Establecimiento de las condiciones analíticas de trabajo en metodologías de PCR en tiempo real (QPCR), para la detección de trigo, avena y cebada en alimentos horneados

Abstract

La detección de cereales asociados al gluten en alimentos procesados, particularmente matrices horneadas, puede verse limitada por el procesamiento térmico, los inhibidores y la heterogeneidad de la matriz. En este contexto, la PCR en tiempo real (qPCR) constituye una herramienta complementaria al ELISA para la detección de ADN específico de cereales, aunque no sustituye la estimación de proteína inmunorreactiva. El objetivo fue establecer condiciones analíticas para la detección de trigo, avena y cebada mediante qPCR y evaluar su desempeño en matrices alimentarias procesadas. Se analizaron materias primas, matrices procesadas y galletas experimentales fortificadas con harina de trigo. El ADN se extrajo mediante SureFood® PREP Advanced y se analizó mediante qPCR con sondas TaqMan y SYBR Green, utilizando sistemas específicos para trigo, avena y cebada. La optimización de primers se realizó mediante un diseño factorial 4×4, considerando Ct, frecuencia de detección, curvas de fusión, linealidad, eficiencia y sensibilidad. Las galletas fortificadas se evaluaron mediante qPCR y ELISA. Con TaqMan se analizaron 105 muestras; las matrices de gluten de trigo, avena integral y afrecho mostraron alta concordancia de resultados positivos. Sin embargo, 21 muestras (18,42 %) fueron no válidas debido a la no amplificación del control interno de amplificación (IAC), con el mayor porcentaje en soya (44,4 %), asociado probablemente con interferentes de matriz. Trigo y avena presentaron los Ct más bajos, mientras que las matrices fibrosas, complejas o sometidas a tratamiento térmico presentaron Ct superiores, evidenciando un efecto de la matriz sobre la detectabilidad molecular. En SYBR Green, ASA, Oits y HVH presentaron frecuencias de reacciones no detectables de 43,8 %, 45,8 % y 56,3 %, respectivamente, mientras que TriR3 no presentó pérdida de detección. Se observaron efectos significativos de los primers sobre el desempeño de ASA, TriR3 y Wits. Las Tm fueron 77,90 °C para ASA, 85,86 °C para Oits, 84,39 °C para Wits y 82,65, 82,64 y 82,12 °C para TriR1, TriR3 y HVH, respectivamente. TaqMan presentó pendiente de −3,4333, R² = 0,9824 y eficiencia de 95,5 %, con detección hasta 0,01 %. TriR1 y TriR3 mostraron el mejor desempeño con SYBR Green (R² = 0,9967; E = 94,41 % y R² = 0,9990; E = 96,05 %, respectivamente), con detección hasta 0,001 %. En las galletas fortificadas, qPCR y ELISA mostraron respuestas dependientes de la concentración; qPCR presentó mayor consistencia para detectar trazas de trigo, mientras ELISA aportó información del contenido de proteína, aunque con mayor variabilidad principalmente cerca del límite de detección. La qPCR mostró potencial para la detección de cereales asociados al gluten en alimentos horneados, destacando TriR1 y TriR3 para trigo por su desempeño analítico. Su aplicación requiere validación específica por matriz, control sistemático de inhibición y criterios definidos de aceptación. qPCR y ELISA deben considerarse metodologías complementarias, orientadas a la detección de material genético y a la estimación de proteína inmunorreactiva, respectivamente.