Desarrollo de un sistema de modificación genética en caoba (Swietenia macrophylla King) mediante la evaluación de la expresión transitoria y estable del gen reportero GUS

Abstract

La caoba (Swietenia macrophylla King) (Meliaceae) es una especie forestal muy valiosa y comercializada a nivel mundial, pero su sobreexplotación ocasionó que se convirtiera en una especie amenazada (Apéndice II, CITES). El barrenador de las meliáceas (H. grandella) ocasiona grandes daños, baja producción y muerte en las plantas jóvenes. La modificación genética con genes de resistencia al ataque de insectos es una posible alternativa para controlar dicha plaga, pero actualmente no hay protocolos de modificación genética en especies del género Swietenia, por lo que este proyecto tuvo como objetivo establecer un método simple y eficiente de modificación genética en caoba mediante la evaluación de la expresión transitoria y estable del gen GUS (uidA) tras su transformación con Rhizobium radiobacter. Primero se generaron las condiciones necesarias para el cultivo in vitro de caoba por medio de embriogénesis somática indirecta a partir de cotiledones inmaduros durante 44 semanas, y para su selección con higromicina B, obteniendo una inhibición de la sobrevivencia en un 97% con 100 mg/L tras 4 semanas. También se estableció el nivel de pH adecuado para la prueba GUS, logrando evitar tinciones no deseadas en explantes sin transformar con pH=13. Luego se desarrolló un protocolo de modificación genética por R. radiobacter evaluando distintos parámetros y se determinó que los más adecuados con base en la expresión transitoria del gen reportero GUS (uidA) fueron: la cepa LBA4404, la DO600 = 1.00, la temperatura de incubación de 28 °C, el uso de 0.0075% de Silwet L-77 en el medio de cocultivo líquido y la aplicación de 15 min de vacío antes de la agitación. El protocolo optimizado se utilizó para la transformación de cotiledones de caoba, se hizo nuevamente la prueba GUS a los 4 y 30 días, se extrajo ADN de las muestras tras 30 días de la inoculación y se analizó por PCR la integración estable de uidA y de hptII en los mismos. A pesar de observar expresión transitoria de uidA a los cuatro (44.8%) y 30 (32.6%) días, no se logró comprobar la integración estable de uidA ni hptII en el genoma de caoba, pero este es el primer trabajo de este tipo realizado a nivel del género Swietenia, y a partir de este se puede mejorar aún más el sistema de transformación para obtener una mayor eficiencia.