Desarrollo de un sistema de edición genética CRISPR/CAS9 in planta en embriones maduros de arroz (Oryza Sativa L.) mediante Agrobacterium Tumefaciens

Abstract

El arroz es uno de los cultivos más importantes, es el principal alimento de más de la mitad de la población. La estabilidad en la producción de arroz es crucial para la seguridad alimentaria, sin embargo, como en todo cultivo la producción se ve afectada por factores de estrés bióticos y abióticos. Entre ellos la sequía y salinidad se consideran como los que más afectan el rendimiento en la producción de cultivos. Los programas de mejoramiento genético y grupos de investigación tienen como objetivo final, generar cultivos con mayor eficiencia de producción, mayor resistencia a estrés bióticos y abiótico, con mejoras nutricionales, y todo ocupando menor espacio de cultivo. Las herramientas de mejoramiento genético modernas como la edición de genomas mediante CRISPR/Cas9 son esenciales para cumplir con dichos objetivos. El uso de CRISPR/Cas9 requiere de la entrega de sus componentes al interior de la célula vegetal, la metodología más comúnmente utilizada es la transformación genética mediante Agrobacterium tumefaciens y la regeneración de plantas editadas mediante cultivo in vitro de tejidos. La transformación genética de plantas es por sí misma una herramienta importante en el mejoramiento genético de cultivos. El establecimiento de metodologías de cultivo in vitro de tejidos se ha identificado como una limitante y cuello de botella en el progreso de las tecnologías de transformación genética y de edición de genomas mediante CRISPR/Cas9. El objetivo principal de esta investigación fue la optimización de metodologías de transformación in planta, que sobrepasan las limitaciones del cultivo in vitro de tejidos, y facilitar la entrega de los componentes CRISPR/Cas9 para la edición de genomas de arroz. Se optimizó un protocolo altamente eficiente, rápido y fácil para la transformación genética in planta en embriones maduros de arroz. Se evaluaron los factores involucrados en la eficiencia de la transferencia de los vectores de expresión al interior de las células vegetales como: cepa de Agrobacterium tumefaciens, condiciones de co-cultivo, tiempo de co-cultivo, concentración de acetosiringona y densidad óptica de la solución de Agrobacterium. Se realizó una comparación de la metodología in planta desarrollado con la metodología tradicional de transformación in vitro de callos embriogénicos de arroz. El método in planta es más rápido, menos costoso y más eficiente que el método in vitro. Finalmente se realizó la edición genética mediante CRISPR/Cas9 en arroz utilizando la metodología de transformación optimizada. Se confirmó la edición del gen de la trehalosa (OsTRE) en arroz con un porcentaje de eficiencia del 23,5%. La mutación obtenida mediante CRISPR/Cas9 en una de las líneas desarrolladas (C720-34) genera un cambio importante en la proteína, se da un cambio en el marco abierto de lectura que cambia secuencia de aminoácidos traducida, Se predice la traducción de una proteína trehalasa más corta y la pérdida del sitio activo, una región altamente conservada donde ocurre la hidrólisis del disacárido trehalosa en dos moléculas de glucosa. La ruta de biosíntesis de la trehalosa tiene un rol fundamental en procesos biológicos de las plantas. Se ha demostrado que la acumulación del azúcar trehalosa confiere a las plantas mayor resistencia a estrés abiótico por sequía, salinidad y bajas temperatura. Se propone utilizar esta estrategia de edición genética CRISPR/Cas9 in planta en el estudio de genes y generación de líneas de arroz con características de importancia agrícola y económica.