Transfección mediante vehículos génicos basados enhidroxiapatita: eficacia y efectos sobre el tráfico intracelular

Abstract

La hidroxiapatita (HAp), Ca10(PO4)6(OH)2, es un mineral miembro de las apatitas con una razón Ca/P de 1,67. Es el principal componente mineral de los huesos en los vertebrados y posee una serie de características de interés como biocompatibilidad, bioresortividad, afinidad por biomoléculas, alto potencial osteogénico, osteconductividad, osteoinductividad y baja toxicidad. Estas propiedades son ideales para su aplicación en sistemas biológicos. Debido a esto se han estudiado sus aplicaciones como acarreador de biomoléculas (ácidos nucleicos y proteínas). Las nanopartículas de hidroxiapatita sintetizadas por electrólisis poseen ventajas de producción como su versatilidad, rapidez, bajo costo y capacidad de incluir sustancias dopantes, sin alterar significativamente sus propiedades. Mediante este método se han sintetizado nanopartículas capaces de transfectar células y al doparlas con Europio3+ (HAp-Eu), pueden ser utilizadas como sondas fluorescentes. En este trabajo, las nanopartículas de HAp mostraron resultados positivos al ser utilizadas para la transfección de células HEK 293, mientras que en células HeLa y Raw se observan rendimientos moderados. De la misma forma, no se observaron efectos sobre la proliferación de las células HEK 293, Raw 264.7 ni THP-1; sin embargo, en células HeLa si se observó un efecto citostático. Al estudiar la endocitosis por células HeLa se observó una internalización activa de la HAp-Eu. Esta captura fue heterogénea, ya que algunas células solo contenían trazas de las nanopartículas y otras mostraban grandes cúmulos de distribución perinuclear. Además, se observó que existe colocalización de la señal de HAp-Eu con los lisosomas, lo cual siguiere que este material transita por las vías degradativas intracelulares. Adicionalmente, se observó evidencia de que la HAp y HAp-Eu pueden inducir alteraciones del flujo autofágico, siendo este efecto dependiente del linaje celular. Finalmente, se observó que el rendimiento de las transfecciones de fagocitos profesionales (macrófagos Raw 264.7) no era afectado por la activación clásica (M1) con LPS, lo cual apoya la idea de que, en caso de aplicación sistémica a un organismo vivo, la captura de las nanopartículas por fagocitos no impedirá la expresión del material genético exógeno, aún en ambientes inflamatorios. Estos resultados apoyan el potencial para el uso de las nanopartículas como vehículos génicos y sondas fluorescentes, ya que las propiedades químicas y biológicas las hacen compatibles con posibles aplicaciones a nivel clínico.

Hydroxyapatite (HAp), Ca10(PO4)6(OH)2, is a mineral member of the apatites with a Ca/P ratio of 1,67. It is the maincomponent of vertebratebones and possesses a series of interesting properties such as biocompatibility, bioresorption, affinity to biomolecules, high osteogenic potential, osteocondutivity, osteoinductivity and low toxicity. These properties are ideal for its application inbiological systems. Due to this, its applications asabiomolecule carrier (nucleic acids and proteins) have been studied.The hydroxyapatite nanoparticles synthetized by electrolysis present production advantages such as versatility, production speed, low cost and ability to include doping substances without altering its properties. Through this method, transfection capable nanoparticles have been produced and by dopingt hem with Eu3+, they could be used as fluorescent probes.In this work,Hap nanoparticles showed positive results when used to transfect HEK 293 cells, however, when applied to HeLa or THP-1 cells results were modest. Furthermore, no negative effects were observed for the proliferation of HEK 293, Raw 264.7 or THP-1 cells, yet, a cytostatic effect was observed in HeLa cells.The endocytosis studies with Hela cells showed anactive internalization of the Hap-Eu However, the capture was heterogeneous, as some cells showed traces of the nanoparticles while big accumulation of material was seen in the perinuclear cytoplasm in other cells. A colocalization was registered for the Hap-Eu signal and lysosomes, thus suggesting that this material circulates through the intracellular degradative pathways. In addition, we obtained evidence that HAp and Hap-Eucan induce alterations in the autophagic flux although this was specific to each cell line. Finally, the transfection yield for professional phagocytes (Raw 264. 7 macrophages) was not affected by classic activation (M1) with LPS. This supports the hypothesis that in case of systemic application of the nanoparticles,the expression of the transgene will be achieved in phagocytes that captured the material even in an inflammatory environment.These results support the potential for using these nanoparticles as gene carriers and fluorescent probes since the chemical and biological properties of this mineral makes it compatible with possible clinical applications.