Estudio de la biocompatibilidad de hidroxiapatita y su posible aplicación como vehículo para sustancias bioactivas

Abstract

Las nanopartículas sintéticas se utilizan en aplicaciones médicas para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de las enfermedades. Algunos de los usos más destacados de estos biomateriales, a través de la nanotecnología, incluyen: el marcaje biológico por fluorescencia, el transporte de genes y de medicamentos, la biodetección de patógenos y la ingeniería de tejidos, entre otros. La hidroxiapatita es un mineral que se describe con la fórmula empírica Ca10(PO4)6(OH)2 la cual se ha convertido en un material con mucho éxito en la investigación biomédica, pues el grado de compatibilidad con las células de los diferentes tejidos estudiados es muy alto y la toxicidad es muy baja. Estas nanopartículas se han utilizado en tratamientos tales como: las prótesis y los rellenos óseos, el recubrimiento de superficies metálicas para los implantes, el refuerzo de materiales compuestos y, recientemente, como vehículo liberador de sustancias bioactivas, entre ellas los fármacos, los péptidos y los ácidos nucleicos. El objetivo de este proyecto de investigación es evaluar la biocompatibilidad de las nanopartículas de la hidroxiapatita sintética con los macrófagos murinos RAW 264.7 por medio de ensayos in vitro, y caracterizar la interacción de este nanomaterial con el ADN para valorar la factibilidad de su empleo como un vehículo molecular. Para su consecución se sintetizaron nanopartículas de hidroxiapatita por un método electroquímico y un método de coprecipitación, se caracterizaron los materiales por medio del análisis de difracción de rayos X y espectroscopia infrarroja, se midió el potencial Z y el tamaño de las partículas en suspensión, se realizaron pruebas de viabilidad celular con el reactivo MTT, se determinó la capacidad máxima adsorbente de la hidroxiapatita con respecto a los plásmidos de ADN a través de isotermas de adsorción y se llevaron a cabo ensayos de transfección celular evaluados por microscopia óptica de fluorescencia y citometría de flujo. Con base en los resultados se demostró que la hidroxiapatita es un material biocompatible con las células RAW 264.7 y que presenta una afinidad por las moléculas de ADN, cuya capacidad máxima adsorbente se determinó en 679 µg/mg. Asimismo, se obtuvo evidencia de que las nanopartículas de hidroxiapatita funcionan como un vector de transfección, lo cual permite emplear este nanomaterial inorgánico como un vehículo para transportar los ácidos nucleicos al interior de las células.Synthetic nanoparticles are used in the field of medicine for the diagnosis, prevention and treatment of disease. Some of the most relevant applications of these biomaterials in nanotechnology include fluorescent tracing, targeted gene transport and drug delivery, the biodetection of pathogens, as well as tissue engineering, among others. Hydroxyapatite is a mineral with empirical formula Ca 10 (PO4 )6 (OH) 2 that has been widely used in the field of biomedical research, given that the level of compatibility with the cells of various tissues has been very high while toxicity is very low. These nanoparticles have found application in several treatments such as: prosthetics and bone grafts, coating of metal surfaces used in manufacturing implants, reinforcement of compound materials and, more recently, as delivery systems for the release of bioactive substances, including drugs, peptides and nucleic acids. The main goal of this project is to evaluate the biocompatibility of synthetic hydroxyapatite nanoparticles with murine macrophages RAW 264.7 through in vitro assays, and to describe the interaction of this nanomaterial with DNA, as well as to assess its applicability for use as a molecular delivery system. For this purpose, hydroxyapatite nanoparticles were synthesized using electrochemical and coprecipitation methods, materials were characterized by means of X-ray diffraction analysis, infrared spectroscopy, Z potential and size of the particles in suspension. Cell viability tests were also conducted using the MTT reagent. The maximum DNA adsorption capacity of hydroxyapatite was determined by measuring adsorption isotherms and cell transfection trials were performed and compared using fluorescence microscopy and flow cytometry. The results show that hydroxyapatite is biocompatible with RAW 264.7 cells and has an affinity to DNA molecules, with a maximum adsorption capacity of 679 μg/mg. Likewise, was shown that hydroxyapatite nanoparticles could work as a transfection vector, which allows using this inorganic nanomaterial to deliver nucleic acids within cells.Le nanoparticelle sintetiche si utilizzano per applicazioni mediche per la diagnostica, la prevenzione ed il trattamento delle patologie. Tra gli usi più importanti di questi biomateriali, per mezzo della nanotecnologia, si trovano: il tracciamento biologico con fluorescenza, il trasporto genetico e dei farmaci, la biodetezione di patogeni e l’ingegneria dei tessuti, tra altri. La idrossiapatite è un minerale avente composizione chimica Ca10 (PO4 ) 6(OH) 2, ed è un materiale che ha riscosso molto successo nell’ambito della ricerca biomedica, dato che il grado di compatibilità con le cellule nei diversi tessuti studiati è molto alto, mentre è molto bassa la tossicità. Sono state utilizzate queste nanoparticelle in trattamenti tali come: le protesi e gli innesti ossei, per ricoprire superfici metalliche per gli impianti, per rafforzare materiali composti e, più recentemente, come agente per liberare sostanze bioattive, come farmaci, peptidi e acidi nucleici. La scopo di questo progetto di ricerca è quello di valutare la biocompatibilità delle nanoparticelle della idrossiapatite sintetica con i macrofagi murini RAW 264.7 per mezzo di test in vitro, e definire l’interazione di questo nanomateriale con il DNA per valutare l’applicabilità del suo utilizzo come un veicolo molecolare. Per questo scopo, sono state sintetizzate nanoparticelle di idrossiapatite usando un metodo elettrochimico ed un metodo di coprecipitazione, ed i materiali sono stati definiti attraverso l’analisi radiografica e spettroscopia infrarossa. È stato misurato il potenziale Z e le dimensioni delle particelle in sospensione, e sono stati realizzati dei test di applicabilità cellulare con il reagente MTT; è stata determinata la capacità massima di adsorbimento dell’idrossiapatite riguardo ai plasmidi del DNA per mezzo di isoterme di adsorbimento, e sono stati realizzati dei test di transfezione cellulare valutati con microscopia ottica di fluorescenza e citometria a flusso. In base ai risultati è stato dimostrato che l’idrossiapatite è un materiale biocompatibile con le cellule RAW 264.7 e che presenta affinità con le molecole del DNA, la cui capacita massima di adsorbimento è stata determinata in 679 μg/mg. Allo stesso tempo, si sono ottenute prove del fatto che le nanoparticelle di idrossiapatite funzionano come vettore di transfezione, e per tanto questo nanomateriale inorganico può essere utilizzato come veicolo per trasportare acidi nucleici all’interno delle cellule.