'-azobis-2-metil-propanimidamida, concentración final 12 mmol/L). Todas las disoluciones se prepararon en buffer de fosfato 75 mmol/L (pH = 7.4). Se midió la fluorescencia cada minuto por 80 min, utilizando un fluorómetro Thermo Scientific Ascent Fluoroskan con filtro de excitación a 480 nm y filtro de emisión a 520 nm. Se graficó el área bajo la curva contra la concentración de muestra o Trolox y se obtuvo la ecuación de regresión lineal. Los resultados se expresan como mmol Trolox equivalente (TE)/g 30 de extracto, obtenido al dividir la pendiente de la ecuación de la muestra entre la pendiente de la ecuación del Trolox. 2.2.12 Análisis estadístico Los análisis de varianza (ANOVA por sus siglas en inglés) unidireccional seguidos de un Tukey post-hoc test y los de correlaciones de Pearson fueron realizados utilizando el programa Minitab versión 20.4 (64-bit). 31 CAPÍTULO III. RESULTADOS 3.1 Extracción de amidas de chile y pimienta Luego del procedimiento realizado con el diseño factorial para la extracción de amidas de chile, descrito en la sección 2.2.2 de la metodología, utilizando un equipo Dionex de extracción liquida presurizada (PLE por sus siglas en ingles), se determinó la eficiencia de la extracción a través de la cuantificación de la amida principal capsaicina por UPLC-DAD, con base en la curva de calibración elaborada según lo descrito en dicha sección e ilustrada en la Figura 9. Figura 9. Curva de calibración de la capsaicina a través de cuantificación por UPLC-DAD a 282 nm. De esta forma, las amidas se cuantificaron contra una curva de calibración lineal de capsaicina elaborada en el rango de 10-1900 ppm, con la ecuación Y = 3.6*104 + 5 153*X, con límite de detección (LD) para la interpolación de 38 ppm, y límite de cuantificación (LC) de 127 ppm. y = 5153.1x + 35988 R² = 0.9995 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 0 500 1000 1500 2000 Á re a Concentración (ppm) 32 Este diseño factorial con la utilización de PLE fue desarrollado con base en condiciones aplicadas previamente para la extracción de capsaicina de productos alimentarios (Chanthai et al., 2012; Thomas et al., 1998). Los factores que se consideraron incluían dos diferentes condiciones de temperatura (65 y 90 °C), dos diferentes solventes (acetona y metanol), y utilizando 3 y 5 ciclos de extracción con tiempos estáticos de 5 y 3 min respectivamente, de forma a completar un total de 15 minutos de tiempo de extracción en cada experimento. Los resultados obtenidos se resumen en el Cuadro II. Cuadro II. Condiciones y resultados de las extracciones de amidas en el diseño factorial de C. annuum. Extracción Condiciones Masa muestra seca (g) Capsaicina (mg/g seca) Cahfo-dfc-1 MeOH, 90°C 5 ciclos x 3 min 1.0082 1.83 Cahfo-dfc-2 MeOH, 65°C 5 ciclos x 3 min 0.9999 1.58 Cahfo-dfc-3 Acetona, 65°C 5 ciclos x 3 min 1.0009 0.71 Cahfo-dfc-4 Acetona, 90°C 5 ciclos x 3 min 1.0111 1.54 Cahfo-dfc-5 MeOH, 65°C 3 ciclos x 5 min 1.0014 1.26 Cahfo-dfc-6 Acetona, 65°C 3 ciclos x 5 min 1.0006 1.12 Cahfo-dfc-7 MeOH, 90°C 3 ciclos x 5 min 1.0130 1.91 Cahfo-dfc-8 Acetona, 90°C 3 ciclos x 5 min 1.0023 1.26 33 De forma similar, en el diseño factorial de P. nigrum (sección 2.2.2) se determinó la eficiencia de la extracción a través de la cuantificación de la amida principal piperina utilizando el método UPLC-DAD descrito en la sección 2.2.4, y con base en la curva de calibración elaborada e ilustrada en la Figura 10. Figura 10. Curvas de calibración de la piperina a través de cuantificación por UPLC-DAD, a 280 nm (⚫) y 340 nm (). Para la piperilina, piperina, piperlongumina y piperetina, se realiza la cuantificación a 340 nm con una curva de piperina con ecuación Y = 1.25*105 + 4.213*104 * X, cuyos valores de LD y LC son, respectivamente, 18 ppm y 58 ppm. Para los demás compuestos, la cuantificación se realizó a 260 nm con una curva de piperina de ecuación Y = -2.10*105 + 1.687*104 * X, con valores LD de 42 ppm y LC de 140 ppm. En este caso también el diseño factorial con la utilización de PLE fue desarrollado con base en condiciones aplicadas previamente para la extracción de piperina de productos alimentarios (Lee et al., 2010; Scott et al., 2005). Los factores que se consideraron incluían dos diferentes condiciones de temperatura (25 y 70 °C), dos diferentes solventes (acetato de etilo y y = 16866x - 209573 R² = 0.9988 y = 42135x + 124531 R² = 0.9993 0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 0 200 400 600 800 1000 1200 Á re a Concentración (ppm) 34 metanol), y la utilización de 2 y 5 ciclos de extracción con tiempos estáticos de 15 y 6 min respectivamente, de forma a completar un total de 30 minutos de tiempo de extracción en cada experimento. Los resultados obtenidos se resumen en el Cuadro III. Cuadro III. Condiciones y resultados de las extracciones de amidas en el diseño factorial de P. nigrum. Extracción Condiciones Masa muestra seca (g) Piperina (mg/100 g) Pnien-dfp-1 MeOH, 25°C 2 cycles x 15 min 2.0009 173.9 Pnien-dfp-2 MeOH, 70°C 5 cycles x 6 min 1.9999 1878.5 Pnien-dfp-3 MeOH, 25°C 5 cycles x 6 min 2.0000 897.8 Pnien-dfp-4 AcOEt, 25°C 2 cycles x 15 min 2.0001 1653.3 Pnien-dfp-5 MeOH, 70°C 2 cycles x 15 min 2.0002 872.9 Pnien-dfp-6 AcOEt, 70°C 5 cycles x 6 min 1.9998 1887.6 Pnien-dfp-7 AcOEt, 70°C 2 cycles x 15 min 2.0000 516.6 Pnien-dfp-8 AcOEt, 25°C 5 cycles x 6 min 2.0000 1063.4 3.2 Caracterización de amidas de chile y pimienta El análisis de los cromatogramas y espectros de masas obtenidos para los extractos de chile según el proceso de UPLC-QTOF-ESI MS descrito en la sección 2.2.3 de la metodología, 35 permitió la identificación de las doce amidas cuya información se resumen en el Cuadro IV y los cromatogramas se encuentran en la Figura 11. a) b) c) Figura 11. Cromatograma de extracción de iones (XIC) del análisis UPLC-Q-TOF para los picos: a) 1, 2, 4, 5 y 7; b) 3, 6 y 8; c) 9, 10, 11 y 12, del extracto de C. annuum. Cahfo-1-chcl3 Time 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 % 0 100 Cahfo-1-chcl3 Time 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 % 0 100 Cahfo-1-chcl3 Time 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 % 0 100 3 6 8 9 10 11 12 1 2 4 7 5 36 Cuadro IV. Identificación de amidas en C. annuum por UHPLC-Q-TOF. N° Identificación tR (min) [M+H]+ Fórmula molecular Error (ppm) MS2 1 Nornorcapsaicina 12.82 278.1759 C16H24NO3 1.01 137 2 Nornordihidrocapsaicina 13.94 280.1936 C16H26NO3 8.32 177, 137, 145, 122 3 Norcapsaicina 14.22 292.1906 C17H26NO3 -2.29 137 4 Nordihidrocapsaicina 15.04 294.2092 C17H28NO3 7.75 201, 137, 122 5 Capsaicina 15.20 306.2093 C18H28NO3 7.78 182, 171, 153, 137, 122 6 Homocapsaicina I/II 16.20 320.2231 C19H30NO3 1.66 184, 137 7 Dihidrocapsaicina 16.25 308.2255 C18H30NO3 9.51 184, 172, 137, 122 8 Homodihidrocapsaicina I/II 16.97 322.2371 C19H32NO3 -3.47 198, 186, 137 9 9-octadecenamida (oleamida) 19.05 282.2805 C18H36NO 2.87 265, 263, 247, 201, 179, 133 10 Capsiamida 20.22 270.2822 C17H36NO 9.29 177, 137, 145, 122 11 Octadecanamida 20.98 284.2957 C18H38NO 1.27 137 12 13-docosenamida 22.76 338.3461 C22H44NO 9.26 321, 313, 303, 289, 179 37 Por otro lado, el análisis de los cromatogramas y espectros de masas obtenidos para los extractos de pimienta según el proceso de UPLC-QTOF-ESI MS descrito en la sección 2.2.3 de la metodología, permitió la identificación de las 31 amidas mostradas en los cromatogramas de la Figura 12, cuya información se resumen en el Cuadro V. a) b) c) d) Figura 12. Cromatograma de extracción de iones XIC del análisis UPLC-Q-TOF de extractos de P. nigrum, separado en grupos (a-d) para facilitar su visualización. Pnife-1-chcl3 Time 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 % 0 100 Pnife-1-chcl3 Time 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 % 0 100 Pnife-1-chcl3 Time 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 % 0 100 5 1 3 10 14 16 20 22 24 26 6 8 12 13 15 17 18 23 2 4 21 25 27 28 29 30 31 7 19 9 11 38 Cuadro V. Identificación de amidas en P. nigrum por UHPLC-Q-TOF. N° Identificación tR (min) m/z [M+H]+ Aductos observados Fórmula (M+H) Error (ppm) MS2 1 Piperlonguminina 11.17 274.1420 M+H, M+Na C16H20NO3 -8.46 201, 173,135 2 Piperilina 11.33 272.1327 M+H, M+Na, 2M+Na C16H18NO3 4.81 201, 171, 159, 143, 135 3 Dihidropiperlonguminina 13.26 276.1586 M+H C16H22NO3 -4.96 173, 145, 135 4 Piperanina 14.12 288.1602 M+H, M+Na C17H22NO3 0.80 203, 201,175, 161, 152, 145, 135 5 Piperina 14.32 286.1273 M+H, M+Na, 2M+H C17H20NO3 -9.48 201, 171, 159, 143, 135, 115 6 Piperdardina 17.22 314.1794 M+H, M+Na, 2M+H C19H24NO3 2.04 227, 199, 169, 161, 141, 131, 115 7 (2E,4E,8E)-Piperamida- C9:3 17.53 326.1804 M+H, M+Na, 2M+H C20H24NO3 4.66 227, 197, 169, 141, 135, 131 8 Piperetina 18.44 312.1655 M+H, M+Na, 2M+H, 2M+Na C19H22NO3 17.72 227, 197, 169, 141 9 Retrofractamida A 18.90 328.1944 M+H, M+Na C20H26NO3 9.54 255, 227, 161, 135 10 Pipercallosina 20.07 330.2108 M+H, M+Na C20H28NO3 1.75 229, 201, 135 39 N° Identificación tR (min) m/z [M+H]+ Aductos observados Fórmula (M+H) Error (ppm) MS2 11 Pellitorina 20.17 224.2015 M+H C14H26NO 0.27 208, 168, 154 12 Dehidropipernonalina 20.65 340.1971 M+H, M+Na, 2M+H, 2M+Na C21H26NO3 7.14 255, 227, 179, 164, 161, 138, 135, 131 13 Pipernonalina 21.90 342.2122 M+H, M+Na, 2M+H C21H28NO3 5.43 229, 227, 199, 161, 135, 131 14 Retrofractamida B 22.86 356.2261 M+H, M+Na C22H30NO3 9.91 283, 255, 234, 215, 185, 173, 161, 135 15 Piperoleína B 23.45 344.2272 M+H, M+Na C21H30NO3 3.45 222, 201, 135 16 Piperchabamida D 24.13 358.2411 M+H, M+Na C22H32NO3 8.04 285, 227, 135 17 Piperundecalidina 24.97 368.2231 M+H, M+Na C23H30NO3 1.44 255, 135 18 Piperchabamida B 26.39 370.2446 M+H, M+Na C22H32NO3 8.72 285, 161, 135 19 Brachiamida A 26.54 382.2458 M+H, M+Na C24H32NO3 9.83 311, 283, 187, 161, 135, 131 20 Guineensina 26.95 384.2591 M+H, M+Na C24H34NO3 3.61 311, 283, 187, 175, 161, 135 21 Piperflaviflorina A 27.99 386.2699 M+H, M+Na C24H36NO3 0.99 313, 135 22 Piperflaviflorina B 28.35 398.2727 M+H, M+Na C25H36NO3 7.99 311, 283, 161, 135 23 Piperchabamida C 29.09 396.2575 M+H, M+Na C25H34NO3 9.16 311, 283, 161, 135 40 N° Identificación tR (min) m/z [M+H]+ Aductos observados Fórmula (M+H) Error (ppm) MS2 24 Brachistamida B 30.49 412.2857 M+H, M+Na C26H38NO3 1.29 339, 311, 175, 161, 135 25 1-(octadeca- 2E,4E,12/13Z- trienoil)pirrolidina 32.14 332.2957 M+H, M+Na C22H38NO 1.08 268, 261, 233 201, 135 26 Brachistamida D 34.75 426.3001 M+H C27H40NO3 -1.69 135 27 (2E,4E,13Z)-N-isobutil- 2,4,13- octadecatrienamida 35.18 334.3147 M+H C22H40NO 1.10 306, 278, 261, 186, 154 28 1-(octadeca- 2E,4E,12/13Z- trienoil)pirrolidina 36.20 332.2957 M+H, M+Na C22H38NO 1.08 304, 261, 233, 201, 153 29 (2E,4E)-N-isobutil-2,4- octadecadienamida 36.76 336.3070 M+H, M+Na C22H42NO -8.40 320, 280, 279, 263, 201, 172, 153 30 1-(octadeca-2E,4E,13Z- trienoil)piperidina 38.56 346.3136 M+H, M+Na C23H40NO 7.54 318, 279, 261, 201, 153 31 (2E,4E,14Z)-N-Isobutil- 2,4,14-eicosatrienamida 39.92 362.3423 M+H C24H44NO 0.03 306, 289, 154 41 3.3 Cuantificación de amidas de chile y pimienta La aplicación de las mejores condiciones del diseño factorial para la extracción de amidas de las muestras de chile, mostradas en la sección 3.1., permitió obtener los rendimientos que se resumen en el Cuadro VI, luego de seguir el procedimiento descrito en la sección 2.2.2. de la metodología. Cuadro VI. Rendimientos porcentuales obtenidos para la extracción de amidas de C. annuum con respecto a la masa de muestra seca. Muestra Masa muestra seca (g) Masa extracto (g) % rendimiento Cahfo 7.5003 0.1946 2.595 Cahpn 2.0044 0.0471 2.350 Cahva 7.5017 0.2634 3.511 Asimismo, el Cuadro VII resume los contenidos de los principales capsaicinoides en las muestras, obtenidos por HPLC-DAD según se describe en la sección 2.2.4. 42 Cuadro VII. Contenido de capsaicinoides en las muestras de C. annuum. Valores en mg Capsaicina Equivalente/100 g muestra seca. Muestra1 Compuesto Cahfo Cahpn Cahva Nordihidrocapsaicina 7.23 c ± 0.03 N.C.2 N.C. Capsaicina 174 a ± 14 161.5 a ± 13 350.9 a ± 5.7 Dihidrocapsaicina 37.8 b ± 2.3 46.5 b ± 2.6 133 b ± 10 Total 219 208 484 1Diferentes letras en los superíndices en una columna indican diferencias significativas (p<0.05) aplicando análisis ANOVA unidireccional seguido de un Tukey post-hoc test. 2N.C.: No cuantificable. Por otro lado, la aplicación de las mejores condiciones del diseño factorial para la extracción de amidas de las muestras de pimienta, descritas en la sección 3.1, permitió obtener los rendimientos que se resumen en el Cuadro VIII, luego de seguir el procedimiento descrito en la sección 2.2.4 de la metodología. Cuadro VIII. Rendimientos porcentuales obtenidos para la extracción de amidas de P. nigrum. Muestra Masa muestra seca (g) Masa extracto (g) % rendimiento Pnien 10.0000 0.6313 6.31 Pnife 10.0000 0.5137 5.14 Pnidi 9.9999 0.5712 5.71 43 El Cuadro IX resume los contenidos de las principales piperamidas en las muestras. Cuadro IX. Contenido de piperamidas en las muestras de P. nigrum. Valores en mg Piperina Equivalente/100 g muestra seca. Muestra1 Compuesto Pnidi Pnien Pnife Piperilina 79.8 h, i ± 1.0 137.3 e, f ± 4.7 84 g ± 3.4 Piperlonguminina 48 i ± 0.6 80.8 f ± 3.8 70.4 g ± 4.4 Piperanina N.C. 2 116.2 f ± 2.9 72.6 g ± 1.8 Piperina 3 2759 a ± 107 4514 a ± 94 2612 a ± 153 Pellitorina 414.4 c ± 5.2 725 b ± 35 570 c ± 38 Piperetina 178.1 f, g ± 1.9 185.9 e ± 5.9 119.6 f, g ± 2.1 (2E,4E,8E)-Pipera