Aislamiento y caracterización de elementos genéticos involucrados en la formación de la agalla inducida por el insecto Iatrophobia brasiliensis en plantas de Manihot esculenta (yuca)

Abstract

Las agallas se definen como desviaciones del patrón normal de desarrollo de las plantas, formadas como resultado de una reacción específica a la presencia y actividad de un organismo “foráneo”. Las agallas de plantas inducidas por insectos son tejidos especializados que presentan un arreglo ordenado de diferentes capas de células y un crecimiento predeterminado. En estas estructuras, su tamaño, forma y metabolismo están bajo el control del respectivo insecto inductor. Se han propuesto una serie de hipótesis para tratar de explicar el mecanismo de inducción de las agallas de plantas. La hipótesis más relevante plantea que las agallas son inducidas por la acción de sustancias químicas secretadas por los respectivos insectos inductores, tales sustancias incluirían reguladores de crecimiento vegetal como las auxinas, citoquininas, ácido indolacético u otros tipos de compuestos. Sin embargo, el modo de acción de estas sustancias químicas, los procesos de desarrollo que estas alteran y su mecanismo específico de inducción son aún desconocidos. Para estudiar el mecanismo de inducción, se seleccionó como sistema de estudio la agalla inducida por el insecto Iatrophobia brasiliensis (Diptera: Cecidomyiidae) en plantas de la especie Manihot esculenta Crantz (yuca). En esta tesis, se proponen varios enfoques experimentales para estudiar el proceso de inducción y formación de las agallas de insectos. El planteamiento del problema y las hipótesis principales se abordan en tres artículos científicos con el respaldo de una amplia revisión crítica de literatura, misma que a su vez, respalda el diseño experimental y el enfoque metodológico empleado. Este planteamiento constituye la base del primer artículo, del cual se derivan además una serie de predicciones que se describen a partir de los resultados obtenidos en los dos artículos publicados posteriormente. En el segundo artículo, se describe el registro e inventario de morfotipos de agallas realizado en el Área de Conservación Guanacaste, material genético que sirvió de base para analizar, en esos morfotipos de agallas, la presencia y secuencia de bases del posible marcador identificado y caracterizado inicialmente en la agalla de yuca. Luego, en el tercer artículo, marcadores moleculares basados en la reacción en cadena de la polimerasa y datos provenientes de secuenciación genómica profunda fueron utilizados para identificar posibles elementos genéticos involucrados en la formación de la agalla de yuca. Además, se evaluó la hipótesis de que las células de la agalla están transformadas genéticamente y se analizó el microbioma de las agallas y del tejido sano circundante. Se aplicó un análisis discriminante de secuencias para excluir selectivamente entre el ADN exógeno y el genoma de referencia de la planta huésped. A partir de este enfoque experimental, se identificaron varias secuencias candidatas de inserción asociadas con secuencias conocidas de genes bacterianos, siendo las más relevantes las relacionadas con el factor regulador de la transcripción CadR, la ATPasa transportadora de cadmio, codificada por el gen cadA, una proteína permeasa involucrada en el transporte de nitrato (gen nrtB) y la enzima ATPasa arsénica (gen arsA). Además, se caracterizó un fragmento de ADN específico de agallas que podría constituir un elemento genético accesorio involucrado en el mecanismo de inducción, el cual mostró homología parcial con la enzima conjugadora de ubiquitina E2 Q2 del hongo Fulvia fulva. Finalmente, el tercer artículo proporciona también evidencias relacionadas con la modificación del microbioma endofítico, resultados que conjuntamente con la transformación genética de las células vegetales en M. esculenta, se hipotetiza constituyen dos requisitos esenciales para la formación de las agallas en las plantas de yuca. Adicionalmente, se obtuvo experimentalmente una estructura inicial similar a una agalla en los tejidos cultivados in vitro de M. esculenta que fueron inoculados utilizando una cepa bacteriana del género Rhodococcus, aislada a partir del insecto inductor y que se plantea podría estar relacionada con el proceso de inducción de la agalla. En conclusión, los resultados obtenidos en esta investigación aportan evidencias en relación con la transformación genética de las células que conforman el tejido de la agalla inducida en plantas de yuca. Considerando la evidencia aportada en relación con la presencia del posible marcador molecular (gen de ubiquitina) en diferentes morfotipos de agallas inducidas en otras especies de plantas, la transformación genética de las células de la agalla podría ser parte de un mecanismo de inducción de este tipo de estructuras ampliamente distribuido en la naturaleza.Galls are defined as modifications of the normal developmental design of plants, produced by a specific reaction to the presence and activity of a foreign organism. Insect- induced plant galls are specialised plant tissues with an organised arrangement of cells and predetermined growth. The size, structure, and metabolism of galls are under the control of gall-forming insects and host plant species. The most general hypothesis suggests that gall formation is triggered by the action of chemical substances secreted by the gall inducer, including plant growth regulators such as auxins, cytokinins, indole-3- acetic acid (IAA), and other types of compounds. However, the mode of action of these chemical substances and the general mechanism by which the insect could control and manipulate plant development and physiology is still not known. To study the induction mechanism of insect galls, we selected the gall induced by Iatrophobia brasiliensis (Diptera: Cecidomyiidae) in cassava (Euphorbiaceae: Manihot esculenta Crantz) as our model. In this thesis, different experimental approaches are proposed to study the process of induction and formation of insect galls. The problem statement and main hypotheses are addressed in three scientific articles supported by an extensive critical literature review, which supports the experimental design and methodological approach used. This approach constitutes the basis of the first article, from which some predictions are described in the two articles published subsequently. In the second article, the registry and inventory of gall morphotypes carried out in the Guanacaste Conservation Area are described. This genetic material is used to detect and analyze the potential DNA sequence from the cassava gall marker characterized in the third article. Also, in this third publication, molecular markers and deep metagenomic sequencing data were employed to analyse the gall microbiome and to test the hypothesis that gall cells are genetically transformed by insect vectored bacteria. A shotgun sequencing discrimination approach was implemented to selectively discriminate between foreign DNA and the reference host plant genome. Several known candidate insertion sequences were identified, the most significant being DNA sequences found in bacterial genes related to the transcription regulatory factor CadR, cadmium-transporting ATPase encoded by the cadA gene, nitrate transport permease protein (nrtB gene), and arsenical pump ATPase (arsA gene). In addition, a DNA fragment associated with ubiquitin-like gene E2 was identified as a potential accessory genetic element involved in gall induction mechanism in the fungus Fulvia fulva. Finally, in the third article, evidence supporting that the modification of the endophytic microbiome and the genetic transformation of plant cells in M. esculenta are two essential requirements for insect-induced gall formation is provided. An initial gall- like structure was experimentally obtained in M. esculenta cultured tissues through inoculation assays using a Rhodococcus bacterial strain that originated from the inducing insect, which we related to the gall induction process. Results provide evidence suggesting an insect-induced gall formation mechanism mediated by genetic transformation events in Cassava plants. Based on these findings and having observed the same potential DNA marker in galls from other plant species (ubiquitin-like gene E2), bacterially mediated genetic transformation of plant cells may represent a more widespread gall induction mechanism found in nature.